Diese Arbeit wurde von Paris VI University und einen Pierre Fabre Innovation Zuschuss unterstützt.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem europäischen Gemeinschaftsstandards für die Pflege und Verwendung von Labortieren, mit Zustimmung der lokalen Ethikkommission für Tierversuche (Ile de France-Paris-Komitee, Zulassung 4270) durchgeführt. 1. Anesthesia <ol><li> eine letale Dosis von Pentobarbital (bis zu 1 mg / 10 g Körpergewicht) intraperitoneal (27-Gauge-Nadel und 1-ml Spritze) in erwachsenen Mäusen vor der Operation infundieren. </li></ol> 2. Behälter Perfusions HINWEIS: Es gibt keine Notwendigkeit, die Augen während der Gefäß Perfusion anwenden Tierarzt Salbe ist. Dieses Verfahren ist schnell (5-10 Minuten) und endet mit dem Tod des Tieres. Bestätigen Sie die fehlende Reaktion mit einer Zehe Prise. <ol><li> Mit Iris Schere, einen Schnitt zu machen, etwa 4 cm lang, in die Bauchdecke und Peritoneum, direkt unterhalb des Brustkorbs. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt (wenige Millimeter lang) in der Membran und dann continue der Schnitt der Membran entlang der gesamten Länge des Brustkorbs der Pleurahöhle zu belichten. </li><li> Heben Sie das Brustbein weg und klemmen Sie die Spitze des Brustbeins mit dem hemostat; Stellen Sie den hemostat auf den Hals. Sorgfältig schneiden Sie das Fettgewebe des Brustbeins zum Herzen zu verbinden. </li><li> Übergeben Sie die 15-Gauge-Perfusions-Nadel durch den linken Ventrikel in die Spitze des Herzens. </li><li> Schließlich verwenden Schere eine der Leberlappen zu schneiden einen Ausgang zu schaffen. HINWEIS: Eine alternative Ausgang kann mit Iris Schere erstellt werden, um einen Einschnitt in den rechten Vorhof zu schaffen. </li><li> Perfundieren das Tier mit 25 bis 50 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit einer Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml / min betrieben wird. Die Leber sollte blanch wie das Blut wird mit PBS ersetzt. </li><li> Nach ungefähr fünf Minuten, nachdem die Flüssigkeit aus der Leber vollständig klar ist, die Perfusion zu stoppen. </li><li> Wenn Immunofärbung oder regelmäßige Färbung ist geplant, perfundieren das Tier mit 50 ml Paraformaldehyd(PFA; 4% in PBS) für 15 min. HINWEIS: Vorsicht, sind PFA Dämpfe giftig. Perfusion des Tieres mit PFA sollte in einem gut belüfteten Laborabzug durchgeführt werden. </li></ol> 3. Isolierung des Gehirns und der Kreis von Willis <ol><li> Isolation des Gehirns <ol><li> Entfernen Sie den Kopf mit einem Paar von chirurgische Scheren. </li><li> Machen Sie einen Mittelschnitt mit Iris Schere, entlang der Haut vom Hals bis zur Nase. </li><li> Schneiden Sie die Haut, den Schädel zu entlarven und entfernen Sie alle Rest Muskeln und Fettgewebe mit Iris Schere. </li><li> Platzieren das scharfe Ende der Iris Schere in das Foramen Magnum auf der einen Seite und vorsichtig gleiten entlang der inneren Oberfläche des Schädels auf den äußeren Gehörgang (auch als Ohrkanal bekannt). </li><li> Reproduzieren des Einschnitts in 3.1.4 auf der kontralateralen Seite beschrieben und eine Mittellinie entlang der Innenfläche des Zwischenscheitelbein zu Beginn der Sutura sagittalis Schnitt. </li><li> Pflanzen Sie die IrisSchere im Stirnbein, genau zwischen die Augen in der Pfeilnaht und sie dann öffnen, um den Schädel in zwei Teile gespalten. </li><li> Heben Sie das Gehirn aus, die Riechkolben greifen und mit Hilfe der Iris Schere, um die Nervenverbindungen auf ihrer Bauchseite abzuschneiden. </li><li> Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie sie in einem 60-mm-Petrischale eiskaltem PBS für CoW Isolierung enthält. Völlig tauchen das Gehirn in der PBS. Wenn das Gehirn mit 4% PFA (für nachfolgende Schnitte und Immunfärbung oder regelmäßigen Färbung) fixiert wurde, halten Sie es in einem Bad von 4% PFA bei 4 ° C für 24 Stunden. </li></ol></li><li> Die Isolierung des Kreises von Willis HINWEIS: Ein Binokular für CoW Isolierung erforderlich ist. Das Gehirn sollte während des gesamten Verfahrens bei 4 ° C aufbewahrt werden. <ol><li> Setzen Sie das Gehirn auf den Kopf nach unten (dh auf seiner Rückenfläche) , die Kuh zu visualisieren. </li><li> Verwenden Sie eine kleine Zange die vorderen Hirnarterien (ACA) auf der Basis der Riechlappen greifen ( <strOng&gt; a, 1) und Druck ausüben , sie aus dem Behälter Kontinuum zu distanzieren. Verwenden Sie das gleiche Verfahren , um die mittleren Hirnarterien (MCA) in b (Abbildung 1) zu schneiden. </li><li> Verwenden Sie die spitzen Enden der Zange zu heben und entfernen Sie die Hauptarterien, die Kuh aus der Rinde bilden. </li><li> Heben Sie den Start der hinteren kommuniziere Arterien (PCA), um sie vom Gehirn zu trennen, indem Sie die mittlere Hirnarterien Greif (MCA) mit der Zange. Pick-up die vorderen Arterien (ACA und MCA) und ziehen Sie sie sanft über die Chiasma in einer anterior-dorsalen Richtung. Um zu verhindern, Störung des Rindes, unterbrechen die das Verfahren für den Umgang mit den anderen Arterien. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2.2 und 3.2.3 für die oberen und hinteren Kleinhirnarterien (SCA) / (PCA) (c, Abbildung 1) und für die Basilaris (BA) (d, 1), so dass sie in einer dorsal ziehen anterior. Stoppen Sie am Ende des Verfahrens beschrieben in 3.2.4. </li><li> Entfernen Sie die gesamte Kuh sanft mit der Zange herausziehen. Legen Sie die Kuh in einem 60-mm-Petrischale gefüllt mit eiskaltem PBS und entfernen Sie alle verbleibenden angebracht Hirngewebe mit zwei Zangen, die Kuh an Ort und Stelle mit kleinen Stiften zu halten. </li><li> Halten Sie das geerntete CoW bei -80 ° C für die nachfolgende Verarbeitung für RNA-Reinigung (RNA Extraktionsausbeuten große Mengen an RNA - ca. 500 ng) oder Proteinextraktion. Hinweis: Die Kuh beibehalten werden kann ex vivo 24 h, durch das Organbad System Anpassung für isolierten Maus Riech Arterie 7 entwickelt. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung eines ventrale Ansicht des Mäusegehirns Unter Hinweis auf die Kuh Die Kuh aus den beiden Arteria carotis interna (MCA) gebildet wird, die sich von den beiden vorderen Hirnarterien (ACA) abgeleitet sind;. die basilarArterie (BA) verzweigt sich in die hintere (PCA) und superior (SCA) Hirnarterien und zwei Wirbelarterien (VA).

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The authors have nothing to disclose.

Wir beschreiben hier ein reproduzierbares Protokoll für die Isolierung des Kreises von Willis. Die häufigsten zerebrovaskulären Störungen, die Kuh zu ergreifen sind, CAA-assoziierten Gefäßerkrankungen, intrakranielle Atherosklerose und Aneurysmen, von denen alle die Wände der arteriellen Gefäße auswirken. Die Risikofaktoren sind bekannt, aber die molekularen Pathogenese dieser Erkrankungen zerebraler bleibt schlecht verstanden und die spezifische biologische Marker für ihr Auftreten vorherzusagen fehlen. Es gi...

Der zerebrale arterielle Kreis (Circulus arteriosus cerebri), die auch als Kreis von Willis (Kuh), Schleife von Polygon Willisor Willis bekannt) wurde zum ersten Mal in 1664 von Thomas Willis beschrieben Es ist ein Kreislauf-Anastomose um die Sehnervenkreuzung und Hypothalamus das kann betrachtet werden als zentrale Drehscheibe Blut zum Gehirn versorgenden und der umgebenden Strukturen. Blut tritt diese Struktur über die A. carotis interna und Arteria vertebralis, und es strömt aus dem Kreis über das Innere mittleren und hinteren Hirnarterien. Jede dieser Arterien hat linke und rechte Zweige auf jeder Seite des Kreises. Die basilar, Post kommunizieren und vorderen Arterien vollständig den Kreis (Abbildung 1 und Abbildung 2) in Verbindung steht. Das Risiko einer Beeinträchtigung des Blutflusses in einem der Abflußadern wird durch die Zusammenführung von Blut Eingabe der Kreis von der Carotis und Hirnarterien minimiert, wodurch gewährleistet, dass ausreichend Blut zum b zugeführt wird,Regen. Diese Struktur dient auch als Hauptroute für Sicherheiten Blutfluss in schweren Verschlusskrankheiten der A. carotis interna. Mehrere Arten von zerebrovaskulären Erkrankungen haben ihren Ursprung in der Kuh. Die häufigsten sind die zerebrale Amyloid - Angiopathie (CAA) -assoziierten Gefäßerkrankungen, intrakranielle Atherosklerose und intrakraniellen Aneurysmen. 1, 2, 3 Diese Störungen aufgrund Vasodilatation hypoperfusion führen können, und intrazerebrale und / oder Subarachnoidalblutungen letztlich Übersetzung in ischämischen oder hämorrhagischen Schlaganfällen oder allenfalls eine transitorische ischämische Attacke. Jüngste Fortschritte in Diagnoseverfahren, bildgebenden Verfahren, einschließlich, möglicherweise mit Angiographie kombiniert, haben es möglich gemacht, diese großen zerebrovaskuläre Erkrankungen klinisch, ohne die Notwendigkeit für ein Gehirn-Biopsie zu diagnostizieren. Dennoch wirksame und spezifische Behandlungen (pharmakologische oder endovaskuläre) fehlen derzeit und es besteht daher ein Bedarf neu zu definierenmolekulare Ziele. Die Identifizierung neuer Arzneimitteltargets für die Prävention dieser Krankheiten beim Menschen werden Tiermodelle und Möglichkeiten erfordern die Cerebro-Gefäße einschließlich der Kuh zu isolieren. Solche Modelle sollten Beweise und Hinweise auf die spezifischen Veränderungen liefern, entzündliche Veränderungen , einschließlich, in den Wänden der großen Gefäße in Tiermodellen von intrakraniellen Aneurysma Arterie, CAA oder intrakranielle Atherosklerose auftreten. 4, 5, 6 Wir haben ein Verfahren zur Isolierung Maus CoW etablierten Studien der Gefäßentzündung bei Alzheimer-Krankheit (AD) und verwandter Krankheiten, wie CAA zu erleichtern. Dieses Verfahren zur Isolierung des Maus CoW wurde für die Beurteilung der Entzündungs ​​zerebrovaskulären Genexpression während Fortschreiten der Krankheit entwickelt. Zusammen mit dem Nachweis von Amyloid-beta-Ablagerung innerhalb der Wände der trigeminale und pial Arterien, könnte dieses Verfahren erleichtern abzuschreckenMine die mögliche Beziehung zwischen inflammatorischen Genexpression in der Cerebro-Gefäßwand und Aß-Peptid-Akkumulation. Das vaskuläre Netzwerk des Gehirns, einschließlich der trigeminale und pial in den Subarachnoidalraum, ist eine Erweiterung der großen Arterien, den Kreis der Willis bilden. Das hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden , um die Kuh jeder Mauslinie zu isolieren und könnte für alle Arten von Screening (zB Genexpression, Proteinproduktion und posttranslationale Modifikationen) an den großen Gefäßen der Maus Cerebro- Vaskulatur verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Hardened Fine Iris Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Scissors - Straight / Sharp / Sharp&amp;nbsp;&amp;nbsp; 16.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic Zoom Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND Surface 60mm Culture Dish</td><td>Corning</td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump - MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&amp;eacute; Animale</td><td>FR/V/2770465 3/1992</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for isolating the mouse circle of willis

Der zerebrale arterielle Kreis (Circulus arteriosus cerebri) oder Kreis von Willis (CoW) ist ein Kreislauf-Anastomose umgibt die Sehnervenkreuzung und dem Hypothalamus, die Blut zum Gehirn und der umgebenden Strukturen liefert. Es wurde in mehreren zerebrovaskulären Störungen, einschließlich zerebraler Amyloidangiopathie (CAA) -assoziierten Vaskulopathien, intracranial Atherosklerose und intrakranielle Aneurysmen gebracht. Studien der molekularen Mechanismen dieser Krankheiten für die Identifizierung neuer Arzneimitteltargets für deren Prävention zugrunde liegenden erfordern Tiermodellen. Einige dieser Modelle kann transgen sein, während andere Isolierung der cerebro-Vaskulatur einbeziehen, einschließlich der CoW.The hier beschriebene Verfahren eignet sich zur Isolation CoW in jeder Maus lineage und erhebliches Potenzial für das Screening (Expression von Genen, die Proteinproduktion, posttranslationalen Proteinmodifikationen, Sekretom Analyse, etc.) Studien zu den großen Gefäßen der Maus zerebro-Gefäße. Es kann auch für die Ex - vivo - Studien verwendet werden, indem das Organbad System für isolierten Maus Riech Arterien entwickelt anzupassen.

<html> Die PBS-perfundierten Maus getötet und die Kuh ist in Abschnitt 3.2 des Protokolls wie beschrieben isoliert. Wenn die Präparation korrekt durchgeführt wird, sollte die Kuh kommen in einem Stück aus und sollte aufgrund leicht transparent sein, um das Fehlen von Restblut in den Gefäßen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Maus CoW nach Isola...

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Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Protokoll für die Maus Kreis von Willis Trenn

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.0K Aufrufe.  Sorbonne Universités. We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Serie: Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Einem Mausmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion Injury durch Ligation des linken vorderen absteigenden Arterie

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Forschung

Medizin

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Immunologie und Infektion

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. Identification and monitoring of bacterial species at the ocular mucosa have been challenging due to their low abundance and limited availability of appropriate methodology for commensal growth and identification. There are two standard approaches: culture based or DNA sequencing methods. The first method is problematic due to the limited recoverable bacteria and the second approach identifies both live and dead bacteria leading to an aberrant representation of the ocular space. We developed a robust and sensitive method for bacterial isolation by building upon standard microbiological culturing techniques. This is a swab-based technique, utilizing an &#8220;in-lab&#8221; made thin swab that targets the lower conjunctiva, followed by an amplification step for aerobic and facultative anaerobic genera. This protocol has allowed us to isolate and identify conjunctival species such as Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. The approach is suitable to define commensal diversity in mice under different disease conditions.

Presented here is a protocol for the isolation and amplification of aerobic and facultative anaerobic mouse conjunctival commensal bacteria using a unique eye swab and culture-based enrichment step with subsequent identification by microbiological based methods and MALDI-TOF mass spectrometry.

Bindehautkommusale Isolierung und Identifizierung bei Mäusen

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

Isolierung der primäre Maustaste Hepatozyten für entstehende Protein Synthese Analyse von nicht-radioaktiven L-Azidohomoalanine Kennzeichnung Methode

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Hormonelle, metabolische und elektrische Regulation isolierter hypothalamischer Neuronen

Isolation of Targeted Hypothalamic Neurons for Studies of Hormonal, Metabolic, and Electrical Regulation

The hypothalamus regulates fundamental metabolic processes by controlling functions as varied as food intake, body temperature, and hormone release. As the functions of the hypothalamus are controlled by specific subsets of neuronal populations, the ability to isolate them provides a major tool for studying metabolic mechanisms. In this regard, the neuronal complexity of the hypothalamus poses exceptional challenges. 
For these reasons, new techniques, such as Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS), have been explored. This paper describes a new application of magnetic-activated cell sorting (MACS) using microbead technology to isolate a targeted neuronal population from prenatal mice brains. The technique is simple and guarantees a highly pure and viable primary hypothalamic neuron culture with high reproducibility. The hypothalamus is gently dissociated, neurons are selectively isolated and separated from glial cells, and finally, using a specific antibody for a cell surface marker, the population of interest is selected. 
Once isolated, targeted neurons can be used to investigate their morphological, electrical, and endocrine characteristics and their responses in normal or pathological conditions. Furthermore, given the variegated roles of the hypothalamus in regulating feeding, metabolism, stress, sleep, and motivation, a closer look at targeted and region-specific neurons may provide insight into their tasks in this complex environment.

Autor im Rampenlicht: Einblicke in den hypothalamischen neuronalen Mechanismus 

Here we present a protocol to grow specific hypothalamic cell subtypes in culture. The cells can be selected based on opportune/unique membrane markers and used in many applications, including immunofluorescence, electrophysiological, and biochemical assays.

Isolierung von gezielten hypothalamischen Neuronen zur Untersuchung der hormonellen, metabolischen und elektrischen Regulation

The hypothalamus regulates fundamental metabolic processes by controlling functions as varied as food intake, body temperature, and hormone release. As ...

Neurowissenschaften

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the three-dimensional tissue morphology is from such sections. In addition, the sections of tissues examined may not contain the region within the tissue that is necessary for the purpose of the ongoing study. This latter limitation hinders histopathological studies of blood vessels since vascular lesions develop in a focalized manner. This requires a method that enables us to survey a wide area of the blood vessel wall, from its surface to deeper regions. A whole mount en face preparation of blood vessels fulfills this requirement. In this article, we will demonstrate how to make en face preparations of the mouse aorta and carotid artery and to immunofluorescently stain them for confocal microscopy and other types of fluorescence-based imaging.

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

A procedure for making en face preparations of the mouse carotid artery and aorta is described. Such preparations, when immunofluorescently stained with specific antibodies, enable us to study localization of proteins and identification of cell types within the entire vascular wall by confocal microscopy.

En Face Vorbereitung der Maus Blutgefäße

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

Biologie

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Protokoll für die Maus Kreis von Willis Trenn

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