Die Autoren möchten die interdisziplinäre Innovation Initiative Program der Universität von Illinois bestätigen, gewähren 12035. SK wurde UIUC von National Science Foundation (NSF) Zuschuss finanziert 0.965.918 IGERT: Ausbildung der nächsten Generation von Forschern in Zelluläre und Molekulare Mechanik und Bio-Nanotechnologie.

Herstellung und Funktionalisierung von PA-Gelen unterschiedlicher Steifigkeiten mit fluoreszierenden Mikrosphären in der Nähe der Zellkulturoberfläche eingebettet. 1. Funktionalisierung der Top Glasplättchen <ol><li> Saubere Glasdeckgläschen (# 1.0, 12 mm Durchm.) Mit Wasser und Seife, gefolgt von Ethanol zu Fremd Staub zu entfernen. </li><li> Ort Glasplättchen auf einer geriebenen Oberfläche (dh Pipettenspitzenhalter), so dass sie sich nicht berühren, um eine einfache Interaktion mit den Deck erleichtern. </li><li> Beschichten der gesamten Oberfläche der Deckgläser mit Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml) für 1 h (1A). </li><li> Während dieser Zeit führen eine 1: 10.000-Verdünnung der kolloidalen Lösung von 0,1 um Durchmesser, rot fluoreszierenden Mikrokügelchen mit deionisiertem (DI) Wasser, um eine Partikeldichte von ungefähr 1 Mikrokügelchen pro 20 um 2 auf der Gel-Oberfläche zu erhalten. Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse von verschiedenen Verdünnungen. Diese dilution modifiziert werden, um die Notwendigkeit spezieller Experimente gerecht werden. </li><li> Legen Sie die verdünnte Lösung in einem Ultraschall-Wasserbad für 30 min. </li><li> Nach 1 Stunde, mit einer Pinzette vorsichtig anheben jedes Deckglas und mit Luft trocknen. Bringen Sie die trockenen Deckgläser an den Gitteroberfläche. </li><li> Entfernen Sie die verdünnte Kolloidlösung aus dem Ultraschallbad und Pipette 150 ul auf jedes Deckglas. Lassen Sie für 10 Minuten (Abbildung 1B). </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig anheben jedes Deckglas und mit Luft trocknen. Rückkehr des trockenen Deckgläser an den geriebenen Oberfläche und dunkel lagern, bis sie verwendet. </li></ol> 2. Vorbereitung PA Gel direkt auf dem Glasbodenpetrischalen <ol><li> Vorheiz Heizplatte auf 100 ° C. </li><li> Legen Sie die gewünschte Anzahl der Glasboden-Petrischalen (35 mm-Schale mit 14 mm Mikro gut, # 1.0) auf einer ebenen Fläche in einem Laborabzug. </li><li> Decken Sie die Glas Teil jeder Petrischale Mikro gut mit 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane (3-APTES) für 7 min für die chemische Aktivierung. Vorsicht geboten, um ein unbeabsichtigtes Heraustropfen von 3-APTES auf die Oberfläche des Kunststoffs in der Petrischale zu vermeiden, um den Abbau des Polystyrols zu verhindern. </li><li> Nach 7 min, füllen Sie die Petrischale mit DI-Wasser und in den Abfallbehälter zu entsorgen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.4 3x für jedes Gericht, und dann schütteln Sie die Petrischale, um zusätzliche Wasser zu entfernen. Legen Sie die Petrischalen auf der heißen Platte, bis das Glasteil trocken ist. </li><li> Entfernen Sie die Petrischalen von der heißen Platte und zu einer ebenen Fläche in einem Laborabzug. </li><li> In einer chemischen Abzugshaube, machen eine Lösung von 0,5% Glutaraldehyd und decken das Glasteil jeder Petrischale gut mit der Lösung für 30 min. Vorsicht geboten, um ein unbeabsichtigtes Heraustropfen von Glutaraldehyd auf die Oberfläche des Kunststoffs in der Petrischale zu vermeiden, um den Abbau des Kunststoffs zu vermeiden. </li><li> Nach 30 min, füllen Sie die Petrischale mit DI-Wasser und entsorgen in den Abfallbehälter zu spülen und entfernen Sie die glutaraldehyde. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.4 3x für jedes Gericht, und dann schütteln Sie die Petrischale, um zusätzliche Wasser zu entfernen. Legen Sie die Petrischalen auf der heißen Platte, bis das Glasteil trocken ist. </li><li> Vor dem Vermischen der Komponenten des PA-Gel-Lösung, bewegen Sie die funktionalisierte Glasträger in die chemischen Abzugshaube, so dass sie leicht zugänglich sind, so dass für die schnelle sandwich des Gels mit dem Glasbodenpetrischalen nach dem Mischen der Gel-Lösung. </li><li> In ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen, mischen 40% Bisacrylamid, 2% Acrylamid und Acrylsäure unmittelbar nacheinander in den in Tabelle 1 aufgeführten Konzentrationen (von 10 veröffentlichten Protokoll angepasst), um die gewünschte Matrix Elastizität zu erzielen. </li><li> Mit 100 mM HEPES, 10% Ammoniumpersulfat und TEMED in den in Tabelle 1 aufgeführten Mengen, die gewünschte Elastizität, um den Matrix-Gel-Lösung zu vervollständigen. </li><li> Unmittelbar pipettiert 15 ul Gel-Lösung auf die Mitte des Glasteilsder Petrischalen. </li><li> Sofort abholen eine funktionalisierten Deckglas mit einer Pinzette. <ol><li> Flip das Deckglas über, so dass die fluoreszierende Kügelchen sind auf der Seite Kontakt mit Gel-Lösung. </li><li> Lag das Deckglas vorsichtig auf die Oberseite des jetzt Flüssigkeit PA-Gel, so dass die funktionalisierte Seite ist in Kontakt mit dem Gel (Abbildung 1C). Hinweis: Die besten Ergebnisse wird eine zweite Person für die Rolle der Zugabe des Deckglases, um die Möglichkeit der teilweisen Polymerisation zu vermeiden, während Pipettieren Flüssigkeit PA-Gel-Lösung auf mehrere Petrischalen empfohlen. </li></ol></li><li> Flip alle Petrischalen über mit der Vermeidung von Schwerkraft Auswirkungen auf fluoreszierende Nanopartikel Polymerisation in unteren Ebenen der PA-Gel unterstützen. </li><li> Warten Sie mindestens 35 Minuten, oder bis der Stammlösung von PA-Gel hat sichtlich in seiner Zentrifugenröhrchen polymerisiert. </li><li> Drehen Sie die Petrischalen wieder um und füllen sie mit PBS, um mit dem Entfernen der Deckglas zu unterstützen. </li><li> Kontakt mit dem Glasteil der Petrischale und der Außenlinie des Deckglas sorgfältig zu machen, mit einer Pinzette, um den Umfang des Deckglases zu kratzen. Führen mehrere Zyklen, bis das Deckglas verdrängt wird. Entfernen Sie das Deckglas und entsorgen in einem richtigen Abfallbehälter für spitze Gegenstände. </li><li> Nach Entfernen aller Deckgläser, werden fluoreszierende Kügelchen auf das Gel (Abbildung 1D) übertragen haben. Decken Sie die PA-Gelen vollständig mit PBS, legen Sie die Petrischale Deckel auf jedes Gericht, und bei 4 ° C. </li></ol> 3. Funktionalisierung PA-Gel mit Fibronektin <ol><li> Bereiten Sie die folgenden vorgemischte Lösungen wie in einem festgelegten Protokoll 11 beschrieben: Weichen-Lösung (137 mM NaCl, 5% (v / v) Glycerin) und 2x Konjugation Puffer (0,2 M 2 (N -morpholino) ethansulfonsäure (MES), 10 % (v / v) Glycerol, pH 4.5). </li><li> Verwenden Sie eine Vakuumpumpe in einem biologischen Haube, alle PBS aus den Glasboden-Gerichte, die die PA-Gelen zu entfernen. </li><li> Pipettete einweichen Lösung auf jedes Gel, so dass das Gel vollständig untergetaucht. Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde. </li><li> Warm 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) und N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) auf Raumtemperatur. </li><li> Mischen 10x Lösungen von EDC (150 mm, 19 mg / ml in DI-Wasser) und NHS (250 mm, 29 mg / ml in DI-Wasser). </li><li> 1 Teil 10x EDC, 1 Teil 10x NHS, 3 Teile DI-Wasser und 5 Teile 2x Konjugationspuffer. </li><li> Verwenden Sie eine Vakuumpumpe in einem biologischen Haube, um die Eintauchlösung zu entfernen. Sicherstellen, dass alle Flüssigkeit aus dem Gel Oberfläche entfernt. </li><li> Fügen Sie genug NHS / EDC-Lösung, um das Gel Oberfläche bedecken und füllen Sie den Glasboden und der Petrischale (150-250 ul). Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln. </li><li> Tau-Fibronektin bei Raumtemperatur. Einmal aufgetaut, mischen sterile DI-Wasser, ein 50 ug / ml Fibronektin-Lösung zu erstellen. </li><li> Verwenden Sie eine Vakuumpumpe in einem biologischen Kapuze, die NHS / EDC Lösungen entfernention. Sicherstellen, dass alle Flüssigkeit aus dem Gel Oberfläche entfernt. </li><li> Jeweils 150 ul Fibronectin-Lösung zu jeder Gel. Inkubieren bei Raumtemperatur für 35 min, um für die Befestigung von Fibronektin ermöglichen. </li><li> Nach 35 min, fügen PBS zu jeder Petrischale und bei 4 ° C bis zu 2 Wochen. </li></ol> 4. Traction Force-Experimente <ol><li> Wärmezelle Medien, PBS und Trypsin zu 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Spülen Gele 5x mit sterilem PBS, Absaugen des PBS zwischen Spülungen, und lassen Sie in der Haube bedeckt. </li><li> 1 ml Trypsin pro 25 cm 2-Kolben mit Zellen. Nachdem die Zellen aus Kolben angehoben, verdünnt das Trypsin mit Zellmedium und zählen Sie die Zellen. Basierend auf Gel-Oberfläche, bestimmt die Anzahl der Zellen pro Gel für eine endgültige Zellaussaatdichte von 3.000 Zellen / cm 2 erforderlich. Verdünnen oder zu konzentrieren Suspension, so daß 150 ul der Zellmediengemisch enthält diese Anzahl von Zellen. Aliquoten 150 ul Zell suspensIons auf jedem Gel. </li><li> Platzieren Sie die Petrischalen, die Zellen in einem Inkubator für 30 min. Dann vorsichtig die Petrischalen und füllen den Rest der Petrischale mit den Medien (ca. 2 ml), so dass die Oberfläche der Schale vollständig eingetaucht ist. </li><li> Legen Sie die Petrischalen wieder in den Inkubator, bis der Bildaufnahme. </li><li> Bereiten Sie das Mikroskop und Datenerfassungssystem für die Bildgebung: Legen Sie die 40x Wasserimmersionsobjektiv, legen Sie die Differentialinterferenzkontrast (DIC) Prisma, wählen Sie die mCherry oder gleichwertige fluoreszierend Filter, und schalten Sie die Klimakammer. </li><li> Wenn für die Bildgebung vorbereitet, entfernen Sie eine Petrischale aus dem Inkubator und legen Sie sie sanft auf den Mikroskoptisch. Entfernen Sie die Petrischale Deckel für DIC-Bildgebung. </li><li> Suchen Sie eine einzelne Zelle und erfassen ein einzelnes Standbild von der Zelle an der DIC. </li><li> Ohne den Mikroskoptisch, schalten Sie den Aufnahmemodus zur Fluoreszenz. Konzentrieren Sie sich auf die fluoreszierenden Mikrosphären und record ein Bild der Mikrokügelchen. </li><li> Zellmedien vorsichtig aus der Petrischale mit einer Pipette und fügen Sie 0,05% Trypsin-EDTA. </li><li> Bild die Mikrosphären unter der Zelle, nachdem die Zellen abgelöst. </li><li> Verwendung Particle Image Velocimetry (PIV)-Analyse in ImageJ 12, um den Verschiebungsfeld aufgrund zellulärer Kräfte zu berechnen. </li></ol>

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	<li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. 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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Bei Verwendung dieser Technik ist es wichtig, dass der Wulst Lösung wird auf geeignete Weise verdünnt, und die Perlen werden auf der Basis gewünschten Durchmesser gewählt, PA Gelsubstrat Steifigkeit und der Größenskala der Phänomene, die in der gewünschten Experiment untersucht wird. Vorsicht ist bei der Verdünnung der Lösung vor der Wulst Funktionalisierung oberen Glasplättchen genommen werden. Der Abstand zwischen den Wülsten auf der Gel-Oberfläche kann durch Veränderung der ...

Die mechanische Interaktion einer lebenden Zelle mit seinem lokalen Umfeld hat gemeinhin mit PA-Gele untersucht. Diese Substrate basieren auf einem einfachen, gut charakterisierten Protokoll von Dembo Wang 1997 1. Einer der Hauptvorteile dieser Substrate aufgebaut ist, dass ihre Steifigkeit kann durch Änderung der Konzentration bestimmter Bestandteile des Gel-Lösung eingestellt werden. Dies bietet eine Plattform, um Zellen wünschenswert &#39;Interaktion mit Umgebungen von unterschiedlichen Steifigkeiten zu studieren. Bei PA-Gele werden mit der extrazellulären Matrix (ECM) Proteinen beschichtet, Zellen haften an ihnen, Krafterzeugung. Als Ergebnis der Zellkraft, verformt sich das Gel als ein elastischer Körper. Diese Verformung ist abhängig von der Größe des durch die Zellen und die elastischen Eigenschaften des Gels aufgebrachte Kraft. Verschiedene Studien haben PA-Gele eingesetzt, um zelluläre Traktionskräfte zu untersuchen. In einer Variation des PA-Gel Herstellung werden fluoreszierende Mikrosphären (Beads) eingebettet tberall das Gel auf Zell Zugkräfte auf Gelen unterschiedlicher Steifigkeiten 2 zu quantifizieren. Nach Zellkraftanwendung, verdrängen die Perlen von ihrer ursprünglichen Lage nach Gel Deformation. Das Feld Verformung der einzelnen Wulst Verschiebungen gemessen. Diese Verformung Feld wird mit Elastizitätstheorie und die elastischen Eigenschaften des Gels, um die Zugkräfte berechnen genutzt. Diese Messungen geben Aufschluss darüber, wie Zellen mechanisch zu erfassen und die Interaktion mit den lokalen Mikroumgebung 3. In vielen weit verbreiteten PA-Gel Herstellungsprotokolle werden die Perlen in der gesamten PA-Gel im flüssigen, nicht polymerisierten Zustand vermischt. Ein vollständig polymerisiert PA-Gel enthält fluoreszierende Kügelchen in seinem Volumen. Bei der Berechnung von Zelltraktionskräfte, sind Perlen die meisten in der Nähe der Gel-Oberfläche (Zell-Substrat-Schnittstelle) überwacht. Die Verschiebungen dieser Kügelchen werden als auf der Zellkulturoberfläche zur Vereinfachung der Kraft auftreten BERECHNUNGn. Die tatsächliche Position der Wülste innerhalb der Tiefe des Gels wird nicht berücksichtigt. Jedoch in einem elastischen Medium (wie PA-Gel), eine Wulst näher zu einem Kraftangriffspunkt bewegt sich mehr als ein Wulst, die weiter von dem Punkt entfernt ist. Somit Behandeln der Verschiebung eines Punktes (am Wulst Position) entfernt von der Oberfläche, wie die an der Oberfläche führt zu einer Unterschätzung der zellulären Zugkräfte. Der Fehlergrad ist abhängig vom Abstand der Schweißraupe an der Oberfläche. Der Fehler kann nicht ohne die Kenntnis der Lage der Wulst geschätzt werden. Der Bedarf für ein einfaches Verfahren, um die Kügelchen in der Nähe des Zellkulturoberfläche beschränkt ist durch einige Techniken angegangen. Eine Möglichkeit ist es, die Dichte der Kügelchen während des gesamten Gels zu erhöhen, so dass es eine ausreichende Zahl der Raupen in der oberen Brennebene, um die Bewegung sehr nahe an der Oberfläche zu messen. Ein weiteres Verfahren beinhaltet den Aufbau eines konfokalen Abbildungskammer zur lebenden Zellen, so daß das Licht vonnur die Perlen in der obersten Bildebene gesammelt 4. Eine andere Methode besteht darin überlagern eine extrem dünne Schicht der PA-Gel mit Perlen auf eine bereits polymerisierte Gel ohne Perlen 5. Ein Nachteil jedes dieser Techniken ist, dass die genaue Lage der Kügelchen in dem Gel nicht bekannt ist. Dies bringt Fehler in die Berechnung der Verschiebungsfeld der Perlen und damit die Berechnung der Zellkräfte. Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Konjugation von Kügelchen auf die Oberfläche eines bereits polymerisiert PA-Gel mit Sulfo-SANPAH 6. Diese Technik gewährleistet die Kügelchen sind in der Tat nur auf der Oberseite des PA-Gel, aber das Ausmaß, in dem sie in der Tiefe des Gels eingebettet sind, ist unbekannt. Dies könnte möglicherweise eine lokale Topographie für die Zellen, die das Zellverhalten verändern könnte, als vor der Arbeit hat vorgeschlagen, dass Zellen können mehrere Mikrometer Kraft weg 7 zu spüren. Kürzlich wurde eine Technik zum Mustern PA-Gelen mit 1 um Durchmesser fluorescent Fibronektin Punktmarkierungen in einem Array regularisiert wurde 8 etabliert. In diesem Fall wird die Tiefe der Fluoreszenzmarker bekannt, und ist im wesentlichen Null, da die Fibronektin Muster indirekt auf die Gel-Oberfläche gedruckt. Allerdings ist dieses Verfahren nicht eine kontinuierliche Umgebung, in der Zellen zu befestigen, wie das ECM-Protein ist mit 1 um Durchmesser Dots begrenzt. Ein Verfahren zum Tracker Perlen vollständige Integration in PA-Gelen und beschränken sie auf einem bekannten Ort ganz in der Nähe der Oberfläche muss noch erarbeitet werden. Hier entwickeln wir eine Technik, um ein um bis um Durchmesser fluoreszierende Kügelchen zu einer Brennebene in der Nähe des Zellkulturfläche innerhalb PA-Gel zu beschränken. Ein Gel wird typischerweise durch Anordnen unpolymerisierten flüssigen Gel-Lösung zwischen zwei Glasplatten gehärtet. Eine der Platten wird funktionalisiert, so dass das Gel haftet stark zu. Die andere ist nicht funktionalisierten und nach der Gel härtet entfernt. Wir ändern dieses abnehmbare Glas sun-Schnittstelle durch Beschichten mit einer Schicht von Perlen. Auf, zwischen denen die flüssige Gel zwischen der funktionalisierten und dem Wulst beschichtete Glasoberfläche, die Perlen Transfer auf das Gel, während es der Aushärtung. Dies begrenzt die Entfernung der Perlen &quot;Integration in das Gel in 1,6 um der Oberfläche. Glasbodenpetrischalen werden als Haftgrund, auf dem das Gel ausgehärtet wird verwendet. Um einen flachen oberen Gel-Oberfläche während der Polymerisation zu bilden, ist eine kreisförmige Deckglas zu Sandwich verwendet das Gel mit dem Glasbodenpetrischale. Gel vor der Herstellung wird die obere Deckglas mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichtet, wodurch eine positive Oberflächenladung. Die PDL wird mit Druckluft ausgeblasen, und eine Lösung von Perlen in Wasser auf die Deckgläser aufgebracht. Wir nutzen carboxylierten fluoreszierenden Mikrokügelchen, die eine negative Ladung tragen, und interagieren mit der positiv geladenen Oberfläche erstellt durch Behandlung mit PDL. Nach dem Ausblasen des Wulstes Lösung aus dem Deckglas mit Druckluft, eine einzelne Schicht ausPerlen bleibt elektrostatisch auf die Trockendeckglas verbunden. Der PDL-Beschichtung beeinträchtigt nicht die Haftung des Glases an der Geloberfläche, da die Glas-Objektträger nicht beschädigt und der PA-Gel vollständig intakt entfernt. Die Glasbodenpetrischalen werden adhärenten durch Behandlung mit 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane und 0,5% Glutaraldehyd gemacht. PA-Gelen gewünschten Steifigkeiten werden durch Mischen von geeigneten Konzentrationen von Bisacrylamid und Acrylamid über ein Standard-Verfahren 9 erstellt. Ein Tropfen des Gels Lösung wird auf die Glasbodenpetrischale pipettiert. Das Deckglas, das die Kügelchen nach Sandwich verwendet das Gel mit der Petrischale. Wenn das Gel ausgehärtet ist, wird die obere Deckglas so dass die Kügelchen in der PA-Gel innerhalb 1,6 um von der Oberfläche entfernt eingebettet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">70% Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>111-30-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">1M HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">2% Bisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fibronectin, Human, 1mg</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0700</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Acrylic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>147230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-14-1-N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glass cover slips, 12 mm diam.</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26023</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy

PA Gele sind seit langem als Plattform, um die Zell Zugkräfte aufgrund der Herstellung und der Möglichkeit, sowohl ihre elastischen Eigenschaften zu erleichtern Studie verwendet worden. Wenn das Substrat mit einem extrazellulären Matrixprotein beschichtet ist, Zellen haften an dem Gel und gelten Kräfte, wodurch das Gel zu verformen. Die Verformung ist abhängig von der Zell Traktion und die elastischen Eigenschaften des Gels. Wenn der Verformungsbereich der Oberfläche bekannt ist, kann unter Verwendung von Oberflächentraktionselastizitätstheorie berechnet werden. Gel Verformung wird üblicherweise durch die Einbettung von fluoreszierenden Marker Perlen gleichmäßig in das Gel gemessen. Die Sonden zu verdrängen, wie das Gel verformt. Die Sonden in der Nähe der Oberfläche des Gels nachgeführt. Die von diesen Sonden berichtet Verschiebungen werden als Oberflächenverschiebungen berücksichtigt. Deren Tiefe von der Oberfläche, werden ignoriert. Diese Annahme stellt Fehler in Zugkraft Auswertungen. Für die präzise Messung von Zellkräften, ist es entscheidend für die Lage der Kugeln bekannt sein. Wir haben uns entwickelteine Technik, einfache Chemie verwendet, um fluoreszierende Markierungsperlen, 0,1 und 1 um Durchmesser zu beschränken, in PA-Gelen, innerhalb 1,6 um von der Oberfläche. Wir Mantel eine Deck mit Poly-D-Lysin (PDL) und fluoreszierenden Beads. PA-Gel-Lösung wird dann zwischen dem Deckglas und einem haftenden Oberfläche angeordnet ist. Die fluoreszierende Kügelchen Transfer zum Gel-Lösung während der Aushärtung. Nach der Polymerisation enthält das PA-Gel fluoreszierende Kügelchen in ein Flugzeug in der Nähe der Gel-Oberfläche.

Konfokale Bildgebung wurde verwendet, um festzustellen, dass die Perlen waren in der Tat unter der Gel-Oberfläche und ihre genaue Position innerhalb des Gels Tiefe zu quantifizieren. Fluoreszierende Kügelchen mit einer anderen Wellenlänge als die im Inneren des Gels ließ man auf der Oberfläche absetzen, und der Abstand zwischen den eingebetteten fluoreszierenden Nanopartikeln und die auf der Oberfläche wurde unter Verwendung eines Schwerpunkts Identifikationsalgorithmus. Die Lage des Wulstes auf der Gel-Oberfläch...

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A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Traditionelle Techniken zur Herstellung Polyacrylamid (PA)-Gelen, die fluoreszierenden Sonden beinhalten, zwischen denen ein Gel zwischen einem haftenden Oberfläche und einem Glasträger. Hier zeigen wir, dass die Beschichtung diese Folie mit Poly-D-Lysin (PDL) und fluoreszierende Sonden lokalisiert die Sonden innerhalb von 1,6 um von der Geloberfläche.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K Aufrufe.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Traditionelle Techniken zur Herstellung Polyacrylamid (PA)-Gelen, die fluoreszierenden Sonden beinhalten, zwischen denen ein Gel zwischen einem haftenden Oberfläche und einem Glasträger. Hier zeigen wir, dass die Beschichtung diese Folie mit Poly-D-Lysin (PDL) und fluoreszierende Sonden lokalisiert die Sonden innerhalb von 1,6 um von der Geloberfläche. 

Serie: A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Forschung

Biotechnik

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Oberflächenpotentialmessung von Bakterien mit Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

Herstellung und Implementierung einer referenzfreien Traktionskraftmikroskopie-Plattform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

Traktionskraftmikroskopie zur Untersuchung der B-Lymphozytenaktivierung

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Gleichzeitige Quantifizierung ausgewählter Kynurenine, analysiert durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Anwendung der Atomkraftmikroskopie zur Erkennung früher Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...