Un ringraziamento particolare al Dr. Chiara M. Waterman per tutoraggio e le discussioni, Michelle Baird e Mike Davidson per fornire molti dei costrutti cDNA fluorescenti utilizzati in questi studi, e Kathryn Applegate e Gaudenz Danuser per lo sviluppo di software per l&#39;analisi plusTipTracker MT. Questo lavoro è stato sostenuto, in parte, da una sovvenzione di KAM dal National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) e il National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

The authors declare that they have no competing financial interests.

Utilizzando HUVECs nella morfologia e migrazione esperimenti. live-cell imaging di dinamiche di crescita MT Eb3 marcato all&#39;interno HUVECs richiede condizioni di coltura delle cellule appropriate e riproducibili, al fine di misurare e valutare i cambiamenti nella crescita MT e HUVEC morfologia, tali da poter poi essere assegnati a uno spunto di segnalazione ECM. HUVECs rappresentano un ottimo modello per studiare la forma delle cellule e la motilità. Essi sono altamente suscettibili di trasfezione con cDNA fluorescenza marcata, essi mostrano morfologie drammatiche in risposta ad entrambi i segnali di segnalazione solubili e fisiche, e mantengono la capacità di organizzarsi in tubi vascolari quando fornito appropriate condizioni di coltura delle cellule 65-70. colture cellulari primarie, come HUVECs, richiedono attenta gestione e il monitoraggio del numero di passaggio di cellule al fine di garantire le cellule sono in buona salute e che si comporteranno normalmente durante la sperimentazione. Ad esempio, quando condurre esperimenti che indagano sul cytoskeleton e / o morfologia delle cellule, HUVECs non devono essere utilizzati per gli esperimenti oltre il decimo passaggio coltura cellulare, come HUVECs tipicamente iniziano a visualizzare morfologie non uniformi in tutto il passaggio dodici a quindici. densità delle cellule è anche un regolatore di salute critiche HUVEC e la proliferazione. HUVEC indagini ramificazione (vedi protocollo 10,1-10,4, sopra) utilizzano colture relativamente bassa densità cellulare in modo da fornire le cellule spazio fisico di interagire con l&#39;ECM ed estendere sporgenze ramificate. Al contrario, negli studi di migrazione ferita-edge (vedi protocollo 10,5-10,8), HUVECs sono cultura in un monostrato prima di ferimento. Come tale, HUVECs ferita-bordo mostrano una morfologia relativamente non-ramificato, estendere leader sporgenze bordo, ed esibire interazioni cellula-cellula con i loro vicini immediati quando migrano nella ferita. Avvertimenti e vantaggi di monitoraggio MT Dynamics in Living HUVECs. Spinning microscopia disco è un ottimo approccio perverificare ipotesi sperimentali che richiedono chiarezza di immagine confocale ad alta risoluzione temporale. Con il modulo telecamera e laser caso, questo approccio la microscopia è sensibile alle basse emissioni e di fluorescenza può aiutare a ridurre photobleaching rispetto ad altri tipi di microscopia a fluorescenza. È importante sottolineare che questo approccio è anche adatto per moderata a imaging ad alta risoluzione temporale come è richiesto per generare misurazioni complete della dinamica di crescita MT utilizzando l&#39;approccio di etichettatura EB3, in una varietà di tipi cellulari. Mentre la metodologia EB3 di etichettatura crescente MT plus-estremità presenta evidenti vantaggi rispetto ad altri metodi di etichettatura fluorescente MT, ha anche degli svantaggi unici. Ad esempio, vi è una percentuale della matrice MT che non cresce attivamente in un dato momento, comprendente sia la popolazione di MTS smontaggio e la popolazione di stabili, MTS non dinamici 71-74. EB3 non etichettare queste due popolazioni di MTS equindi il contributo di queste due popolazioni non sarebbe incluso nell&#39;analisi dei dati sperimentali. metodologie alternative per la valutazione l&#39;intero array MT si sono concentrati sulla espressione di tubulina fluorescenza marcata, che incorpora in tutte le popolazioni di MTS e consente l&#39;identificazione di crescere, restringimento e stabile MTS. Tuttavia, a causa della relativamente alta densità della matrice MT vicino al centro della cella e adiacente al microtubulo organizzare centrale (MTOC), etichettare l&#39;intero array MT crea uno svantaggio per eseguire l&#39;analisi di immagine di estremità MT che non sono vicino alla cella periferia 75-77. Gli esperimenti che utilizzano due colori di co-etichettatura di MTS con tubulina fluorescenti e EB3 fluorescente in cellule vive hanno rivelato, qualitativamente, che la stragrande maggioranza di MTS tubulina marcato sono anche EB3 marcato 78. Inoltre, non vi è stato un metodo efficiente di inseguimento automatico di MTS etichettati con tubulina fluorescente. Ciò significa che i dati Raccoltezione e le misure di dinamica MT in cellule che esprimono tubulina fluorescenti richiedono monitoraggio mano di singoli MT, un processo che è soggetto a errori e noioso. Di conseguenza, l&#39;analisi automatizzata computazionale di Eb3 marcato MTS è diventato il metodo preferito per la misura dinamica MT quanto può essere applicato a MT dinamica esperimenti in numerosi tipi di cellule e all&#39;interno di una varietà di regimi sperimentali 35,79. Collegamento MT dinamiche di crescita di HUVEC Morfologia e migrazione. Dal punto di vista di un investigatore del citoscheletro, un adattamento estremamente utile del plusTipTracker automatizzato di analisi di monitoraggio è la capacità di misurare e valutare entrambe le alterazioni cellulari e regionali interi nelle dinamiche di crescita MT. Il requisito per una cella di diventare polarizzata è un pre-requisito essenziale per la migrazione delle cellule direzionale. Come tale, stecche di segnalazione polarizzati sono da tempo noti come fattori di guida fondamentali per la migrazione delle cellule direzionale 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. Ad esempio, molecole di segnalazione solubili, come il VEGF induce polimerizzazione e la crescita MT verso lo spunto VEGF in tipi di cellule endoteliali 2,82-87. Inoltre, in risposta alle interazioni fisiche con l&#39;ECM (per esempio, il rispetto e la dimensionalità mechanosensing), HUVECs modulano le loro dinamiche MT dal livello locale regolando Maps per promuovere la crescita MT all&#39;interno allungamento sporgenze ramificati, e questo serve a guidare la migrazione HUVEC nella direzione della spunto 5,31,88. Così, la polarizzazione in risposta a segnali di segnalazione extracellulari mette in evidenza la necessità di una valutazione sperimentale delle variazioni localizzate nelle dinamiche del citoscheletro. live-cell imaging simultaneo della dinamica MT crescita (utilizzando l&#39;approccio EB3) e la migrazione delle cellule HUVEC è estremamente difficile da eseguire a causa MT crescono su una scala temporale di secondi, mentre le variazioni nella morfologia cellulare e la migrazione direzionale si verificano su una scala temporale di ore. Eppure entrambi i processi sono intimamente linked. Inoltre, continua, rapida imaging EB3 fluorescenza marcata sulla seconda scala temporale conduce photobleaching del segnale EB3. Tentativi di superare questo problema conducendo breve serie di immagini di EB3 (serie acquisizione 1-2 min) ogni 30 minuti hanno avuto successo, ma potrebbe essere realizzato solo in un piccolo numero di cellule endoteliali che aveva l&#39;espressione ottimale di EB3 e che non visualizzava negativo effetti alle illuminazione laser ripetuto 5. Un approccio alternativo che permette di interpretazioni di come le dinamiche di crescita MT contribuiscono ai cambiamenti nella morfologia cellulare e la migrazione è la Regione plusTipTracker di interesse (ROI) strumento 35 (vedi protocollo 6.6). Questa metodologia permette di tutta la crescita delle cellule MT tracce per essere suddivisa in regioni definite dall&#39;utente, da cui le tracce di crescita MT possono essere estratti e analizzati. Ad esempio, i confronti di &quot;ramificata&quot; contro &quot;non ramificati&quot; regioni della cellula hanno rivelato che MT crescono più sumile e più persistente all&#39;interno delle regioni ramificati rispetto alla non-ramificato periferia cellulare 5. In polarizzata ferita-edge HUVECs, confronti dei principali bordo e finali dinamiche di crescita bordo MT rivelato che MCAK indotta MT smontaggio è inibita in particolare all&#39;interno del bordo d&#39;attacco, ma non il bordo d&#39;uscita. la valutazione regionale di iniziali e finali dinamiche di crescita bordo MT in HUVECs esprimono Rac1 e / o mutanti di fosforilazione di MCAK inoltre rivelato che l&#39;attivazione Rac1-indotta di Aurora-A-chinasi specifica e localmente inibisce l&#39;attività MCAK all&#39;interno del bordo d&#39;attacco di guidare HUVEC polarizzazione e la migrazione direzionale 31. Pertanto, la combinazione di automatizzato di monitoraggio delle dinamiche di crescita MT e la valutazione regionale della dinamica di crescita MT all&#39;interno delle sporgenze ramificati e / o il bordo della ferita-edge HUVECs ci ha permesso di collegare dinamiche di crescita MT a HUVEC morfologia e la migrazione. I protocolli descritti sono designed per fornire una metodologia di solito, semplice e altamente ripetibile per la cultura HUVEC e indagine sperimentale. Tuttavia, molti dei dettagli del protocollo sono complesse e richiedono tempo, che, a sua volta, fornisce possibilità di errori o difficoltà nella conduzione della metodologia sperimentale. Mentre si è cercato di affrontare i problemi potenziali in tutto il protocollo, qui viene fornito ulteriori, la risoluzione dei problemi dettagliata dei potenziali problemi che sono meno comuni o in altro modo abbreviato come note all&#39;interno dei protocolli di metodologia. Relativi a lamelle di rivestimento con i substrati di poliacrilammide (protocollo 2.2), un problema comune che si pone è la natura complessa di attivare vetrino, accoppiando poliacrilammide al vetro, attivando poliacrilammide, e quindi l&#39;accoppiamento ECM alla poliacrilammide. Uno particolarmente difficile e potenzialmente problematico passo è la coltura HUVECs sul gel fibronectina / poliacrilammide in seguito all&#39;esposizione del Polyacoprioggetto crylamide rivestite a 2 mm solfo-SANPAH (step 2.2.2.6, sopra). E &#39;fondamentale per il successo della coltura HUVECs su questi substrati che solfo-SANPAH essere completamente rimosso dal sistema sperimentale seguente ECM coniugazione. Questo può essere meglio raggiunto mediante lavaggio con DDH 2 O e incubando i coprioggetti in DDH 2 O su un agitatore durante la notte. Se le cellule in coltura sulle ECM poliacrilammide non sopravvivono, o se la vitalità è inferiore al previsto, è aumentata e ha ripetuto il lavaggio di solfo-SANPAH dopo coniugazione di fibronectina (passo 2.2.2.9) si raccomanda di potenzialmente alleviare questo problema. Correlate al protocollo 3 (cDNA trasfezione e cultura HUVEC su un vetrino), una grande influenza per il successo della procedura di elettroporazione è la gestione delle HUVEC sia durante tripsinizzazione delle cellule per rimuoverli dal recipiente di plastica, e dopo la conclusione di l&#39;elettroporazione (passi 3.3-3.4, sopra). E &#39;fondamentale per la curapienamente monitorare il HUVECs mentre in tripsina, e non superare il tempo necessario per le celle a &quot;round-up&quot; sulla superficie del pallone (tipicamente 1-2 min). tempo eccessivo in tripsina è una delle principali cause di HUVEC morte, che non è in genere realizzato fino a quando le cellule sono placcati su vetrini fibronectina rivestite (punto 3.4) e quindi non riescono a collegare al substrato. Altrettanto importante, HUVECs (e la maggior parte dei tipi di cellule primarie) non se la passano bene quando sospeso per lunghi tempi nel buffer elettroporazione. Durante gli esperimenti larga scala, per esempio, in cui l&#39;utente ha cinque o più condizioni che richiedono elettroporazione, è meglio mantenere le cellule pellet in singoli tubi (1 tubo per trasfezione) e mescolarli, one-at-a-time , nel buffer elettroporazione immediatamente prima elettroporazione. Questo approccio riduce al minimo il tempo di incubazione in tampone elettroporazione e massimizzare la sopravvivenza HUVEC. Inoltre, il salvataggio immediato in terreni di coltura completo è anche critical dopo l&#39;elettroporazione. ritardi di salvataggio di un minuto o più dopo l&#39;elettroporazione può provocare vicino alla morte completa HUVEC e, quindi, dovrebbe essere evitato. Correlate assay migrazione cellulare (protocollo 9), la tecnica di coltura HUVECs ad altissima densità dipende da una modifica critica (descritto nel passaggio 9.2) della metodologia coltura cellulare tradizionale HUVEC (descritto nel protocollo 3) che richiede essiccazione della rivestito fibronectina coprioggetto al fine di consentire la cultura HUVEC in un&#39;area molto piccola del coprioggetto. Spesso, se il vetrino non è completamente asciugato o se la prima rivestimento del vetrino con fibronectina (i punti 2.1 o 2.2) non era efficiente, le cellule multimediali contenenti che è posto sul vetrino perderà la sua tensione superficiale ed espandere la bordi del vetrino, riducendo la densità delle cellule sul vetrino. Un metodo per risolvere questo potenziale problema è quello di aspirare il contenuto del vetrino e poiposizionare il coprioggetto (ancora nel suo piatto 35 mm) nella parte posteriore del cabinet biosicurezza per 5-10 min. Questo adattamento può aiutare a permettere il flusso d&#39;aria all&#39;interno dell&#39;armadio per assistere essiccazione del piatto. Se qualsiasi liquido visibile rimane sul vetrino dopo l&#39;asciugatura all&#39;aria, aspirare le macchie di liquido e di nuovo lasciare asciugare all&#39;aria per 5-10 minuti supplementari nell&#39;armadio biosicurezza. È importante notare che non vi è alcun modo per evitare completamente questo potenziale problema, ma non diventa un problema minore con pratica ripetuta del protocollo. E &#39;anche una raccomandazione guasti che quando si prepara lamelle per il saggio migrazione cellulare (o qualsiasi test, in generale), per preparare coprioggetto supplementari e hanno HUVECs supplementari ready-to-go in caso di problemi lungo la strada. Con queste considerazioni la risoluzione dei problemi in mente, è anche importante sottolineare l&#39;utilità dei protocolli discussi e le loro implicazioni in futuro la ricerca biologia cellulare. L&#39;applicabilità alla polyacrapproccio ylamide è ampia, e comprende non solo gli studi bidimensionali di impegno cellula-ECM (sopra descritta), ma anche le indagini tridimensionali 5. Questa applicazione è fondamentale per aumentare la nostra comprensione di come HUVECs regolano la forma delle cellule e la migrazione in ambienti fisiologici e dovrebbe fornire gli investigatori una conoscenza di base di come i cambiamenti morfologici sono coordinati con i cambiamenti del citoscheletro. Mentre i protocolli descritti qui si concentrano su misure della dinamica di crescita MT, la maggior parte dei protocolli può e deve essere adattato a misurare qualsiasi numero di altri aspetti microscopicamente misurabili di interazioni cellula-ECM. Per quanto riguarda la dinamica MT, ci sono numerose mappe, di cui almeno 14 famiglie di kinesins 89, ciascuno con un ruolo potenziale nel contribuire alla HUVEC polarità e la migrazione diretta, e ognuno dei quali può essere studiati utilizzando i protocolli presentati. Future indagini dovrebbe unLSO essere mirati al coinvolgimento cellula-ECM in normale contro gli stati malati. protocolli HUVEC qui presentati sono applicabili alle indagini delle normali processi omeostatici vascolari, nonché di stati patologici, tra cui le malattie cardiache, la retinopatia, la crescita del tumore e metastasi, per citarne alcuni. Coniugando visibilmente trasparenti ECM e poliacrilammide substrati di conformità suscettibili di studi microscopici permetterà cellula-ECM studi impegno tale che l&#39;angiogenesi vascolare endoteliale può essere monitorato con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questi tipi di approcci sperimentali hanno già cominciato a rivelare importanti differenze di forma delle cellule endoteliali, la polarità, la migrazione e gli effetti delle proteine ​​che regolano questi processi 5,31,90. Gli sforzi futuri devono mirare ad identificare come la combinazione di conformità ECM e dimensionalità mechanosensing può servire a livello locale proteine ​​di controllo che prendono di mira e regolano la dinamica del citoscheletro.

L&#39;angiogenesi è innescata da segnali extracellulari di segnalazione che promuovono le cellule endoteliali (ECS) di polarizzare, migrare con la specificità direzionale, e formare nuovi vasi nei tessuti che richiedono apporto di sangue. fattori che contribuiscono pensato di guidare angiogenesi sono segnali dalla matrice extracellulare (ECM). In risposta a stimoli fisici, EC estendere nuove filiali con specificità direzionale per guidare movimento direzionale nella formazione del 1,2 rete vascolare. L&#39;architettura della morfologia CE e la ramificazione è definita dal regolamento localizzata del citoscheletro microtubuli (MT) in un modo che è coordinata con la regolazione del acto-miosina contrattilità 3. Al fine di rami CE per formare, miosina-II deve essere localmente downregulated, con conseguente sporgenze membrana localizzate 4. Allo stesso tempo e nella stessa posizione all&#39;interno della cellula, dinamiche di crescita MT diventano modificati con conseguente crescita lenta e persistente MT promuovere ramo Elongazione e stabilità 5. Questo regolamento del citoscheletro coordinata permette EC di polarizzare la loro morfologia per facilitare la migrazione direzionale. Lo sviluppo di una morfologia cellulare polarizzata richiede il montaggio polarizzata MT 6. In migrazione delle cellule epiteliali, MT crescono lentamente e persistentemente specificamente al bordo anteriore della cella 7-9; mentre nei neuroni, l&#39;apertura e l&#39;allungamento degli assoni o dendriti richiede che MT non solo sono presenti, ma che sono dinamicamente sottoposti ai processi di montaggio e smontaggio 10-15. In questo modo, il controllo localizzata di dinamiche di crescita MT determina l&#39;architettura della cellula e permette una rapida rimodellamento della morfologia cellulare ECS navigare attraverso il loro ECM. dinamiche di crescita MT sono regolati da famiglie di proteine ​​motrici molecolari e proteine ​​non motori, chiamati microtubuli proteine ​​associate o microtubuli proteine ​​interagenti (d&#39;ora in poi refeRred come MAP). Le mappe possono essere localmente attivato o inattivato, in genere attraverso la segnalazione cascate avviate a livello di interfaccia cellula-ECM 16,17. Una volta attiva la funzione, mappe legandosi al MT e alterare la cinetica della MT montaggio e smontaggio; funzionante in tal modo di regolare a livello locale dinamiche MT al fine di promuovere la forma delle cellule e la polarità 18-20. Mitotico Centromere Associated Kinesin (MCAK) è un Kinesin-13 MAP famiglia che si lega a fini MT e coppie idrolisi dell&#39;ATP per MT smontaggio 21-23. Questo ruolo funzionale MCAK si caratterizza per essere critici ai mitotico mandrino 24-28, così come durante l&#39;interfase 29,30. All&#39;interno interphase EC, MCAK mediata smontaggio MT è regolata da localizzato Aurora-A fosforilazione indotta MCAK in risposta a ferita-bordo di attivazione indotta della piccola GTPasi Rac1. Il risultato di questa cascata di segnalazione è l&#39;inibizione della MCAK all&#39;avanguardia di EC, con conseguente crescita MT polarizzata verso leading bordo e MCAK indotta MT smontaggio a bordo di uscita della migrazione EC 31. metodologie tradizionali per la misurazione dinamica di crescita MT sono tipicamente utilizzati monitoraggio mano di uno tubulina fluorescenza marcata o, più recentemente, fluorescenza marcata MT Fine binding protein 1 o 3 (EB1 o EB3, rispettivamente). L&#39;approccio tubulina fluorescente ha il vantaggio di etichettatura dell&#39;intero array MT. Tuttavia, poiché la maggior parte dei tipi di cellule mitotiche mantenere un allineamento radiale di MTS durante l&#39;interfase 8,32,33, MTs vicino centrosoma sono molto denso, e come risultato, il monitoraggio della crescita MT e smontaggio con la tubulina fluorescente è generalmente limitata alla periferica regioni della cellula. A causa di queste limitazioni, l&#39;utilizzo delle proteine ​​EB fluorescenza marcata (EB1 o Eb3) è stato l&#39;approccio più comune per misurare la dinamica MT. Perché EBs etichetta solo le crescenti più-end di MTS, appaiono come piccole (1-3 micron), fluorescenza brillante venirets, fornendo così un marcatore facilmente distinguibile di MT polimerizzazione con sfondo molto limitata fluorescenza di 34-37. Mentre il fatto che EBs etichetta solo un sottoinsieme della matrice MT rappresenta un importante forza dell&#39;approccio EB, evidenzia anche una limitazione importante, che MTs non-maturazione non sono etichettati dall&#39;approccio EB3. Tuttavia, la capacità di misurare e monitorare le comete Eb3 nel corso del tempo e di visualizzare la crescita MT nelle regioni sub-cellulari rendono questo approccio ideale per applicazioni che richiedono la valutazione regionale di organizzazione MT. Un altro limite critico delle metodologie tradizionali per la misurazione dinamica di crescita mt è stata molto grandi insiemi di dati e il tempo necessario per l&#39;analisi dei dati. Questa limitazione deriva dalla necessità di monitoraggio mano di centinaia di comete EB ad elevata risoluzione temporale. Inoltre, queste misurazioni devono essere fatte in un numero statisticamente significativo di cellule e anche effettuato sotto una varietà di controllo e experimecondizioni ntale. Recentemente, questi vincoli sono state superate attraverso tecniche di analisi computazionale specificamente dirette a comete monitoraggio Eb3 usando la microscopia time-lapse in cellule viventi 35. Se usato in modo appropriato, questo approccio computazionale serve sia per limitare il potenziale di errore umano associato mano-tracking, oltre a fornire un metodo ad elevata capacità di misurare MT polimerizzazione. Analisi computazionale della dinamica MT che utilizzano il pacchetto software MatLab-based, plusTipTracker, consente la misurazione della crescita MT di monitoraggio comete Eb3 fluorescenza marcata 5,31,35,38. Inoltre, il software plusTipTracker permette per i calcoli di eventi catastrofali MT (aka smontaggio) basati sulla scomparsa di comete Eb3 all&#39;interno di un brano MT in crescita, e consente l&#39;analisi sub-cellulare (aka regionale) di dinamiche di crescita MT nelle regioni definite dall&#39;utente di interesse . Per i nostri studi, la dinamica di crescita MT sono stati confrontati all&#39;internoregioni ramificati rispetto a regioni non ramificati, o entro leader contro bordi d&#39;uscita delle celle. Uscita dati da software plusTipTracker può anche essere usato per generare codice colore overlay binario per le singole celle e regioni sub-cellulari. Qui si descrive la metodologia utilizzata per studiare il ruolo di MCAK nella modulazione dinamiche di crescita MT e il contributo di questo MT depolymerase alla regolazione della CE ramificazione morfologia e la migrazione direzionale. Il nostro approccio utilizzato una linea primaria cellule umane, cellule endoteliali ombelicale Vena umana (HUVEC), che sono facilmente colto e altamente suscettibili di elettroporazione indotta, trasfezione transiente di plasmide cDNA. Abbiamo poi utilizzato ad alta risoluzione, time-lapse microscopia a fluorescenza di HUVECs trasfettate con MT Fine binding protein 3 (EB3) e Mitotic centromero Associated Kinesin (MCAK) cDNA SPECIFICI costruisce per valutare gli effetti sulle dinamiche MT transfettate HUVECs. analisi delle immagini computazionale PlusTipTracker a base di EB3MT -labeled più estremi è stato quello di misurare la velocità di crescita MT e vite di crescita MT in time-lapse immagini, per misurare e confrontare gli effetti delle manipolazioni sperimentali su dinamiche di crescita MT. Questa metodologia consente lo studio della dinamica MT e l&#39;identificazione di come regolazione localizzata della dinamica MT nelle regioni subcellulari contribuisce ai processi angiogenici di CE ramificazione e migrazione. Queste tecniche sono applicabili alle indagini di qualsiasi mappa che può essere fluorescente ed espressi in cellule vive.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aurora A Inhibitor I</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>99462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;mouse IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-1688-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-7788-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET455/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET525/36m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET605/70m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET605/70m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET700/75m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET700/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>RPI Products</td>
			<td>A30075-100.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clara cooled charge-coupled device camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>77026010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyelight 649 goat anti-rat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>112-496-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-MV SingleQuot Supply &#38; Growth Factors (contents shown below)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum 25 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine brain extract 2.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL)&#160; 10.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic shutter</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>77016099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S80026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-78425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-036-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-036-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8006-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon TiE</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI Technologies</td>
			<td>MS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>CS70330-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MCAK</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS310000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>Contains the electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum jelly</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2021854-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plusTipTracker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti&#8211;pT288&#8211;Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti&#8211;&#945;-tubulin</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA78G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>678-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk&#160;</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Yokagawa CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

cultura HUVEC per microscopia live-cell Live-cell imaging di HUVEC esprimono proteine ​​fluorescenti richiede che HUVEC sono mantenuti in un ambiente che è adatto per la normale crescita cellulare e la manutenzione, nonché espressione della proteina normale e funzione. La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica del protocollo utilizzato per preparare una tamponata e sistema chiuso che mantiene ottimizzato caratteristiche ottiche per la raccolta di immagini time-lapse di cellule vive. Sottili strisce di nastro biadesivo sono posti su un vetrino (Figura 1A) e poi il vetrino contenente la coltura HUVECs è invertita sopra del nastro in modo tale che le cellule siano rivolti vetrino (Figura 1B). In questo modo, il nastro fornisce un piccolo spazio tra le due superfici di vetro, e crea uno spazio in cui le cellule possono essere bagnati in appositi mezzi di coltura cellulare (Figura 1C; vedi protocollo 4, sopra). iona passo finale, il vetrino di vetro è sigillato al vetrino con una vaselina: paraffina: lanolina (1: 1: 1 miscela, VALAP; Figura 1D) per stabilire un sistema chiuso. Questo approccio coltura cellulare è stato utilizzato sia per imaging breve sequenza temporale di comete Eb3 e per la sequenza di tempo maggiore ramificazione e esperimenti di migrazione. Inoltre, la consistenza simile alla cera di VALAP consente una facile rimozione dal vetrino e coprioggetto alla fine di un sistema di imaging sperimentare tale che approcci supplementari inclusi fissazione e immunolabelling (vedi protocollo 8), può essere effettuata sullo stesso vetrino e campione cellulare che è stato visualizzato utilizzando l&#39;approccio live-cell imaging. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> Figura 1:. Metodologia della cultura HUVEC per il live-cell immagini microscopiche (A) Tagliare 2 pezzi di nastro biadesivo in 0,65 cm x 2.50 cm strisce rettangolari e garantire un pezzo di nastro biadesivo orizzontalmente lungo il bordo superiore della diapositiva e l&#39;altro pezzo, lungo il bordo inferiore della diapositiva. È importante consentire una piccola quantità di spazio tra il nastro e il bordo scivolo per sigillare la camera come descritto in (D). (B) Utilizzando pinze rimuovere il vetrino contenente HUVECs e invertono il vetrino (lato della cella verso il basso) sulla parte superiore dei pezzi di nastro. (C) Usando una micropipetta, aggiungere 40 ml di mezzi di imaging (terreno completo basale endoteliale addizionato con 25 mM HEPES) tra il vetrino e il vetrino. Assicurarsi che lo spazio tra il vetrino e slitta è completamente riempito con i media di imaging e di evitare bolle. Utilizzare un aspiratore lungo il bordo del vetrino per rimuovere l&#39;eccesso supporto, se necessario. (D) Usare VALAP caldo (1: 1: 1 di vaselina: lanolina: paraffina) per sigillare intorno ai bordi del vetrino. Verificare la presenza di perdite di supporti di imagings spingendo intorno delicatamente sul vetrino. Utilizzare ulteriore VALAP per rimediare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> automatizzato di monitoraggio di EB3 fluorescenza marcata consente un&#39;analisi completa di tutto il cellulare e dinamiche di crescita MT regionali. La raccolta di immagini microscopiche chiare, distinte, e molto tempo e spazio risolta della proteina EB3 è essenziale per l&#39;analisi dei movimenti Eb3 all&#39;interno della cellula. HUVEC espressione di EB3 fluorescenza marcata varia ampiamente da cellula a cellula e l&#39;intensità di fluorescenza aumenta tipicamente all&#39;interno della stessa cella durante un periodo di ore. Pertanto, è importante considerare e monitorare questi cambiamenti nel profilo di espressione per identificare potenziali effetti di aumento di espressione EB sulle dinamiche di crescita MT. Questo è meglio raggiunto attraverso la valutazione a scala di grigi a fluorescenza intesitàprofili y per ogni cella ripreso e quindi limitando l&#39;analisi dei dati di quelle cellule che presentano un intervallo definito di profili di espressione in scala di grigi. Valutazione iniziale di set di dati profilo di espressione è critica e deve essere confrontato con MT dati dinamiche di crescita che si ottiene dal software plusTipTracker per ogni cella. profili di espressione possono essere rilevate in velocità di crescita MT e MT durata crescita per ogni cella all&#39;interno di un gruppo sperimentale, per determinare l&#39;intervallo desiderato di espressione scala di grigi e per identificare potenziali valori anomali. La figura 2 evidenzia una HUVEC coltivate su un substrato di fibronectina (vedi protocollo 2.1, sopra) e che esprimono nei pressi di livelli ottimali di EB3 Mapple marcato. Comete Eb3 fluorescenti sono mostrati in una serie temporale-lapse di immagini su un periodo di 12 sec (Figura 2A). Analisi delle comete Eb3 utilizzando il software plusTipTracker comporta un automatico, fotogramma per fotogramma EB3 cometa detection (punti verdi e gialli, Figura 2b). Le comete rilevati all&#39;interno di ciascun frame vengono quindi collegati, dipende dalla loro cambiamento di posizione da fotogramma a fotogramma, per generare tracce Eb3 e una sovrapposizione pista EB3 visivo (Figura 2C-F). sovrapposizioni pista sono codificati a colori e le distinzioni di colori possono essere determinati da parametri inseriti dall&#39;utente. Comunemente, queste distinzioni utilizzano la media globale della velocità di crescita MT e MT crescita durata 5,31 e quindi suddividere i dati in quattro gruppi: lenta e di breve durata (rosso), lento e longevi (giallo), veloce e breve vissuto (verde), e la crescita MT veloce e di lunga durata (blu; Figura 2G). monitoraggio PlusTipTracker-mediata di dinamiche di crescita MT Eb3 marcato consente inoltre Regioni definite dall&#39;utente di interesse (ROI). PlusTipTracker estrae i dati della traccia crescita MT all&#39;interno della ROI definito dall&#39;utente (Figura 2A, B e F), consentendo in tal modo per il confronto di MT crescita dynamics all&#39;interno di diverse regioni della stessa cella. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> Figura 2: rilevamento cometa EB3, il monitoraggio, e l&#39;uscita dei dati plusTipTracker (A) filmato time-lapse di un HUVEC esprimere Mapple EB3.. pannello di sinistra mostra una vista cellula intera e la maschera cellula intera (linea bianca) demarking i bordi delle celle. Casella rossa rappresenta la regione ingrandita mostrato nelle immagini time-lapse (pannelli a destra). pannelli di destra mostrano time-lapse immagini in scala di grigi prime di comete Eb3 in cornici per immagini successive (t = 0 sec - t = 12 sec). (B) la rilevazione plusTipTracker delle comete Eb3 dalle immagini mostrate in (A). pannello di sinistra mostra una vista di cella intera comete rilevati (punti gialli). Casella rossa rappresenta la regione ingrandita mostrato nelle immagini time-lapse (pannelli a destra). pannelli di destra evidenziano cinque comete Eb3 rilevati (frecce rosse) e ripercorrono quei cinque comete nel periodo di imaging 12 sec. verde<html> puntini rappresentano rilevati comete Eb3 che non esistevano (o non sono stati rilevati) nel precedente intervallo di tempo. (C) di proiezione massima intensità di 61 frame (2 min film) delle comete Eb3 mostrati in (A). (D) plusTipTracker MT traccia overlay degli stessi 61 fotogrammi (2 min film) indicati in (C). (E) Zoom di proiezione massima intensità (box rosso in C). (F) Zoom di plusTipTracker MT traccia overlay di proiezione massima intensità (box rosso in D). Leggenda per le sovrapposizioni di pista mostrate in (D) e (F) (G) con codice colore. Designazione come lento, veloce, di breve durata o di lunga durata si basa sul valore medio per tutte le tracce di crescita misurati in un gruppo di dieci Mapple-Eb3 HUVECs che esprimono. Per facilitare la visualizzazione, sovrapposizioni di pista a (D) e (F) sono generati utilizzando intensità dei pixel invertiti dell&#39;immagine cellule mostrato in (A). Barre di scala = 20 micron./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. HUVEC ramificazione e modelli di migrazione sono sensibili al meccano-fisiche segnali dalla ECM. HUVECs sono ben noti a rispondere a vari tipi di segnali di segnalazione e, in tal modo, a subire alterazioni morfologiche che dettano una risposta cellulare adeguata al particolare spunto di segnalazione (s) 36,40-42. HUVECs coltivati ​​su substrati di vetro rivestito fibronectina (Figura 3a), o su rigide ECM poliacrilammide 2 dimensioni (55 kPa) tipicamente visualizzare un giro o morfologia allungata con poche sporgenze ramificate distinti (Figura 3B). Tuttavia, quando coltivate su molto morbidi ECM poliacrilammide 2-dimensionali (0,7 kPa), HUVECs visualizzare una morfologia molto ramificata che è noto per il risultato di conformità indotta verso il bassoregolazione della miosina-II contrattilità 4,5,31 (Figura 3C). Così, HUVECs regolano la loro morfologia cellulare attraverso ECM mechanosensing, e questo si realizza attraverso la modulazione localizzata di dinamiche MT e acto-miosina contrattilità. Poiché HUVECs visualizzare un&#39;ampia varietà di attributi morfologici, al fine di misurare HUVEC ramificazione è importante definire prima cosa una sporgenza ramificato è, quindi per definire come una sporgenza ramificato sarà misurato oggettivamente. Una tecnica utilizza un approccio in quattro fasi con cui un limite di cella o &quot;maschera&quot; viene generato a mano tracciando i bordi della cella utilizzando un&#39;immagine di una cellula che esprime un marcatore fluorescente del volume per definire i bordi delle celle (Figura 3D). Dopo generazione maschera, origini filiali sono definiti localizzando grande angolo di curvatura tra la protrusione ramificato e il corpo cellulare. Una linea è disegnata per Demark &quot;origine ramo&quot; (linee angolate viola; Figura 3E). Numero Branch è misurata semplicemente contando il numero di sportelli, con un ramo di origine definita (Figura 3F). Lunghezza Branch è misurata come la distanza dall&#39;origine ramo punta ramo distale (Figura 3G). Per evitare l&#39;inserimento di piccole proiezioni lamellipodial da analisi dei dati, criterio che si aggiunge richiede che i rami devono essere più lunghi ( &quot;lunghezza ramo&quot;) che larghi (presso l &#39; &quot;origine ramo&quot;), e che i rami devono essere almeno dieci micron di lunghezza 5 , 31. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> . Figura 3: Analisi di HUVEC ramificazione morfologia (A - C) esempi di immagini DIC di HUVECs coltivati ​​su rivestito fibronectina ECM di vetro (A) rigide (55 kPa) ECM poliacrilammide (B) e soft (0,7kPa) ECM poliacrilammide (C). Ramificazione è drammaticamente aumentato negli HUVECs coltivati ​​su 0,7 kPa ECM poliacrilammide (C) rispetto ai più rigidi ECM (A, B). (D). DIC immagine microscopica (immagine a sinistra) di un HUVEC trasfettate che esprimono un Mapple-C1 cDNA costruire (un marcatore volume cellulare; immagine a destra). (E) Definire l&#39;origine ramo individuando il massimo angolo di curvatura (cioè la posizione in cui la membrana visualizza la massima curvatura; linee color porpora) su entrambi i lati del ramo e quindi collegare gli angoli con una linea retta (linee blu) . (F) individuare e selezionare sporgenze ramificati che si estendono&gt; 10 micron dal &quot;origine ramo&quot; (definito in E). Contare il numero di sporgenze ramificati per ottenere il &quot;numero della filiale&quot;. (G) Misurare la distanza dal centro del &quot;origine ramo&quot; al most punto distale del ramo con lo strumento linea nella annotazioni e misurazioni applicazione di NIS elementi software per ottenere la &quot;lunghezza ramo.&quot; Barre di scala = 20 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Oltre al rispetto ECM sensing, HUVECs anche senso e rispondere all&#39;eliminazione dei contatti cellulari adiacenti indotta da zero ferimento. Nel saggio di migrazione, HUVECs coltivate in monostrato sono sottoposti ad una ferita zero e caratteristiche di migrazione sono misurati (vedi protocollo 9, sopra). Dopo l&#39;induzione della ferita grattando il monostrato, HUVECs ferita-bordo polarizzano sviluppando un bordo anteriore sporgente che si estende nella ferita (Figura 4A, t = 0 ore). Nel corso di un corso di tempo di 10-12 ore, polarizzati HUVECs ferita-edge migrano nella zona della ferita e riempire ilferita, stabilendo un nuovo monostrato confluente (Figura 4A, t = 11 ore). Come con HUVEC ramificazione, attuale evidenza suggerisce che la polarizzazione e la migrazione è critico dipende dalla coordinata riorganizzazione del citoscheletro di actina e MT 43-49. Questo risultato è ottenuto, in parte, attraverso l&#39;inibizione localizzata di MCAK indotta MT smontaggio all&#39;avanguardia, ma non al bordo posteriore della ferita bordo HUVECs 31. La sensibilità della dinamica MT per ferita indotta polarizzazione viene avviata dal Rac1 GTPasi, che si rivolge numerose proteine ​​regolatore a valle, tra cui Aurora-A-chinasi che fosforila e inibisce MCAK all&#39;avanguardia, e altre chinasi che sono in grado di inibire o attivando MAP localmente modulare la crescita MT e ritiro 18,31,36,48,50-53. Ampie prove sperimentali supporta la nozione che il coordinamento dei leader protrusione bordo di entrata e di uscita contrazione bordo è regolato attraverso cicli di attivazione di Rac1promuovere MT assemblaggio all&#39;avanguardia e l&#39;attivazione RhoA a acto-miosina contrattilità al bordo di uscita, in modo da guidare la motilità diretto 9,41,51,52,54-58. Ad oggi, non c&#39;è una metodologia stabilita per eseguire il monitoraggio automatico della migrazione cellulare. Questo è il risultato di difficoltà di analisi computazionalmente confini cellula-ECM che sono costantemente cambiando come cellule ferita punta polarizzano e migrano. Mentre molti programmi software sono in grado di tracciare cellule fluorescente 59-64, la popolazione di fluorescente HUVECs in esperimenti di migrazione ferita punta è circa il 30-40% della popolazione totale HUVEC, e quindi la maggior parte delle cellule ferita tagliente può essere visualizzati da contrasto di fase o l&#39;imaging DIC. Inoltre, è importante quando si misura la migrazione ferita bordo per valutare le cellule fluorescenti e non fluorescenti all&#39;interno della stessa ferita per individuare specificoeffetti di espressione crea sia all&#39;interno di gruppi di studio sperimentali e tra i gruppi di studio sperimentali. Attualmente, il metodo migliore per misurare la migrazione HUVEC è di utilizzare un approccio inseguimento mano in cui una cella ferita bordo è identificato e poi il nucleo e nucleolo sono identificati (Figura 4B). Il nucleolo viene usata come posizione determinante per il monitoraggio delle cellule causa della sua densità dispersione luce alta e relativamente piccole dimensioni. Queste due caratteristiche del nucleolo rendono più facile identificare e ridurre errori di misurazione limitando l&#39;area in cui l&#39;utente può inserire singole posizioni di traccia. tracce di migrazione HUVEC sono poi generati cliccando sul nucleolo in successive fotogrammi di immagini time-lapse. Infine, velocità di migrazione e distanza di migrazione all&#39;origine sono misurati ed analizzati per il controllo e gruppi di cellule sperimentali (Figura 4B). <img alt="Figura 4"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg&quot; /&gt; Figura 4: Analisi di HUVECs ferita-edge e il monitoraggio della migrazione immagini (A) 20X a contrasto di fase di un time-lapse serie di imaging 11 ore di zero ferita bordo HUVECs (alias &quot;Migration Assay&quot;).. La ferita e la direzione della migrazione sono indicati in pannello t = 0 hr. HUVEC sono presenti per attraversare la ferita bordo e avanzare nella ferita fino a formare un monostrato di cellule (t = 3,5 hr - t = 11 h). (B) Analisi del dosaggio migrazione dell&#39;imaging time lapse (come indicato in A) richiede innanzitutto l&#39;identificazione di un tracciabili HUVEC ferita bordo in base alla posizione delle cellule (cioè le cellule fisicamente ai margini della ferita) e profilo di espressione (i .e. , selezionare una cella bordo della ferita verde se l&#39;esperimento comporta espressione di GFP). Usando l&#39;immagine a contrasto di fase, identificare il nucleo e il nucleolo. Mano traccia nucleolo in time-lapse immagini successive utilizzando l&#39;unanotazioni e misurazioni applicazione nel software NIS elementi per determinare la velocità di migrazione e la distanza alla loro origine. Scala bar = 100 micron (A), 20 micron (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Views.  University of the Sciences in Philadelphia. Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed. 

Video: High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

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Biologia

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All&#39;inizio del Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Analisi quantitativa della migrazione casuale di celle usando Time-lapse Microscopia Video

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule endoteliali Colony Forming derivato dal sangue del cordone ombelicale umano

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

L&#39;acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali per la microscopia dell'illuminazione strutturata time-lapse

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...