We would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher, Alexander Boes and Veronique Bei&#223; for providing the transgenic tobacco seeds, and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. The authors wish to thank Dr. Richard M. Twyman for editorial assistance as well as G&#252;ven Edg&#252; for providing the MSP1-19 reference. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ''Future-Pharma'', proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.

1. 담배 식물 육성 <ol><li> 0.1 % [w / V] 비료 용액을 1 L로 1 탈 이온수 2 L이어서 각 미네랄 울 블록 플러시. 하나 담배 각 미네랄 울 블록의 씨앗과 씨앗 (16)을 멀리 세척하지 않고 비료 용액 0.25 L와 부드럽게 높이를 놓습니다. </li><li> 70 %의 상대 습도와 온실에서 16 시간의 광주 칠주에 대한 담배 식물 육성 (- 1m - 180 μmol 초 2, λ = 400-700 nm의)과 22분의 25 ℃로 빛 / 어둠 온도 정권. </li><li> 식물 줄기의 기지에있는 네 개의 자엽 잎을 제외한 모든 잎을 수확. </li></ol> 2. 선택 사항 : 열 강수량 표백제로 참고 : 창백하여 담배 HCP가 석출하기 위해 2.12에 단계 2.1 설명 된 단계를 수행합니다. HCP가이 침전 될 경우, 전체 섹션이 건너 뛰기가열 된 용기 (4 절) 또는 열교환 기 (섹션 5)를 사용한다. <ol><li> 식물 재료의 옆 50g을 설정하고 (3 장)를 희게하지 않고 추출을 실시한다. 이후 분석 (7) 동안 내부 통제로이 추출물의 샘플을 가져 가라. </li><li> 열 절연 발포 폴리스티렌 통 또는 이와 유사한의 8 L 작업 볼륨 수조, 예를 들면, 50 X 40 X 40cm를 설정합니다. 이후의 온도 제어 (단계 2.7)의 물을 욕조에 조정 가능한 온도 조절기를 탑재합니다. </li><li> 자기 볶음 접시에 전체 어셈블리를 전송하고 수조에서 자기 교반 막대를 배치합니다. 자기장은 교반 막대를 회전하기에 충분히 강한 지 확인합니다. </li><li> 폴리 프로필렌 바구니 (단계 2.6)이 창백 과정에서 나중에 배치 될 때 적어도 네 개의 지원 타일로 교반 막대를 둘러싸고 있습니다. 서포트 타일은 비자 성 재료 (예를 들어, 스테인리스 스틸 합금, 니켈 함유)로 제조되어 있는지, 그들이스터 바 (그림 2)보다 높다. </li><li> 수조에 탈 이온수 8 L을 추가합니다. 주 :. 낮은 pH 석출이 문제가되는 경우, 버퍼를 사용하여 예를 들어, 50 mM 인산 나트륨 (PH 7.5), 표적 단백질의 수율을 향상시킬 수있다. </li><li> 지원 타일에 23 X 23 X 23cm 폴리 프로필렌 바구니를 놓고 바구니가 교반 막대 회전을 방해하지 않도록하고 완전히 액체에 잠긴된다. 필요한 경우, 상기 바스켓이 완전히 잠길 때까지, 다시 바스켓을 제거 부가 물 / 버퍼를 추가한다. 주의 : 2.12까지 이후의 모든 단계는 뜨거운 액체의 처리를 포함한다. 열 절연 장갑을 포함하여 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. </li><li> 70 ° C (또는 실험에 필요한 온도)에 수조를 가지고 조정 가능한 온도 조절기를 사용합니다. 원하는 온도가 화력에 도달 전체 조립을 보장하기 위해 도달 한 후 적어도 15 분을 기다립니다리터 평형. </li><li> 수확 된 담배 잎에서 150g 씩 준비. 찢어에 의해, 예를 들면 돌이킬 수없는 압축 및 잎의 손상을 피하면서 바구니에 하나 나누어 놓습니다. 식물 재료 또는 후자의 조밀 한 포장 바구니를 과도하게 채워지지 않도록합니다. </li><li> 조심스럽게하지만 빠르게 뜨거운 액체에 바구니 잠수함과 지원 타일에 놓습니다. 부상을 방지하기 위해 바스켓의 상부에 스테인레스 스틸 블록을 놓는다. </li><li> 창백 유체의 5 분의 잎을 품어, 또는 시간 실험 설계를 양복지를 선택합니다. 전 배양 기간 동안 상기 액체의 온도를 모니터한다. </li><li> 조심스럽게 창백 유체에서 바구니를 제거하고 30 초 동안 잎에서 잔류 액의 배출을 할 수 있습니다. 그런 식물이 바구니의 잎 걸릴 블렌더로 전송하고 즉시 추출 (3 절)를 시작합니다. 주 : 식물 희게 후 번째의 개시 전에 장시간 동안 유지 될 수있다전자 추출, 예를 들어, 30 개 이상의 얼음에 분 또는 몇 주 동안 -20 ℃에서 냉동이 성공적으로 테스트되었습니다. 그러나, 제품의 안정성은 저장 시간을 증가시키고, 따라서 즉시 처리가 권장으로 거부 할 수 있습니다. </li><li> 전체 수확 바이오 매스가 처리 될 때까지 반복 신선한 잎 재료로 2.11-2.8 단계를 반복합니다. </li></ol> 담배 잎 3. 단백질 추출 주의 : 다음 단계는 블레이드를 회전 믹서를 포함한다. 이 믹서 모터에 장착되는 동안 믹서 통에 작동하지 않습니다. <ol><li> 수확 (단계 1.3) 또는 연한 (단계 2.11)의 150g (젖은 질량)을 배치 믹서 잎 추출 완충액 (50 mM의 인산 나트륨, 500 mM 염화나트륨, 10 mM의 나트륨 디술, 산도 8.0) 450 ml에 추가 할 수 있습니다. 참고 : 추출 버퍼 조성물을 추출 할 수있는 단백질에 의존하여 다른 pH를 예를 들어, 조정, 사용을 필요로하거나 TR로 구성 요소를 버퍼링 할 수 있습니다이다. </li><li> 30 초는 휴식을 산재로 3 × 30 초 펄스의 잎을 균질화. 잎이 균질화하고 블렌더 버킷을 방해하지 않도록해야합니다. 믹서기를 중지하고 필요한 경우 막힘을 방지하기 위해 잎을 들어 올린 다음 균질화를 계속합니다. </li><li> 이후 분석 (7) 용으로 제작 된 각 추출물의 1 ml의 샘플을 가져 가라. 식물 재료를 희게하는 경우, 그렇지 않으면 선택한 실험 방법에 따라 용기에 열 강수량 (4 장) 또는 열교환 기 (섹션 5) 계속 부 (6)를 계속합니다. </li></ol> 4. 선택 사항 : 열 강수량 교반 용기에 주 : 교반 용기에 담배 HCP가 석출하기 위해 4.11에 섹션 4.2에 설명 된 단계를 실시한다. HCP가가 (2 절)를 희게하여 침전 된 또는 열교환 기 (섹션 5)을 사용하여 침전 될 경우, 전체 부 (4)를 건너 뜁니다. <ol><li> 2 개의 8-L 작업 다량의 물을 설정화장실, 예를 들어, 단열 스티로폼 또는 유사한 50 X 40 X 40cm. 첫 번째 목욕, 이후의 온도 제어 (단계 4.6)에 대한 조정 가능한 온도 조절기를 탑재합니다. 두 번째에서, 탈 이온수 5 L 이후 냉각 (단계 4.9) 얼음의 2kg을 추가합니다. </li><li> 자기 교반 플레이트 위에 제 수조로 이동하고, 용기의 중심이 교반 판의 중앙에 정렬되도록 수조에 2 L 스테인레스 스틸 용기를 배치했다. </li><li> 스테인레스 스틸 용기에 자기 교반 막대를 놓습니다. 자기장은 교반 막대를 회전하기에 충분히 강한 지 확인합니다. </li><li> 스테인레스 강 용기의 상부 에지 아래 5cm 탈 이온수로 물 중탕을 채운다. 그런 다음 추출 버퍼 용기를 입력합니다. 용기에 스티로폼 뚜껑을 놓습니다. 주의 : 4.9까지 이후의 모든 단계는 뜨거운 액체의 처리를 포함한다. 열 기능을 포함하여 적절한 개인 보호 장비를 착용ulated 장갑. </li><li> 폴리스티렌 발포체 뚜껑의 구멍을 통해 양복지 스테인리스 용기 내로 체온계를 삽입한다. 78 ° C의 물 중탕 온도를 설정하고, 열 평형에 도달하기 위해 15 분 동안 전 배양 한 조립체. 용기의 온도가 70 ° C의 물을 욕조의 세트 포인트 아래 약 8 °의 C 있는지 확인하십시오. </li><li> 스테인레스 강 용기의 온도가 70 ° C 다르면, 수조의 온도를 적절하게 조절하고 시스템이 또 다른 15 분 동안 평형을 보자. 용기의 온도가 70 ℃가 될 때까지 또는,​​ 실험에 필요한이 단계를 반복하고, 스테인리스 용기를 비우고. </li><li> 이 수조에있는 동안 스테인레스 스틸 용기로 추출한다 (단계 3.2) 300 ㎖에 붓고 타이머를 시작한다. 150 rpm에서 추출물을 약동하고 5 분 동안 품어. 추출물이 배양 기간 동안 적어도 2 분, 70 ° C의 온도에 도달 할 것을 보장한다. </li><li>, 자석 교반기에서 온수 목욕을 제거 스테인레스 스틸 용기를 꺼내 얼음처럼 차가운 통에 넣습니다. 자석 교반기에 후자를 놓고 스티로폼 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 식물 파쇄 잘 150 rpm에서 교반되는 것을 확인 추출물에 온도계를 배치하고 20 ° C의 온도 또​​는 실험 디자인에 의해 특정 온도에 도달 할 때까지 배양한다. </li><li> 반복 4.7 모든 분취 4.9 단계를. 각 열을 1 ml의 샘플을 취하면 다음 섹션 6을 진행, 최종 온도에 도달하면 추출 침전. </li></ol> 5. 선택 사항 : 열교환 기에서 열 강수량 주 : 열 교환기를 사용하여 담배 HCP가 석출하기 위해 5.2 5.12 절에 설명 된 단계를 실시한다. HCP가가 (2 절)를 희게하거나 가열 된 용기 (4 절)에 침전 된 경우, 전체 섹션 5를 건너 뜁니다. <ol><li> 2 개의 8-L 가공 볼륨을 설정합니다물 목욕, 예를 들어, 열 절연 발포 폴리스티렌 버킷 또는 유사한 50 X 40 X 40cm. 첫 번째 목욕, 이후의 온도 제어 (단계 5.3)에 대한 조정 가능한 온도 조절기를 탑재합니다. 두 번째에서, 탈 이온수 5 L 이후 냉각 (단계 5.10) 얼음의 2kg을 추가합니다. 주의 : 5.9까지 이후의 모든 단계는 뜨거운 액체의 처리를 포함한다. 열 절연 장갑을 포함하여 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. </li><li> 8 L 탈 이온수로 첫 번째 수조를 입력합니다. 온도 조절 장치를 사용하여 74.5 ° C로 온도를 설정합니다. 열 평형에 도달하는 15 분 동안 어셈블리를 품어. </li><li> 1-L 플라스틱 비커에 0.5 L 플라스틱 비커를 배치하여 절연 된 저장 용기를 준비하고 탈지면과 격차를 입력합니다. 또한, 0.5 L의 작업 볼륨으로 전용 단열 용기를 사용합니다. </li><li> 일단과 인접 콘센트 호스 연동 펌프에 열 교환기를 연결R L / S (24) 튜브를 사용하여 종료. 두 튜브는 절연 된 저장 용기에 온도계와 함께 종료 놓고 300 ml의 추출 버퍼 (그림 2)와 함께 입력합니다. </li><li> 온수 욕에 열교환기를 배치하고 300 mL의 분 -1의 속도로 연동 펌프를 시작한다. 선박의 결과 온도가 3 분 후, 70 ° C, 수조의 세트 포인트 아래 약 4.5 ° C인지 확인합니다. </li><li> 절연 된 - 용기의 온도가 70 ° C 다르면 그에 따라 수조의 온도를 조정하고, 시스템을 15 분 동안 평형을 보자. 이하의 3 분에서 70 ° C로 주위에서 추출 완충액의 온도가 증가 될 때까지이 단계를 반복하거나, 실험에 필요한 것 같다 및 스테인리스 용기를 비우고. </li><li> 절연 용기로부터 추출 버퍼를 취소하고 식물 추출물의 300 ml의 분취 량을 준비합니다. 하나 나누어으로 절연 용기를 입력합니다. </li><li> 5 분 동안 분 -1에서 300㎖의 열교환을 통해 식물 추출물 (3.3) 펌프. 추출 온도가 3 분 후 70 ° C, 또는 실험 설계에 정의 된 온도에 해당하는지 확인하십시오. </li><li> 추출액을 계속 펌핑되는 동안 5 분 후, 얼음 냉수 조 내에 열 교환기를 배치했다. 온도가 정확히 20 ° C에 도달하거나, 실험 설계에서 정의 된 온도까지이 설정 부화. </li><li> 절연 된 용기로부터 연동 펌프에 접속되는 급수 호스를 분리하고 열교환 기 내에서 잔열 침전 식물 추출물을 수집하기 위해 펌핑 계속한다. 그런 다음 펌프를 중지합니다. </li><li> 반복 5.7 모든 분취 5.10에 단계를 반복합니다. 그 다음 가방 여과 (6 절)에 추출물에 통과, 최종 온도에 도달하면 각 열 침전 추출물의 1 ml의 샘플을 가져 가라. 참고 : 첫 번째 사이클을 통해 5.10에 5.7 단계 이후에는 추출 버퍼가 없을 것단계 5.7에서 폐기하십시오. </li></ol> 플랜트 추출 6. 가방 여과 <ol><li> 필터 하우징 내로 끼워가요 필터 재료에 대한 기계적지지를 제공하는 대응하는지지 바스켓에 백 필터를 탑재. 바구니 아래에 1 L 용기를 놓고 150 ml의 분 -1의 속도로 가방 (선택한 열처리에 따라 3.3, 4.10 또는 5.11) 추출물의 분취 량을 적용합니다. </li><li> 여과 후, 탁도계를 사용하여 추출 완충액 여액 1:10 희석의 탁도를 측정한다. </li><li> 예를 들면, 깊이 여과 및 크로마토 그래피 7,10를 1 ml의 샘플을 가지고 실험 설계에 정의 된 가방 여과 액을 처리합니다. </li></ol> 7. 샘플 분석 <ol><li> 브래드 포드 (Bradford) 방법 (24, 25)를 사용하여 총 가용성 단백질 (TSP)의 양을 측정한다. <ol><li> 삼중에서, 하나의 웰에 각 샘플 2.5 μL 피펫96 웰 플레이트. 2,000 μg의 ml의 -1 - 범위 0을 포함 세중의 팔 소 혈청 알부민 (BSA) 표준을 포함합니다. </li><li> 거품을 형성하지 않도록 부드럽게 충분히 각 웰에 200 ㎕의 브래드 포드 시약을 추가하고 아래로 pipetting에 의해 철저하게 혼합하지만. </li><li> 22 ° C에서 10 분 동안 품어 분광 광도계로 595 nm에서 흡광도를 측정한다. BSA에 기준점을 통해 표준 곡선에 기초하여 샘플 내의 TSP 농도를 계산한다. </li></ol></li><li> 표면 플라스 몬 공명 분광기 (26)에 의해 정량화 Vax8. <ol><li> 설치 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES)을 실행 완충액으로 표면 플라즈몬 공명 기기 (10 mM의 HEPES, 3mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1,500 mM 염화나트륨, 0.05 % V / V 폴리 소르 베이트 20, 산도 7.4) 장치로 카르복시 덱스 트란 표면에 칩을 탑재합니다. 시스템 플러시 주요한 기능을 사용하고 (30)의 유량을 갖는 수동 실행을 시작할μL 분 -1 플로우 셀 (1) 및 25 mM의 수산화 나트륨 60 초 산재 분사 회 60 초 2.를 주입 30mm의 염화수소 위에. </li><li> 500 μg의 용액 200 ㎕를 -1 단클론 항체 5.2 10 MM의 아세트산 나트륨 (산도 4.0)에서 솔루션을 준비합니다. 해동 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필 ) 카 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC) 및 N의 -hydroxysuccinimide (NHS) 바이알 1 분 동안 16,000 × g으로 원심 분리하여 그들을. NHS의 70 μL와 EDC의 70 μl를 혼합하고 7 mm 플라스틱 병에 전송할 수 있습니다. </li><li> 10 ㎕의 분 -1의 유속으로 10 분 동안 EDC / NHS 유동 세포 하나 이상의 혼합물이 주사하여 카르복시 메틸화 된 덱스 트란 표면 칩 표면을 활성화. </li><li> 셀 2 만 흐름 흐름 경로를 설정합니다. 10 ㎕의 분 -1의 속도로 15 분 동안 주입하여 그것을 몇 단클론 5.2. </li><li> 전지 1 및 2를 흘러 분 -1 표면을 비활성화 5 μL의 속도로 7 분 동안 에탄올을 주입하는 유로 전환. 티암탉 25 mM의 수산화 나트륨 60 초 산재 주입 60 초 동안 두번 30mm의 염화 수소를 주입. </li><li> 30 μL 분의 속도로 19 기준 -1 180 초 - 샘플 및 MSP1을 주입한다. 1000 NG ml의-1 - Vax8 농도가 50 있는지 확인하십시오. HEPES에 미리 희석하여 준비가 필요 EDTA 및 폴리 소르 베이트 20 (HBSEP)를 포함하는 완충 식염수. </li><li> 플로우 셀 (2)의 그것과 플로우 셀 (1)의 피크 신호를 빼고 MSP (1)의 신호에 기초하여 샘플 내의 Vax8 농도 계산의 차이를 사용하여 500 - NG 용액 -1 알려진 단백질 농도 19 주사. </li><li> 30 ㎕의 분의 유속으로 60 초 동안 30mm의 염화 수소에 노출 19 주입 -1 - 각 시료 또는 MSP 한 후의 칩 표면을 재생성. </li></ol></li><li> 형광 분석법으로 정량을 DsRed <ol><li> 세중에서, 검은 반 아칸소의 단일 우물에 각 시료의 피펫 50 μL개 96 웰 플레이트. 225 μg의 ml의 -1 - 범위는 0 다루는 육을 DsRed 기준을 포함합니다. </li><li> 530 ± 30 nm의 여기 필터와, 분광 광도계의 590 ± 35 nm의 방출 필터를 사용하여 중복에서 형광을 측정한다. 을 DsRed 기준점 통해 표준 곡선에 기초하여 상기 샘플을 DsRed의 농도를 계산한다. </li></ol></li><li> 입도 분포의 측정 <ol><li> 1 ml의 이소프로판올로 큐벳을 세척 한 후 탈 이온수 2 ml의 먼지 입자를 제거 할 수 있습니다. 큐벳에 시료 850 μl를 피펫. </li><li> 제타 전위 및 입자 크기 분석기로 큐벳을 놓습니다. &quot;소프트웨어&quot;를 열고 재료로 &quot;단백질&quot;및 분산제와 같은 &quot;PBS&quot;와 수동 측정을 시작합니다. 25 ° C의 온도 및 180 초의 평형 시간을 선택합니다. </li><li> 173 °의 후방 산란에서 &quot;DTS0012&quot;셀 측정을 선택합니다. &quot;자동&quot;(SECURITY) 기능을 비활성화 확인측정 기간 동안 이온없이 산재 지연 3 회 측정을 선택합니다. </li><li> 측정 실험 뷰 샘플의 3 회 측정을 선택하여 완료되면 입도 분포 피크 프로파일을 조사한다. 은 &quot;볼륨 PSD&quot;탭을 선택합니다. </li></ol></li></ol>

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M., Boes, A., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+host+cell+protein+heat+precipitation+step+simplifies+the+subsequent+purification+of+recombinant+proteins+from+tobacco.">Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco.</a> Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+juice+extractor+can+simplify+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins+compared+to+blade-based+homogenizers.">A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers.</a> Process Biochem. 50, 859-866 (2014).</li><li>Beiss, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-precipitation+allows+the+efficient+purification+of+a+functional+plant-derived+malaria+transmission-blocking+vaccine+candidate+fusion+protein.">Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein.</a> Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).</li><li>Ma, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+approval+and+a+first-in-human+phase+I+clinical+trial+of+a+monoclonal+antibody+produced+in+transgenic+tobacco+plants.">Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).</li><li>Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postharvest+treatments+of+fresh+produce.">Postharvest treatments of fresh produce.</a> Philos T R Soc A. 372, (2014).</li><li>Menzel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+blanching+reduces+the+host+cell+protein+content+and+substantially+enhances+the+recovery+and+stability+of+two+plant+derived+malaria+vaccine+candidates.">Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates.</a> Front. Plant Sci. , (2015).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+complex+systems+using+the+design+of+experiments+approach:+transient+protein+expression+in+tobacco+as+a+case+study.">Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study.</a> J. Vis. Exp. , e51216 (2014).</li><li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+to+evaluate+the+efficiency+of+flocculants+for+the+removal+of+dispersed+particles+from+plant+extracts.">Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts.</a> J. Vis. Exp. , e53940 (2016).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).</li><li>Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+models+for+the+accumulation+of+a+fluorescent+marker+protein+in+tobacco+leaves+according+to+the+promoter/5'UTR+combination.">Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination.</a> Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).</li><li>Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+biosensing.">Surface plasmon resonance biosensing.</a> Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).</li><li>Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+behavior+of+proteins:+Heat-resistant+proteins+and+their+heat-induced+secondary+structural+changes.">Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes.</a> Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).</li><li>Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+heat-stable+proteins+in+Escherichia+coli.">Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli.</a> Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).</li><li>Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+in+tobacco+guttation+fluid.">Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid.</a> Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).</li><li>Drake, P. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+rhizosecretion+as+a+production+system+for+recombinant+proteins+from+hydroponic+cultivated+tobacco.">Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco.</a> FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).</li><li>Turpen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+mosaic+virus+and+the+virescence+of+biotechnology.">Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).</li><li>Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Evaluation+of+E1+Endoglucanase+Recovery+from+Tobacco+Leaves+Using+the+Vacuum+Infiltration-Centrifugation+Method.">Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method.</a> Biomed. Res. Int. , (2014).</li><li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numeric+simulation+can+be+used+to+predict+heat+transfer+during+the+blanching+of+leaves+and+intact.">Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact.</a> Biochem. Eng. J. , (2015).</li><li>Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protease+activity+by+antisense+RNA+improves+recombinant+protein+production+in+Nicotiana+tabacum+cv.+Bright+Yellow+2+(BY-2)+suspension+cells.">Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells.</a> Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).</li><li>Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , (1976).</li><li>Lowe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation,+stability,+and+formulation+of+human+antibody+therapeutics.">Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics.</a> Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).</li><li>Gong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+antibody+constant+domains+with+increased+stability.">Engineered human antibody constant domains with increased stability.</a> J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).</li><li>Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+engineering+of+the+human+antibody+repertoire.">Stability engineering of the human antibody repertoire.</a> FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).</li><li>Stabel, J. R., Lambertz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+pasteurization+conditions+for+the+inactivation+of+Mycobacterium+avium+subsp+paratuberculosis+in+milk.">Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk.</a> J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).</li><li>Wichers, H., Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.">Ch. 12.</a> Managing Allergens in Food. , 336 (2006).</li><li>Davis, P. J., Williams, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+modification+by+thermal+processing.">Protein modification by thermal processing.</a> Allergy. 53, 102-105 (1998).</li><li>Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-shock-induced+denaturation+of+proteins.+Characterization+of+the+insolubilization+of+the+interferon-induced+p68+kinase.">Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase.</a> J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).</li></ol>

저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

상기 열 강수량의 세 가지 방법을 효과적으로 모든 크로마토 그래피 정제 단계 (16, 17) 이전에 담배 HCP가 제거 할 수 있습니다. 그들은 예를 들어, 초기 제품 순도, guttation (29), 분비 단백질로 제한됩니다 모두 rhizosecretion 30 원심 추출 (31, 32)을, 증가하는 것을 목표로 다른 전략을 보완합니다. 표적 단백질은 1 개 이상의 분 ~ 60 ° C의 최소의 석출 온도를 ?...

현대 의료 시스템은 점점 바이오 단백질 (1)에 따라 달라집니다. 식물에서 이들 단백질을 생산하는 통상의 발현 시스템 2-4에 비해 낮기 때문에 병원체 부담 더 확장하는 것이 유리하다. 파괴적 추출 절차 탁도 5,000 혼탁 탁도 유닛 (NTUs)를 초과하고, 숙주 세포 단백질 (HCP)의 농도는 종종 95을 초과하는, 높은 입자 부담을 초래하기 때문에, 식물 유래 의약품의 하류 처리 (DSP)가 어려울 수 %의 [m / m] 5,6. 정교한 정화 절차 분산 입자 7-9를 제거하기 위해 필요하지만 크로마토 그래피 장비 HCP에 10,11의 효율적인 제거에 대한 이전 단계가있는 경우 초기 생성물 회수 중에 바인드 - 및 - 용출 모드로 동작하도록 저렴된다. 이것은 floccul를 이용하여 표적 단백질을 침전에 의해 하나를 달성 할 수있다개미 12 낮은 pH 13, 14,뿐만 아니라 HCP가 집계하도록하여. 불로 오스 -1,5- 비스 포스페이트 카르 복실 / 시게나 (RUBISCO), 담배 (된 담배)으로 녹색 식물에서 가장 풍부한 HCP의 선택적 응집은 폴리에틸렌 글리콜 (15)을 첨가하여 촉진하지만, 이것은 고가이고 대형과 양립 할 수있다 -scale 제조. 열처리는 예컨대 Vax8 같은 단백질 말라리아 백신 후보 솔루션 16-18에서 안정적으로 유지하면서, 변성 및 담배 HCP가 95 % 이상을 침전하는 것으로 나타났다. 온도 조절은 혈관을 교반 (II) (I) 희게, 즉 고온의 액체는 그대로 잎의 침지, 및 (iii) 열교환 기 (세 가지 접근법은 담배 HCP에의 열 유도 된 침전을 달성하기 위해 사용 된 그림 1) 16. 그대로 잎의 경우, HCP가의 신속하고 효율적인 침전을 달성하고도 쉬웠다 희게확장 및 식물 바이오 매스 (19)를 세척하는 초기 단계를 포함 기존의 대규모 제조 공정과 호환합니다. 대조적으로, 온도 조절 용기 이미 일부 공정에 사용할 수 있으며 탱크의 표면 대 부피 비율이 점차 감소되기 때문에 식물의 열처리 (20)를 추출하지만, 그 확장 성 및 에너지 전송 속도가 제한되어 사용될 수 있으며 프로세스 규모에 적합하게된다. 열교환 교반 용기를 가열 할 수있는 기술적으로 잘 정의 된 대안이지만 가열 및 냉각 매체, 예를 들면 증기와 냉수의 풍부한 공급뿐만 아니라, 열 ​​교환기 형상에 적응되는 엄격하게 제어 체적 유량을 필요 매체 특성, 예를 들면., 비열. 이 문서는 세 가지 방법이 일반적으로 담배 HCP가, 식물 HCP가의 가열에 의한 침전에 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 설립 및 EAC의 동작실험실 환경에서 H 방식은 대규모 프로세스의 적합성을 평가하기 위해 사용될 수있다. 주요 과제는 공정 규모의 제조시 사용되는 장치 및 조건을 닮은 각 작업에 대한 적절한 스케일 다운 모델과 실행 조건을 확인하는 것입니다. 여기에 제시된 데이터는 DsRed 16 말라리아 백신 후보 Vax8 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 담배 식물 실시한 실험을 참조하지만,이 방법은 성공적 N.에 적용된 benthamiana 식물 일시적 다른 바이오 21 단백질 발현. 디자인의-실험 (DOE는) 공정 개발을 용이하게 할 수있다 (22)에 접근, 이전 8 설명한 바와 같이 (23)는이 상황에서 도움이 될 수 있습니다 응집제. 창백 가열 용기 및 열교환 기의 주요 차이점은 창백 구약 반면 프로세스 초기에 그대로 잎에 적용된다그녀는 식물 추출물 (그림 1)에 적용됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54343/54343fig1.jpg" /> 그림 1 :. 담배 HCP 열 강수량에 대한 세 가지 다른 방법의 구현을 설명 프로세스 흐름 방식은 식물 재료 세척 및 정화 및 정화 전에 균질화한다. 희게 단계 (적색) 용 장비를 쉽게 기존의 장치에 추가 될 수있다. 대조적으로, 교반 용기 (오렌지) 특히 열교환 기 (파란색)를 사용하여 하나 또는 여러 개의 추가 장치 및 배관을 필요로한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54343/54343fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1026">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td style="width:195px;">Hach</td>
			<td style="width:119px;">4650000</td>
			<td style="width:352px;">Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Amine Coupling Kit</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">BR100050&#160;</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Autoclaving basket</td>
			<td style="width:195px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">6917-0230</td>
			<td>Basket for leaf blanching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Bio Cell Analyser BCA 003 R&#38;D with 3D ORM</td>
			<td style="width:195px;">Sequip</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Particle size analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Blender</td>
			<td style="width:195px;">Waring</td>
			<td style="width:119px;">800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">BP-410</td>
			<td style="width:195px;">Furh</td>
			<td style="width:119px;">2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424 000.410</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">2017106</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">CM5 chip</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">BR100012&#160;</td>
			<td>Chip for SPR measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Cuvette 10x10x45</td>
			<td style="width:195px;">Sarsted</td>
			<td style="width:119px;">67.754</td>
			<td>Cuvette for Zetasizer Nano ZS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Design-Expert(R) 8</td>
			<td style="width:195px;">Stat-Ease, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">&#160;4984.3&#160;</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Ferty 2 Mega</td>
			<td style="width:195px;">Kammlott</td>
			<td style="width:119px;">5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Forma -86C ULT freezer</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Greenhouse</td>
			<td style="width:195px;">n.a.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Grodan Rockwool Cubes 10x10cm</td>
			<td style="width:195px;">Grodan</td>
			<td style="width:119px;">102446</td>
			<td>Rockwool block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length)</td>
			<td style="width:195px;">n.a. (custom design)</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Heat exchanger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">9105.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">K200P 60D</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">5302303</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">KS50P 60D</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Lauda E300</td>
			<td style="width:195px;">Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Z90010</td>
			<td>Water bath thermostat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">L/S 24</td>
			<td style="width:195px;">Masterflex</td>
			<td style="width:119px;">SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:360px;">mAb 5.2</td>
			<td style="width:195px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">HB-9148</td>
			<td>Vax8 specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Masterflex L/S</td>
			<td style="width:195px;">Masterflex</td>
			<td style="width:119px;">HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Miracloth</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">475855-1R</td>
			<td>Filter cloth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">MultiLine Multi 3410 IDS</td>
			<td style="width:195px;">WTW</td>
			<td style="width:119px;">WTW_2020</td>
			<td>pH meter / conductivity meter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Osram cool white 36 W</td>
			<td style="width:195px;">Osram</td>
			<td style="width:119px;">4930440</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Phytotron</td>
			<td style="width:195px;">Ilka Zell</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Sodium disulfit</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">8554.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">P029.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:360px;">Stainless-steel vessel; 0.7-kg 2.0-L; height 180 mm; diameter 120 mm</td>
			<td style="width:195px;">n.a. (custom design)</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Container for heat precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Synergy HT</td>
			<td style="width:195px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">SIAFRT</td>
			<td>Fluorescence and spectrometric plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">VelaPad 60</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td style="width:195px;">Malvern</td>
			<td style="width:119px;">ZEN3600</td>
			<td>DLS particle size distribution measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Zetasizer Software v7.11</td>
			<td style="width:195px;">Malvern</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Software to operate the Zetasizer Nano ZS device</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparison of tobacco host cell protein removal methods by blanching intact plants or by heat treatment of extracts

식물은 인간 식품, 사료 원료를 제공 할뿐만 아니라, 항체, 백신 후보로서 바이오 효소 단백질에 대한 경제적 인 생산 시스템으로 개발되었다 아닙니다. 이들은 식물 바이오 매스로부터 정제해야하지만, 크로마토 그래피 단계는 식물 추출물의 숙주 세포 단백질 (HCP가)의 높은 농도에 의해 방해된다. 그러나, 대부분의 HCP가 비가 역적 목적 단백질의 정제를 용이 이후 60 ° C 이상의 온도에서 응집. 여기에, 세 가지 방법은 그대로 잎 또는 추출물 중 하나에서 담배 HCP가의 열 침전을 달성하기 위해 제공됩니다. 그대로 잎의 창백 쉽게 기존 프로세스에 통합 될 수 있지만, 이후 여과 단계에 부정적인 영향을 미칠 수있다. 반대의 경우와 같은 처리 장치의 설계에 큰 변화 불구 하류 작업의 성능을 향상시킬 수있는 교반 용기 잎 추출물의 열 침전 사실이다균질 형상. 마지막으로, 열교환 기 설치 잘 열전달 조건의 관점에서 특성화 스케일 쉽지만 세정 어려울 수 있고, 필터의 용량에 부정적인 영향이있을 수있다. 디자인 수준의 실험 방법을 HCP 제거 및 생성물 회수에 영향을 미치는 가장 중요한 공정 매개 변수를 식별하는데 사용될 수있다. 이것은 다른 식 플랫폼의 각 방법 및 주어진 정제 전략을위한 최적의 방법의 식별의 적용을 용이하게한다.

치면 담배 숙주 세포 단백질의 열 침전 제 2 항에 기재된 희게 절차가 성공적으로 담배는 96 ± 1 %까지 TSP를 감소 70 ° C로 나뭇잎 HCP가 석출 하였다 (N = 3) 따라서, Vax8 표적 단백질의 51 %까지 회복은 증가하면서 크로마토 그래피 분리 16 이전에 0.1 % ~ 1.2에서 순도. 이 64.1 %로 3.3 %에서 순도를 증가 형광 단백질을 DsRed 83 ± 1 % (N = 3)를 복구하는 것이 가능했다...

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Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

효과적으로 담배에서 숙주 세포 단백질 (HCP가)의 90 % 이상을 제거 침전 방법 나타난 세 개의 열은 다른 정제 단계 이전에 추출한다. 공장 HCP가이 비가 역적으로 60 ° C 이상의 온도에서 집계.

본래 식물을 표백제로 또는 추출물의 열처리에 의한 담배 숙주 세포 단백질 제거 방법의 비교

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

comparison-tobacco-host-cell-protein-removal-methods-blanching-intact

Research

JoVE Journal

Biology

9.0K 조회수.  Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V..  효과적으로 담배에서 숙주 세포 단백질 (HCP가)의 90 % 이상을 제거 침전 방법 나타난 세 개의 열은 다른 정제 단계 이전에 추출한다. 공장 HCP가이 비가 역적으로 60 ° C 이상의 온도에서 집계. 

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Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery에 의해 인간 배아 줄기 세포의 유도

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

연구

생물학

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis 에그의 작성과 분류는 압축을 풉니다

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

형질 전환의 세대<em&gt; 히드라</em&gt; 배아 미세 주입에 의해

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

유방암 세포주에서 세포 증식을 결정하기위한 세 가지 방법 비교

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...