plusTipTracker MT解析ソフトウェアを開発するために、これらの研究に用いられる蛍光cDNA構築物の多くの、そしてキャサリンアップルゲートとGaudenz Danuserを提供するための指導や議論のための博士クレアM.ウォーターマン、ミシェル・ベアードとマイク・ダビッドソンに感謝します。この作業は、部分的には、国立心臓肺血液研究所（NHLBI）と国立衛生研究所（NIH）からKAMへの助成金によって、サポートされていました。 （グラント：4K22HL113069）。

The authors declare that they have no competing financial interests.

形態と移行実験でのHUVECを使用します。 HUVECを内EB3標識MT成長ダイナミクスの生細胞のイメージングは​​、それらが次にECMシグナリングキューに割り当てることができるように、MTの成長及びHUVECの形態の変化を測定し、評価するために適切で再現可能な細胞培養条件を必要とします。 HUVECを、細胞の形状と運動性を研究するための優れたモデルを表します。彼らは両方の可溶性および物理的なシグナリングの合図に応答して劇的な形態を呈し、蛍光標識cDNAでのトランスフェクションに非常に適している、と彼らは、適切な細胞培養条件65-70を提供する際、血管管の中に自分自身を整理する能力を維持します。などのHUVECのような初代細胞培養物は、細胞が健康であることを保証するために、彼らは実験中に正常に動作することを慎重な取り扱いと細胞継代数の監視を必要とします。例えば、cytoskeleを調べる実験を行いますHUVECをは一般的に15に通路12の周囲に不均一な形態を表示するために始めるとトンおよび/または細胞形態は、HUVECを、第十細胞培養継代を超えた実験のために使用すべきではありません。 細胞密度はまた、HUVECの健康と増殖の重要な調節因子です。調査を分岐HUVEC（上記プロトコル10.1から10.4を参照）は、ECMと相互作用して、分枝状突起を拡張するために、細胞を物理的空間を提供するために、比較的低い細胞密度培養物を使用します。これとは対照的に、（プロトコルの10.5から10.8を参照）創傷縁の移行研究において、HUVECを前に創傷に、単層培養されています。このように、創傷縁HUVECを、比較的非分岐形態を示し、先端の突起を拡張し、それらが創傷に遊走するようにそれらのすぐ隣との細胞間相互作用を示します。 リビングのHUVECにおけるトラッキングMTダイナミクスの注意事項とメリット。 ディスク顕微鏡を回転することに優れたアプローチであります高時間分解能での共焦点画像の鮮明さを必要とする実験的な仮説をテストします。適切なカメラとレーザモジュールと、この顕微鏡法は、低放射蛍光に敏感であり、蛍光顕微鏡の他のタイプと比較して低減退色するのを助けることができます。異なる種々の細胞型において、EB3標識アプローチを使用して、MTの増殖動態の包括的測定値を生成するために必要とされる重要なことに、このアプローチは、高時間分解能イメージング中程度によく適しています。 標識成長MTプラス端のEB3方法は、蛍光標識MTの他の方法に比べて顕著な利点を有するが、それはまた、固有の欠点を有します。例えば、積極的に分解MTの集団と安定、非ダイナミックのMT 71-74の集団の両方を含む、任意の時点で成長していないMT配列の割合があります。 EB3は、MTのこれら2つの集団にラベルを付けないであろうとしたがって、これら2つの集団の貢献は、実験データの分析には含まれません。全体MTのアレイを評価するための代替方法は、MTの全ての集団に組み込まれており、成長縮小、および安定MTの識別を可能にする、蛍光標識チューブリンの発現に焦点を当てています。しかし、全体MT配列を標識微小管組織化中心（MTOC）にセルの中心と隣接する周辺MTアレイの比較的高い密度の細胞の近くにはないMTの端部の画像解析を行う際に不都合を作成周辺75-77。生細胞内の蛍光チューブリンと蛍光EB3とMTの2色同時標識を用いた実験は、チューブリン標識MTの大半はまたEB3標識78であることを、定性的に明らかにしました。さらに、蛍光チューブリンで標識されたMTの自動追跡の効率的な方法がなかったです。これは、そのデータcol​​lec手段蛍光チューブリンを発現する細胞におけるションとMTダイナミクスの測定は、個々のMTの手の追跡、エラーが発生しやすいと面倒なプロセスを必要とします。その結果、EB3標識MTの自動化コンピューター分析は、それが多くの細胞タイプで、実験計画35,79の種々内MT動態実験に適用することができるように、MT動態を測定するための好ましい方法となっています。 HUVEC形態および移行にMT成長ダイナミクスのリンク。 細胞骨格の研究者の観点から、plusTipTracker自動追跡分析の1極めて有用な適応は、全細胞およびMTの成長ダイナミクスの地域変化の両方を測定し、評価する能力です。偏光になるため、細胞のための要件は、指向性細胞遊走に不可欠な前提条件です。このように、偏光シグナルキューが長い方向の細胞遊走のための重要な駆動因子として知られている30,31,51,54,56,80,81 </SUP&gt;。例えば、VEGFのような水溶性のシグナル伝達分子は、アクチン重合および内皮細胞型2,82-87におけるVEGFキューに向かってMTの成長を誘導します。さらに、（例えば、コンプライアンス及び次元mechanosensing用）ECMとの物理的相互作用に応答して、HUVECを局所的にMAPが分岐状突起を伸長内のMTの成長を促進するために調節することにより、それらのMT動態を調節し、これは方向にHUVECの移動を案内しますキュー5,31,88。したがって、細胞外シグナル伝達の合図に応答して、分極が細胞骨格の動態の局所的変化の実験的評価の必要性を強調しています。 （EB3アプローチを使用して）MT成長動態およびHUVEC細胞の遊走の同時生細胞画像化は、MTSは、秒の時間スケール上に成長するので、細胞の形態及び方向移動の変化が時間の時間スケールで発生しながら、行うことが非常に困難です。しかし、両方のプロセスが密接リンケですD。また、第2タイムスケール上で蛍光標識EB3の連続的な、迅速な画像化はEB3信号の光退色をもたらします。 EB3（1〜2分取得シリーズ）30分ごとに成功しているの短いイメージングシリーズを行うことにより、この問題を克服しようとする試みが、唯一EB3の最適な発現を持っていたECの少数で達成することができ、それが有害表示されませんでした繰り返しレーザー照射5への影響。 MT成長ダイナミクスは、細胞の形態と遊走の変化に寄与するかの解釈を可能にする別のアプローチは、関心のplusTipTracker領域（ROI）ツール35（プロトコル6.6を参照）です。全細胞MT成長がMT成長トラックは次いで、抽出し、分析することが可能なユーザ定義の領域に副分割するトラックのこの方法は可能にします。例えば、セルの「非分岐」領域に対する「分岐」の比較は、MTSがより多くのを成長させることを明らかにしました低いより永続的分岐した領域内の非分岐状細胞外周5と比較して。偏創傷縁のHUVECでは、前縁及び後縁のMT成長ダイナミクスの比較はMCAKに誘導されるMTの解体後縁を前縁内で特異的に阻害するが、されていないことを明らかにしました。先頭およびRac1の、および/またはMCAKのリン酸化変異体を発現たHUVECにおけるエッジMT成長ダイナミクスを末尾の地域内の評価はさらに、オーロラキナーゼのRac1の誘導活性化を具体的かつ局所的にHUVECの偏光と方向性のある移動を駆動するために、前縁内MCAKの活性を阻害することが明らかとなりました31。このように、MTの成長のダイナミクスと分枝状突起および/または創傷縁HUVECの前縁内のMT​​成長ダイナミクスの地域評価の自動追跡の組み合わせは、私たちはHUVECの形態および移行にMTの成長のダイナミクスをリンクすることができました。 記載されているプロトコルは、デザイン性ありdはHUVECの文化や実験的調査のため、一般的に簡単で、再現性の高い方法を提供します。それにもかかわらず、プロトコルの詳細の多くは、今度は、実験的な方法論を実施するのエラーや困難のための機会を提供し、複雑で時間がかかります。それは、プロトコルを通じて潜在的な問題に対処しようとしたが、ここではあまり一般的ではないか、そうでなければ方法論のプロトコル内のノートと略記されている潜在的な問題の追加、詳細なトラブルシューティングが提供されます。 ポリアクリルアミド基板（プロトコル2.2）で被覆カバーガラスに関連して、発生する一般的な問題は、カバーガラスを活性化ガラスにポリアクリルアミドを結合する、ポリアクリルアミドを活性化し、その後、ポリアクリルアミドにECMを結合する複雑な性質です。一つの特に困難と潜在的に問題のステップは、ポリAの曝露後のフィブロネクチン/ポリアクリルアミドゲル上のHUVECを培養され、2 mMのスルホ - SANPAHにcrylamideコーティングしたカバースリップ（上記のステップ2.2.2.6）。これは、スルホ - SANPAHが完全にECMの共役以下の実験システムから削除され、これらの基板上でのHUVECの培養の成功に不可欠です。これは、最良のddH 2 Oで洗浄し、一晩振盪機上でのddH 2 O中でカバースリップをインキュベートすることによって達成することができます。ポリアクリルアミドのECM上で培養した細胞は生存する、または生存率が予想よりも小さい場合、フィブロネクチン（ステップ2.2.2.9）への結合体化の後にスルホ - SANPAHの洗濯を増加させ、繰り返されない場合は、潜在的にこの問題を軽減することが推奨されます。 プロトコル3（カバースリップ上のcDNAのトランスフェクションおよびHUVEC文化）に関連して、エレクトロポレーション手順の成功に大きな影響をプラスチックフラスコからそれらを削除するには、両方の細胞のトリプシン処理中に、HUVECの取り扱いである、との結論を以下エレクトロポレーションは（上記、3.3から3.4ステップ）。気にすることが重要です完全にトリプシンでながらたHUVECを監視し、フラスコ（通常は1~2分）の表面に「切り上げ」に細胞に必要な時間を超えません。トリプシンでの過度の時間は、典型的には、細胞は、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ（ステップ3.4）上にプレーティングされるまでに実現した後、基板に取り付けられるように失敗していないHUVEC死の主要な原因です。 エレクトロポレーション緩衝液中で長い時間のために中断したときに同じような重要なのは、HUVECを（最も主要な細胞型は）うまくいきません。ユーザは、エレクトロポレーションを必要とする5つ以上の状態を有する場合、より大きな規模の実験の間、例えば、1つずつ、個々のチューブ（トランスフェクションあたり1管）でペレット化した細胞を維持するために、それらを混合した方がよいです、エレクトロポレーションの前にすぐにエレクトロポレーションバッファーインチこのアプローチは、エレクトロポレーションバッファーと最大化HUVECの生存にインキュベーション時間を最小限に抑えます。さらに、完全培養培地中の即時の救助もCRでありますitical以下のエレクトロポレーション。レスキュー1分の遅延または複数、次のエレクトロポレーションは、ほぼ完全なHUVECの死に至ることができますので、避けるべきです。 関連細胞遊走アッセイ（プロトコル9）、極めて高い密度でHUVECを培養する技術は、フィブロネクチンコーティングしたカバースリップの乾燥を必要とする（プ​​ロトコル3を参照）、従来のHUVEC細胞培養法の（ステップ9.2に記載の）臨界変形に依存しますカバーガラスの非常に小さな領域にHUVECの培養を可能にするためです。カバーガラスが完全に乾燥されていない場合、またはフィブロネクチンとカバーガラスのコーティングの前には（2.1または2.2ステップ）効率的でなかった場合、多くの場合、カバーガラス上に置かれているメディアを含む細胞は、その表面張力を失い、に拡大しますそれにより、カバースリップ上の細胞の密度を減少させるカバースリップの縁、。この潜在的な問題を解決する一つの方法は、その後、カバーガラスからメディアを吸引することであり、5-10分間のバイオセーフティキャビネットの背面に（まだ35ミリメートル皿で）カバースリップを配置。この適応は、皿を乾燥させるのを助けるために、キャビネット内の空気の流れを可能にするように助けることができます。目に見える液体が空気乾燥した後、カバーガラス上に残っている場合、液体スポットを吸引し、再び生物学的安全キャビネットの中5-10追加分間風乾させます。完全にこの潜在的な問題を回避する方法がないことに注意することは重要ですが、それはプロトコルの反復練習の問題のあまりになるん。これは、余分なカバースリップを準備し、道に沿って問題が発生した場合には、すぐに行く余分たHUVECを持つように、（一般的に、または任意のアッセイ）細胞遊走アッセイのためにカバースリップを準備するときようにしても、トラブルシューティングの推奨事項です。 念頭に置いてこれらのトラブルシューティングの考慮事項と、議論のプロトコルおよび将来の細胞生物学研究におけるその意味の有用性を強調することも重要です。 polyacrへの適用イルアミドアプローチは、広範囲であり、（上述の）細胞ECMの関与の二次元の研究だけでなく、三次元の調査5だけでなく、。このアプリケーションは、HUVECを、生理的環境での細胞の形状および遊走を調節する方法の我々の理解を高めることに重要であると研究者らに細胞骨格の変化に調整されているかの形態学的変化の基本的な理解を提供する必要があります。ここで説明するプロトコルは、MTの増殖動態の測定に焦点を当てているが、プロトコルの大部分は、細胞 - ECM相互作用の他の微視的測定可能な態様の任意の数を測定するように適合されるべきであることができます。 MTダイナミクスに関しては、提示されたプロトコルを使用して調べることができ、少なくとも14キネシン89の家族、HUVEC極性と向かう移行に貢献する潜在的な役割を持つ各、すべてのを含め、多数のMAPがあります。 今後の捜査すべきLSO疾患状態正常対に細胞ECMの関与を対象とします。ここで提示HUVECプロト​​コルは少数を示すために、正常な血管恒常的プロセスの調査に、だけでなく、心臓病、網膜症、腫瘍の増殖と転移を含む疾患状態に適用可能です。顕微鏡的研究と従順準拠のコンジュゲートする目に見えて透明のECMおよびポリアクリルアミドの基板は、内皮細胞の血管の血管新生が高い空間分解能と時間分解能で監視することができるような細胞ECMエンゲージメント研究のためにできるようになります。実験的アプローチのこれらのタイプは、すでに重要な内皮細胞形状の違い、極性、遊走、及びこれらのプロセス5,31,90を調節するタンパク質の影響を明らかにするために始めています。今後の取組みは、ECMのコンプライアンスと次元mechanosensingの組み合わせが局所的に標的とし、細胞骨格の動態を調節するタンパク質を制御する働きをすることができる方法を特定することを目指すべきです。

血管新生は、分極方向の特異性と移行、および血液供給を必要とする組織に新しい血管系を形成するために、内皮細胞（EC）を促進する細胞外シグナリングの合図によって誘発されます。血管新生を駆動するために考え要因は、細胞外マトリックス（ECM）からの信号です。物理的な合図に応答して、電気部品は、血管網1,2の形成方向移動を案内する方向特異性を有する新しいブランチを拡張します。 ECの形態および分岐のアーキテクチャは、アクトミオシン収縮3の調節に調整されている方法で、微小管（MT）細胞骨格の局所的な規制によって定義されます。形成するために、ECの枝ためには、ミオシンIIは、局所的にローカライズされた膜の突起部4で、その結果、ダウンレギュレートされなければなりません。同時に、細胞内の同じ場所に、MTの成長のダイナミクスは、分岐エロンを促進するために遅く、持続的なMTの成長で得られた修飾になりますゲーションと安定性5。このコーディネート細胞骨格の調節は電気部品が指向性の移行を容易にするために、それらの形態を分極することができます。 偏細胞形態の開発は、偏MTアセンブリ6が必要です。上皮細胞の移行では、MTが特に細胞7-9の先端でゆっくりと持続的に成長します。ニューロンにおいてながら、軸索や樹状突起の開始および伸長は、MTSがないだけで存在していることが必要ですが、彼 ​​らは、動的に組み立ておよび分解10-15のプロセスを受けていること。このように、MTの成長ダイナミクスの局所的な制御は、細胞の構造を決定したECは、そのECMをナビゲートとして細胞形態の急速な改造を可能にします。 MT成長ダイナミクスは、分子モータータンパク質と非モータータンパク質の家族によって規制されている、微小管結合タンパク質または微小管相互作用タンパク質（以下REFEと呼ばれます）のMAPとRRED。 MAPは、ローカルに典型的には、細胞- ECMインタフェース16,17で開始シグナル伝達カスケードを介して、アクティブまたは不活性化することができます。 MTに結合し、MTの組立・分解の動態を変化させることによって、一度アクティブ、MAPの機能。これにより、局所的に細胞の形状や極性18-20を促進するために、MTのダイナミクスを調節するように機能します。有糸分裂セントロメア関連キネシン（MCAK）はMTの終了やカップルMTの解体21-23へのATP加水分解に特異的に結合するキネシン13家族のMAPです。 MCAKのこの機能的役割は、紡錘体24-28内の重要なだけでなく、相間29,30の間にあることが知られています。間期のEC内では、MCAK媒介MTの分解はRac1の低分子量GTPaseの活性化を誘導し、エッジを創傷に応答して、MCAKのローカライズされたオーロラ誘導リン酸化によって調節されます。このシグナル伝達カスケードの結果はルに向かって偏MTの成長の結果、ECの立ち上がりでMCAKの阻害であります電気部品31の移行の後縁のエッジとMCAKに誘導されるMTの分解をading。 MTの成長動態を測定するための従来の方法は、典型的には、蛍光標識されたチューブリンまたは、より最近では、蛍光標識されたMTエンド結合タンパク質1または3（それぞれEB1またはEB3）のいずれかの手の追跡を使用しています。蛍光チューブリンアプローチは全体MT配列を標識するという利点を有します。有糸分裂細胞型の大部分は相間8,32,33中のMTの半径方向の配列を維持するためしかし、中心体周辺のMTは非常に緻密であり、その結果、蛍光チューブリンとMTの成長および分解を追跡することは、通常、周辺に限られていますセル領域。これらの制限のために、蛍光標識されたEBタンパク質（EB1またはEB3）の利用はMTのダイナミクスを測定するためのより一般的なアプローチとなっています。 EBをのみMTの成長に加えて、両端にラベルを付けているので、彼らは明るい蛍光が来て、（1-3μm）のような小さい表示されますTS、極めて限定されたバックグラウンド蛍光34-37でMT重合の容易に識別可能なマーカーを提供します。 MT配列のサブセットのみのEBラベルがEBアプローチの主要な強さを表しているという事実は、それはまた、1つの重要な制限を強調しているが、その非成長のMTは、EB3アプローチによって標識されていません。それにもかかわらず、測定し、時間をかけてEB3彗星を追跡し、サブセルラー領域内のMTの成長を視覚化する能力は、MTの組織の地域の評価を必要とするアプリケーションのために、このアプローチに最適です。 MTの成長動態を測定するための従来の方法のもう一つの重要な制限は、非常に大きなデータセットとデータ分析に必要な時間でした。この制限は、高時間分解能でのEBの彗星の数百の手の追跡のための必要性に由来します。また、これらの測定は、細胞の統計的に有意な数で行い、また、コントロールとexperimeの様々な環境下で実行される必要がありますNTAL条件。最近では、これらの制約は、生細胞35にタイムラプス顕微鏡を用いて具体的に追跡EB3彗星に向けコンピュータ解析技術によって克服されました。適切に使用される場合、この計算手法は、MTの重合を測定するハイスループット方法を提供することに加えて手追跡に関連付けられた人的ミスの可能性を制限するの両方に役立ちます。 MatLabのベースのソフトウェアパッケージ、plusTipTrackerを使用して、MTダイナミクスの計算分析、蛍光標識されたEB3彗星5,31,35,38を追跡することによって、MTの成長の測定を可能にします。また、plusTipTrackerソフトウェアが成長しているMTのトラック内EB3彗星の消失に基づいて、MTの破局イベント（ 別名解体）の計算を可能にし、興味のあるユーザ定義領域内のMT成長ダイナミクスのサブセルラー（ 別名地域）分析を可能にします。私たちの研究のために、MTの成長ダイナミクスは内比較しました非分岐の領域対、または細胞立ち下がりエッジに対するリードする内分岐鎖状の領域。 plusTipTrackerソフトウェアから出力されたデータは、個々の細胞および細胞下領域のカラーコード化されたトラックオーバーレイを生成するために使用することができます。 ここでは、MTの成長のダイナミクスと形態と方向性のある移動を分岐ECの規制にこのMT分解酵素の寄与を調節するのにMCAKの役割を調査するために使用する方法を説明します。我々のアプローチは、簡単に培養し、プラスミドcDNAの電気穿孔によって誘発される、一過性トランスフェクションに非常に適している初代ヒト細胞株、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、使用していました。私たちは、その後、高解像度を使用し、タンパク質3（EB3）と分裂セントロメア関連キネシン（MCAK）特異的cDNAのバインディングMTエンドでトランスフェクトしたHUVECのタイムラプス蛍光顕微鏡は、MTのダイナミクスへの影響はHUVECをトランスフェクト評価するために構築します。 EB3のPlusTipTrackerベースの計算画像解析MTプラス端はMT成長ダイナミクスの実験操作の効果を測定し、比較するために、タイムラプス画像でMTの成長速度とMT成長寿命を測定することであった標識。この方法論は、MTのダイナミクスの研究とサブセルラー領域内のMTダイナミクスの規制が分岐ECおよび移行の血管形成過程にどのように寄与するかを、ローカライズの同定を可能にします。これらの技術は、蛍光生細胞中で標識し、発現させることができる任意のMAPの調査に適用可能です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aurora A Inhibitor I</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>99462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;mouse IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-1688-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-7788-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET455/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET525/36m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET605/70m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET605/70m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET700/75m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET700/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>RPI Products</td>
			<td>A30075-100.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clara cooled charge-coupled device camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>77026010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyelight 649 goat anti-rat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>112-496-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-MV SingleQuot Supply &#38; Growth Factors (contents shown below)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum 25 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine brain extract 2.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL)&#160; 10.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic shutter</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>77016099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S80026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-78425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-036-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-036-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8006-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon TiE</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI Technologies</td>
			<td>MS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>CS70330-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MCAK</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS310000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>Contains the electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum jelly</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2021854-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plusTipTracker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti&#8211;pT288&#8211;Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti&#8211;&#945;-tubulin</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA78G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>678-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk&#160;</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Yokagawa CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

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High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

high-resolution-time-lapse-imaging-automated-analysis-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K ビュー.  University of the Sciences in Philadelphia. Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed. 

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

ヒト臍帯静脈内皮細胞の単離（HUVEC）

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

生物学

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

免疫・感染学

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

生物工学

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

腫瘍微小環境におけるリアルタイム多細胞ダイナミクスの拡張タイムラプス生体内イメージング

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

医学

Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, appearance of defects in microcirculation can be a primary indicator in the development of multiple pathologies. Advances in optical imaging have made intravital microscopy (IVM) a practical approach, permitting imaging at the cellular and subcellular level in live animals at high-speed over time. Yet, despite the importance of maintaining adequate tissue perfusion, spatial and temporal variability in capillary flow is seldom documented. In the standard approach, a small number of capillary segments are chosen for imaging over a limited time. To comprehensively quantify capillary flow in an unbiased way we developed Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow (STAFF), a macro for FIJI open-source&#160;image analysis software. Using high-speed image sequences of full fields of blood flow within capillaries, STAFF produces&#160;images that represent motion over time called kymographs for every time interval for every vascular segment. From the kymographs STAFF calculates velocities from the distance that red blood cells move over time, and outputs the velocity data as a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses. In normal mouse livers, STAFF analyses quantified profound differences in flow velocity between pericentral and periportal regions within lobules. Even more unexpected are the differences in flow velocity seen between sinusoids&#160;that are side by side and fluctuations seen within individual vascular segments over seconds. STAFF is a powerful new tool capable of providing novel insights by enabling measurement of the complex spatiotemporal dynamics of capillary flow.

To quantify microvascular flow from high speed capillary flow image sequences, we developed STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) software. Across the full image field and over time, STAFF evaluates flow velocities and generates a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses.

微小血管系におけるフィールドワイズフローの空間時間解析

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

リアルタイムの生体内多光子顕微鏡で、血液脳関門透過性を高める、集中超音波治療とマイクロバブル治療を可視化

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the dynamic properties of the cytoskeleton. This protocol offers a technique for human primary fibroblast transfection, which can be difficult because of the specifics of primary cell cultivation conditions. Additionally, cytoskeleton dynamic property maintenance requires a low level of transfection to obtain a good signal-to-noise ratio without causing microtubule stabilization. It is important to take measures to protect the cells from light-induced stress and fluorescent dye fading. In the course of our work, we tested different transfection methods and protocols as well as different vectors to select the best combination of conditions suitable for human primary fibroblast studies. We analyzed the resulting time-lapse videos and calculated microtubule dynamics using ImageJ. The dynamics of microtubules' plus-ends in the different cell parts are not similar, so we divided the analysis into subgroups - the centrosome region, the lamella, and the tail of fibroblasts. Notably, this protocol can be used for in vitro analysis of cytoskeleton dynamics in patient samples, enabling the next step towards understanding the dynamics of the various disease development.

This protocol is dedicated to the microtubule plus-end visualization by EB3 protein transfection to study their dynamic properties in primary cell culture. The protocol was implemented on human primary skin fibroblasts obtained from Huntington's disease patients.

ヒト原発性皮膚線維芽細胞に基づくハンチントン病モデルにおける微小管プラスエンドダイナミクスの可視化

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

ダイナミックカルシウムの自動分析<sup&gt; 2 +</supイメージシーケンス内の&gt;の信号

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

の開発と特性評価<em&gt;インビトロ</em&gt;微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の[Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt;私</sub&gt;と一酸化窒素の生産

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...