Diese Methode identifiziert lebensfähige okuläre Bindehautmikroorganismen, was aufgrund der feindlichen Umgebung der Augen eine Herausforderung darstellt. Es kann helfen zu beantworten, ob ein okuläres Mikrobiom existiert und wie sich die bakterielle Präsenz bei Augenerkrankungen verändert. Im Gegensatz zur DNA-Sequenzierung, die sowohl lebensfähige als auch nicht lebensfähige Mikroorganismen identifiziert, identifiziert diese Methode nur lebensfähige Mikroorganismen, was zu einem klareren Verständnis der okulären Kommensalgemeinschaft führt.
Studien deuten darauf hin, dass schwer zu diagnostizierende Augenkrankheiten wie nicht-autoimmunes und autoimmunes trockenes Auge eine einzigartige okuläre bakterielle Präsenz haben. Diese Methode könnte verwendet werden, um Augenkrankheiten mit ausgeprägten mikrobiellen Signaturen zu diagnostizieren. Beginnen Sie mit dem Autoklavieren der entsprechenden Menge an Baumwollschlägern und Zahnstochern für die Anzahl der Mäuse, die abgetupft werden sollen, dann kneifen Sie 1/2 Zentimeter langes Stück Baumwollschläger ab und necken Sie es heraus, indem Sie an den Rändern ziehen, um eine flache einzelne poröse Schicht zu bilden, die kurz vor dem Auseinanderfallen des Schlages stoppt.
Schwenken Sie den Schlag um eines der scharfen Enden des Zahnstochers, indem Sie das ausgestreckte Stück leicht an der Zahnstocherspitze halten, während es verdreht wird. Der fertige Augenabstrich wird eine sehr dünne Schicht Baumwolle haben, die über die Spitze gespannt ist und sich etwa 1/2 bis einen Zentimeter von der Spitze entfernt erstreckt. Die Tupfer in ein kleines Becherglas geben, mit der Seite nach unten abtupfen, dann abdecken und autoklavieren.
Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit einem Desinfektionsmittel, um die Kontamination zu minimieren, und aliquotieren Sie 0,5 Milliliter sterile Gehirnherzinfusion oder BHI-Medien in markierte 1,5 Milliliter sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie die Rohre in einem Rack und stellen Sie das Rack auf Eis. Richten Sie den Workflow von links nach rechts ein, beginnend mit der Mausanästhesiestation, die den Käfig mit den Versuchsmäusen, den leeren sterilen Käfig, die Anästhesie bei Raumtemperatur, die 25-Gauge-Nadel und eine Ein-Milliliter-Spritze enthält.
Als nächstes bereiten Sie eine Augenabstrichstation vor, die das aliquotierte BHI auf Eis, sterilisierte Augenabstriche, schmierende Augentropfen, Biogefahrenbehälter, saubere Papierhandtücher und 70% Isopropanol-Spray enthält. Schließlich richten Sie die Beschichtungsstation mit Blutagarplatten bei Raumtemperatur, einer 10-Mikroliter-Pipette, 10-Mikroliter-Steriler-Einwegspitzen und einem Biohazard-Abfallbehälter ein. Stellen Sie sicher, dass die Maus richtig betäubt ist, indem Sie ein Fußpolster der Hinterhand zusammendrücken.
Fahren Sie nur fort, wenn keine Bewegung vorhanden ist. Weisen Sie eine Hand zu, um anästhesierte Mäuse zu behandeln, und die anderen Hände, um den Augenabstrich und die Kultur zu handhaben. Nehmen Sie die Maus aus dem Käfig und legen Sie sie auf die Arbeitsfläche, die auf der Seite positioniert ist, wobei das linke Auge freigelegt ist.
Besprühen Sie die behandschuhten Hände mit Isopropanol und trocknen Sie sie mit einem Papiertuch. Entkappen Sie das beschriftete BHI-Mikrozentrifugenrohr mit der speziellen Medienhandhand und legen Sie die beiden wieder in das Rack. Tauchen Sie die mit Baumwolle beschichtete Spitze des Augentupfers in den BHI, ziehen Sie dann den Tupfer aus dem Röhrchen, während Sie die Spitze zweimal gegen das Innenrohr schwenken, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und zu entfernen.
Halten Sie die Maus mit der Hand vorsichtig am Hals. Mit der anderen Hand die Spitze des Augenabstrichs gegen die mediale Bindehautregion des linken Auges legen. Drücken Sie den Augapfel leicht und bewegen Sie den Tupfer in einer Fensterwaschbewegung zwischen dem unteren Augenlid und dem Auge 10 Mal, wobei der Druck konstant bleibt.
Ohne das Fell zu berühren, entfernen Sie vorsichtig die Spitze des Tupfers senkrecht zu der Stelle, an der er eingeführt wurde. Legen Sie den Tupfer mit der Baumwollseite nach unten, direkt in ein beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen mit BHI-Medien. Tragen Sie einen Augentropfen auf das abgetupfte Auge auf.
Falls gewünscht, erwerben Sie Haut- oder Felltupfer für Kontrollproben und sterilisieren Sie Handschuhe entsprechend zwischen jedem Tupfer. Wenn Sie fertig sind, bringen Sie die Maus in den Käfig zurück. Lassen Sie den Tupfer 10 bis 15 Minuten auf Eis stehen, sterilisieren Sie dann die behandschuhten Hände und entfernen Sie den Tupfer, während Sie die Spitze für 10 Umdrehungen im Medium mischen.
Ziehen Sie den Tupfer zurück, indem Sie die Spitze für fünf Umdrehungen gegen die Innenwand des Rohrs schwenken und in einem biogefährlichen Behälter entsorgen. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Maus. Reichern Sie die Probe an, indem Sie das Röhrchen statisch für eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Beschriften Sie während der Inkubation eine TSA-Platte bei Raumtemperatur pro Mausaugenabstrich oder Kontrolltupfer und teilen Sie sie in zwei Hälften. Entfernen Sie die angereicherten Proben aus dem Inkubator und legen Sie sie auf Eis. Die zu mischende Probe kurz vortexen, dann 10 Mikroliter der Probe auf die TSA-Platte aliquoten und die Platte kippen, um einen Streifen zu bilden.
Wiederholen Sie dies zweimal. Erstellen Sie auf der anderen Seite der Plattentrennlinie 10 Punkte mit jeweils 10 Mikrolitern Probe. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 18 Stunden, zwei Tage und vier Tage in einer sauberen Kammer, die das Austrocknen der Agarplatten verhindert.
Zählen Sie die Kolonien in den Streifen. Beachten Sie die Morphologie und berechnen Sie koloniebildende Einheiten pro Tupfer für morphologisch ähnliche Isolate. Schauen Sie sich die Punkte an, an denen einzigartige Organismen nicht in den Streifen gefangen sind.
Um die Visualisierung zu erleichtern, haben wir Bakterien dicht in der mittleren und rechten Platte plattiert. Typischerweise beobachteten wir viel weniger Bakterien in Augenabstrichplatten. Beachten Sie, dass die Augenabstriche gelegentlich keine rückgewinnbaren Bakterien ergeben.
Eine repräsentative Augenabstrichplatte mit morphologisch vielfältigen Isolaten einer C57 Black Six Maus ist hier zu sehen. Für jedes einzelne Isolat wurden die Kolonien im Streifen gezählt und die relative Häufigkeit berechnet und aufgezeichnet. Für die mikrobiologische Charakterisierung wurden Bakterien aus einzelnen Mausaugenabstrichplatten ausgewählt, um eine Master-TSA-Platte zu erzeugen.
Als das Wachstum auftrat, wurden zusätzliche Tests durchgeführt, um die Mikroben zu charakterisieren oder zu identifizieren. Die Masterplatte wurde verwendet, um genügend Inokum bereitzustellen, um die jeweiligen Isolate zu erweitern. Um Isolate zu identifizieren, wurde eine TSA-Platte über Nacht gestreift und inkubiert und MALDI-TOF MS durchgeführt.
Beispiele für die hier gezeigten Isolate wurden als Streptococcus acidominimus und Aerococcus viridans identifiziert. Signifikant unterschiedliche Konzentrationen von kommensalen Organismen wurden von männlichen und weiblichen C57 schwarzen sechs Mäusen gewonnen. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans koaguliert negative Staphylokokken und E.coli wurden aus C57 schwarzen sechs N Mäusen isoliert.
Denken Sie beim Versuch dieses Protokolls daran, dass das beste Ergebnis erzielt wird, indem Sie den Tupfer dünn beschichten und sich während des Augenabstrichs Zeit nehmen. Wenn der Zugang zu MALDI-TOF MS begrenzt ist, können die Isolate durch mikrobiologische und biochemische Tests identifiziert werden.
