Da der mikrovaskuläre Fluss zwischen Kapillaren und Veränderungen im Sekundenverlauf variiert, ist eine Methode zur kontinuierlichen Quantifizierung des Durchflusses über ganze Felder erforderlich. Das Personal ermöglicht eine nahezu kontinuierliche Messung der Strömungsgeschwindigkeiten über ganze Mikroskopfelder hinweg innerhalb von Stunden, die sonst Monate in Anspruch nehmen würden, um manuell zu erhalten. Obwohl diese Verfahren einfach sind, wird die visuelle Demonstration neuen Benutzern erheblich helfen, zum ersten Mal mit Dempersonal zu navigieren.
Um TrakEM2 zum Definieren des Gefäßnetzwerks zu verwenden, wählen Sie zuerst Datei, Neu und TrakEM2 Leer aus, um ein neues leeres TrakEM2-Projekt einzurichten, und wählen Sie den neuen Ordner mit dem einzelnen Bild aus dem Film als Projektordner aus. Die TrakEM2-Fenster werden geöffnet. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den Hauptarbeitsbereich, und wählen Sie Bild importieren und importieren aus.
Navigieren Sie zum einzelnen gespeicherten Bild, und wählen Sie das Bild aus. Klicken Sie erneut mit der rechten Maustaste in den Hauptarbeitsbereich, und wählen Sie Anzeigen und automatische Größenänderung von Canvas/LayerSet aus. Klicken Sie dann mit der linken Maustaste in das Hauptarbeitsfenster.
Das Bild füllt den Arbeitsbereich. Um die Bereiche im Bild auszuwählen, die das Gefäßnetzwerk enthalten, klicken Sie im kleineren TrakEM2-Fenster mit der rechten Maustaste auf die Vorlage Alles, und wählen Sie Neue untergeordnete und Flächenliste hinzufügen aus. Ziehen Sie im kleineren TrakEM2-Fenster die Vorlage Anything auf Project Objects, ein unbenanntes Projekt.
Ziehen Sie dann die Vorlage Alles, Flächenliste, auf Projektobjekte, unbenannte Projekte, Alles. Unter Projektobjekte, unbenanntes Projekt, wird die Liste "Alles" jetzt vorhanden sein. Im Hauptfenster TrakEM2 unter der Registerkarte Z-Raum wurde eine Leiste mit der Bezeichnung Bereichsliste erstellt.
Klicken Sie hier, um die Liste auszuwählen. Wählen Sie im Hauptfenster TrakEM2 das Pinselwerkzeug aus, und klicken Sie beim Rollen des Mausrads auf Umschalttaste, um eine Pinselgröße auszuwählen, die kleiner als der Durchmesser der interessend wichtigen Vaskulatur ist. Drücken Sie Control S, um das Projekt zu speichern.
Malen Sie mit dem Pinselwerkzeug das Gefäßnetzwerk, ohne Fokusbereiche. Wenn die Beschriftung abgeschlossen ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste in das TrakEM2-Hauptfenster, und wählen Sie Export- und Flächenlisten als Beschriftungen aus. Wählen Sie im Popupfenster Scale, 100% aus, und exportieren Sie die gesamte Flächenliste.
Schließen Sie die TrakEM2-Fenster, und wählen Sie Ja aus, um das Projekt zu speichern. Das Bild der Flächenliste wird geöffnet und kann als leeres, schwarzes Bild angezeigt werden. Wählen Sie im Hauptmenü Fidschi Bild, Anpassen und Helligkeit/Kontrast aus.
Klicken Sie im Fenster Helligkeit und Kontrast auf Automatisch, und die Flächenliste wird sichtbar. Wählen Sie im Fidschi-Hauptmenü Bild, Nachschlagen und Nachschlagen von Tabellen umkehren aus. Speichern Sie dieses Bild mit schwarzen Beschriftungen auf weißem Hintergrund als t-i-f-Datei, und schließen Sie das Bild.
Öffnen Sie die Labels-Datei in Fidschi, und wählen Sie Plugins, Skelett und Skelettaugen aus. Speichern Sie dann das Skelett-Augen-Bild als t-i-f-Datei. Um ein neues Mitarbeiterprojekt zu erstellen, wählen Sie Plugins, Makros und Projekt öffnen/erstellen aus, und folgen Sie den Anweisungen zum Erstellen oder Aktualisieren einer Konfigurationsdatei.
Navigieren Sie im Menü Projekt öffnen/erstellen zum Projektverzeichnis-Eingabedateiordner und den Dateien Input Movie und Skeleton. Geben Sie die Werte für die maximale gemessene Geschwindigkeit, die maximal zugeordnete Geschwindigkeit, die minimale Segmentlänge, die Pixelgröße und die Bildrate ein. Aktivieren Sie das Flicker-Korrekturfeld, wenn die Bilder periodisch Hintergrundintensität flackern und klicken Sie auf OK. Passen Sie die Parameter für die beste Visualisierung der Daten an.
Legen Sie die maximal zugeordnete Geschwindigkeit auf etwa 95 Prozent der Daten fest, sodass die Daten über den gesamten Bereich der Farbskala abgebildet werden. Um das Skelett zu analysieren, wählen Sie Plugins, Makros und Skelett analysieren aus. Die Skelettdatei wird geöffnet und der Manager "Region of Interest" wird geöffnet und ausgeführt.
Klicken Sie im Manager Region of Interest auf Alle anzeigen und Beschriften, und klicken Sie auf OK. Um die Zeitintervalle auszuwählen, wählen Sie Plugins, Makros und Zeitintervalle bearbeiten aus, und warten Sie, bis das Makro einen Kymographen aus einem einzelnen Segment über die Gesamtzeit für den Film generiert. Verwenden Sie die Steuerelement-Plus- und Minustasten, um die Größe des Kymographen nach Bedarf zu erhöhen, und verwenden Sie das Auswahlwerkzeug Rechteck, um ein Rechteck um jedes Zeitintervall zu zeichnen. Drücken Sie die T-Taste oder klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen, um eine Zeitintervallauswahl aufzuzeichnen, und wiederholen Sie die Auswahl für beliebig viele Zeitintervalle.
Um die Parameterauswahl auszuwerten, wählen Sie drei bis vier Zeitintervalle aus, und schließen Sie die Analyse nur für diese Intervalle ab. Klicken Sie auf OK, wenn die Zeitintervallauswahl abgeschlossen wurde. Ein Popupfenster wird angezeigt, wenn die ausgewählten Intervalle im Projektordner gespeichert wurden.
Klicken Sie auf OK. Um den Flow zu analysieren, wählen Sie Plugins, Makros und Flow analysieren aus. Das Dialogfeld Flow-Parameter analysieren öffnet und zeigt die im Schritt Projekt öffnen/Erstellen eingegebenen Werte an. Bearbeiten Sie diese Werte bei Bedarf, und klicken Sie auf OK. Das Dialogfeld Dateinamen ausgeben wird geöffnet und zeigt die Namen an, die im Schritt Projekt öffnen/erstellen eingegeben wurden.
Bearbeiten Sie diese Namen nach Bedarf, und klicken Sie auf OK, um mit der Flussanalyse zu beginnen. Wenn ein Dialogfeld angezeigt wird, das angibt, dass der Flow analysiert wurde, klicken Sie auf OK, um die Analyseergebnisse in CSV-Tabellendateien zu speichern. Um räumliche Karten zu erstellen, wählen Sie Plugins, Makros und Räumliche Karte erzeugen aus.
Das Fenster Räumliche Kartenparameter wird geöffnet, in dem die im Schritt "Projekt öffnen/erstellen" eingegebenen Werte angezeigt werden. Bearbeiten Sie diese Werte nach Bedarf, und klicken Sie auf OK. Eine zeitliche Sequenz von räumlichen Karten von Strömungsgeschwindigkeiten wird mit jeder Farbe generiert, die eine Strömungsgeschwindigkeit angibt. Führen Sie einen Bildlauf durch den generierten Stapel von einem Bild pro Intervall durch, um die räumlichen und zeitlichen Variationen im Flow zu visualisieren und den Stapel als a-v-i-Datei zu speichern, um die Datei als Film freizugeben.
Die Personalanalyse erzeugt die vollständige Zählung der mikrovaskulären Geschwindigkeiten über ganze Mikroskopfelder hinweg über Zeiträume von Sekunden bis Minuten. Beispielsweise wurde das erzeugte skelettierte Bild anhand eines einzelnen Bildes in dieser Zeitreihe des mikrovaskulären Netzwerks in der Leber einer Maus verwendet, um die Achse des mikrovaskulären Flusses zu definieren, so dass der Mitarbeiter eine Karte einzelner Gefäßsegmente für die nachfolgende Flussquantifizierung identifizieren konnte. Aus den einzelnen Gefäßsegmenten, die aus dem skelettierten Bild generiert werden, können Kymographen erzeugt werden, die die Intensität entlang jedes Liniensegments im Laufe der Zeit darstellen.
Die Zeitintervalle Skelett und Benutzerversorgung können verwendet werden, um den Kymographen jedes Segments in einzelne Segmentzeitintervalle aufzuteilen. Der Stab identifiziert dann den vorherrschenden Winkel im Kymographen aus jedem Segmentzeitintervall und liefert die berechneten Geschwindigkeitsmessungen als CSV-Datendateien. Die CSV-Ausgabe des Personals kann verwendet werden, um die Gesamtgeschwindigkeitsverteilung zu analysieren, um die Darstellung der Geschwindigkeit in den einzelnen Gefäßsegmenten im Laufe der Zeit zu ermöglichen.
Und kann als Stapel von farbcodierten Geschwindigkeitskartenbildern visualisiert werden. Beachten Sie, dass die Ergebnisse des Personals von der Qualität der Bildserie in Bezug auf die Probenstabilität, die Bildrate, die Auflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis abhängen. Die Staff Velocity Map-Ausgänge ermöglichen eine intuitive Untersuchung der räumlichen Strömungsmusterung, während Die CSV-Ausgänge des Personals die statistische Analyse von Strömungsgeschwindigkeiten sowohl innerhalb als auch zwischen Behandlungsgruppen ermöglichen.
