Name: en face preparation of mouse blood vessels
Uploaded: 2017-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
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Die Forschungsaktivitäten der Autoren werden durch Stipendien des Nationalen Instituts für Gesundheit an Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551) unterstützt.

Die Protokolle für die Maus partielle Carotis-Arterien-Ligation und Isolierung der Maus-Aorta und Carotis-Arterie für En-Gesicht Immunfärbung sind von der Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt (IBT 2014-9231). 1. linke partielle Carotis-Arterie-Ligation <ol><li> Bereiten Sie den chirurgischen Raum vor, indem Sie einen 12 Zoll x 14 Zoll Heizkissen auf den Tisch legen und das Pad und die Tischplatte mit einem großen, sauberen chirurgischen Tuch abdecken. Stellen Sie den Arm des Auslegerständers so ein, dass sich das Sichtfeld des Stereomikroskops im Mittelbereich des Heizkissens befindet. </li><li> Schalten Sie den Heizkissen auf den Tisch ein und stellen Sie den 3-Einstellregler auf den mittleren Heizpegel. Bei dieser Temperatureinstellung beträgt die Oberfläche der Chirurgie (siehe 1.6.1) 38-40 ° C. <ol><li> Legen Sie einen sauberen Käfig auf ein anderes Heizkissen. Drehen Sie den Heizkissen wie oben. Dieser Käfig wird zur Wiederherstellung nach der Operation verwendet (siehe 1.16) sowie Gehäuse. </li></ol></lI&gt; <li> Auf dem chirurgischen Tisch legen Sie einen autoklavierten Sterilisationsbeutel mit Irisschere (1 Paar), Gewebezange (1 Paar), Supergriffpinzette (2 Paar), Federschere (1 Paar), stumpfer Retraktor (1 Paar 2,5 mm breit) , Runde Nadelhalter (1), sterilisierte 6-0 Seidennaht, Baumwollspitzapplikatoren, Mini-Baumwollspitzapplikatoren, Chirurgische Vorhänge und 2 &quot;x 2&quot; Gazeschwämme. Legen Sie auch eine Quetschflasche mit 70% Ethanol und eine andere mit Chlorhexidin chirurgischen scrubon die chirurgische Tabelle. </li><li> Wiegen Sie eine Maus. Das Körpergewicht wird benötigt, um die entsprechende Menge an Analgesie zu bestimmen, die unmittelbar vor der Operation verabreicht wird. </li><li> Lege eine Maus in die Induktionskammer. </li><li> Schalten Sie den Sauerstoffbehälter und den Anästhesieverdampfer ein, um die Maus in der Induktionskammer zu betäuben. Halten Sie das Isofluran-Niveau bei 2%. Es dauert 3-5 Minuten, bevor die Maus aufhört zu bewegen. <ol><li> Während die Maus anesthe istTized, legen Sie ein kleineres Stück von sterilen chirurgischen drapieren (24 Zoll x 24 Zoll) unter dem Stereomikroskop, um eine chirurgische Oberfläche zu schaffen. Dann legen Sie eine Acryl-Chirurgie (die mit 70% Alkohol gereinigt wurde) auf der drapierten Oberfläche. Die chirurgische Platte sollte also auf dem Heizkissen liegen, aber durch zwei Schichten von chirurgischen Vorhängen getrennt sein. </li></ol></li><li> Wenn die Maus in der Induktionskammer aufhört, die Maus auf einen prächirurgischen Vorbereitungsbereich zu bringen und ihre Nase in den mit dem Verdampfer verbundenen Nase-Kegel (2% Isofluran) zu positionieren. Entfernen Sie die Haare um den Zervikalbereich mit einem elektrischen Trimmer oder Haar-Entferner-Lotion. Wir empfehlen Haare entfernen Lotion, weil diese Methode nicht produzieren lose Haare Stücke, die schwer zu entfernen sind aus dem chirurgischen Bereich. </li><li> Mit der Nase-Kegel an Ort und Stelle, bewegen Sie die Maus auf die chirurgische Tafel. <ol><li> Tafeln Sie die rechten und linken Vorderpfoten auf die chirurgische Tafel. Tape down beide Hinterbeine togeAuf der rechten Seite der Maus. Dies führt zu einer leichten Drehung des Mauskörpers, so dass die linke Seite des Halsbereichs der Maus besser für eine Operation positioniert wird. </li></ol></li><li> Desinfizieren Sie den Schnittbereich mit 70% Alkohol, Chlorhexidin chirurgisches Peeling und wieder mit 70% Alkohol. Bedecken Sie die Maus mit einer sterilisierten chirurgischen Abdeckung, außer für den Zervikalschnitt. </li><li> Bestätigen Sie mit der Zehe, dass die Maus vollständig anästhesiert wird und geben Sie Analgesie (Caprofen 3-5 mg / kg) über intraperitoneale oder subkutane Injektion. </li><li> Unter dem Seziermikroskop einen ventralen Mittellinienschnitt um den Zervikalbereich mit einer Skalpell- oder Irisschere machen. HINWEIS: Wir verwenden Scheren, weil der Arbeitsabstand des Stereomikroskops begrenzt ist, was es schwierig macht, ein Skalpell zu verwenden. </li><li> Setzen Sie die linke Arteria carotis (LCCA) frei, indem Sie beiseite schieben und die Speicheldrüsen, die die Blutgefäße auf die linke Seite des a abdecken, neu positionierenNimal. </li><li> Identifizieren Sie alle Blutgefäße im chirurgischen Bereich ( Abbildung 1 ). Die LCCA verzweigt sich in die linke A. carotis interna (ICA) und die linke A. carotis externa (ECA). Die oberflächliche Schilddrüsenarterie (STA) entsteht aus dem ECA auf der medialen Seite. Die Okzipitalarterie (OA) entsteht meist aus dem ECA, aber bei einigen Mäusen entsteht sie aus dem ICA. </li><li> Ligate alle Arterien Äste außer der OA mit sterilisierten 6-0 Seide Naht. Um dies zu erreichen, machen Sie die folgenden zwei Ligations. <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe um und unterhalb der linken A. carotis interna (ICA). Greifen Sie ein Stück vorgebildete 6-0 Seidennaht (~ 2,5 cm) mit Pinzette und geben Sie es unter der Arterie. Mit einem anderen Paar Pinzette, ziehen Sie die Naht etwa 1/3 seiner Länge und ligieren die Arterie. </li><li> Entfernen Sie das Bindegewebe um die linke äußere Carotis-Arterie (ECA) in der gleichen Weise wie oben beschrieben und machen eine Ligation proximal zum linken überlegenen ThyroiD-Arterie (STA) ( Abbildung 1 ). Achten Sie darauf, dass keine Nervenfasern beschädigt werden, die im chirurgischen Bereich laufen. </li></ol></li><li> Wenn diese Verpflichtungen gemacht wurden, bringen Sie die Speicheldrüsen in die ursprüngliche Position zurück und hydratisieren das chirurgische Feld, indem sie 2-3 Tropfen steriler Kochsalzlösung platzieren. Schließen Sie die Haut mit 6-0 beschichteten Vicrylnähten. </li><li> Nach der Operation die Maus in den vorgewärmten Käfig stellen (siehe 1.2.1). Die Maus sollte innerhalb von 5 Minuten aufwachen und anfangen zu laufen. Sobald bestätigt, dass sich die Maus normal verhält, bringen Sie den Käfig in den Tierwohnzimmer. </li><li> Beobachten Sie die Maus täglich für die ersten 3 Tage der Erholung. Die Maus kann so lange gehalten werden, wie das Experiment unter den verschiedenen Bedingungen erfordert, die das experimentelle Protokoll verlangt. En Gesicht Vorbereitungen können jederzeit nach der Operation gemacht werden. </li></ol> 2. En Gesicht Immunfärbung <ol><li> Euthanasiere eine Maus mit CO 2 durch Inhalationsüberdosierung. </li><li>Tape die Maus in einer Rückenlage (Bauch Seite nach oben) Position auf eine Sektion Platte. </li><li> Exponieren Sie die Bauchhöhle, indem Sie eine Mittellinie mit Irisschere machen. </li><li> Setzen Sie die Thoraxhöhle aus, indem Sie die Rippen seitlich zum Sternum schneiden. </li><li> Machen Sie einen Einschnitt in die Hohlvene oder schneiden Sie eine der femoralen Arterien, um Blut zu entwässern. </li><li> Setzen Sie eine 26-G-Nadel ein, die an einem Schwerkraft-Perfusions-Setup (120 cm Wasserdruck) in den Scheitel des linken Ventrikels angebracht ist, und peritutieren Sie das Kreislaufsystem mit Kochsalzlösung, die Heparin (40 U / ml) enthält. Setzen Sie die Perfusion fort, bis die aus dem Schnitt fließende Kochsalzlösung klar wird. </li><li> Umschalten des Perfusionssystems von Kochsalzlösung auf die Fixierlösung mit 4% Paraformaldehyd in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) und Fortsetzung der Perfusierung für 5 weitere min. </li><li> Ernten Sie die Aorta und beide linke und rechte Carotis-Arterien mit Stumpfschere und Pinzette und legen Sie sie in ein 50 ml konisches Röhrchen mit dem Fixiermittel auf Eis. </li><li&gt; Übertragen Sie das Gefäß in eine Petrischale, die PBS enthält, unter einem Sektionsmikroskop und entfernen Sie sorgfältig das Fett und das Bindegewebe, das an den Aorten- und Carotis-Arterien befestigt ist. Trennen Sie die Aorta- und Carotis-Arterien in Längsrichtung, um das Endothel freizulegen (Abbildung 2 ). </li><li> Übertragen Sie jedes Gefäß getrennt auf eine Vertiefung einer 12-Well-Platte, die 0,5 ml einer permeabilisierenden Lösung (0,1% Triton X-100 in PBS) pro Vertiefung enthält. Permeabilisieren Sie die Blutgefäße für 10 min mit Schaukeln bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Kurz mit PBS waschen. </li><li> Um nicht-spezifische Antikörperbindungsstellen zu blockieren, inkubieren Sie Blutgefäße in 10% normalem Serum aus den Tierarten, in denen die sekundären Antikörper hergestellt wurden, in TTBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) mit 2,5% Tween 20) für 30 min mit Schaukeln bei RT </li><li> Inkubieren von Gefäßen mit den primären Antikörpern, die in geeigneter Weise in TTBS mit 10% normalem Serum (wie oben beschrieben) über Nacht mit Kippen bei 4 ° C verdünnt werden. Die EbeneDer Verdünnung muss für jeden Antikörper bestimmt werden. </li><li> Führen Sie die folgende Kontrollfärbung durch. <ol><li> Inkubieren von Gefäßen mit TTBS anstelle eines primären Antikörpers, gefolgt von einer Inkubation mit einem sekundären Antikörper. </li><li> Inkubieren von Gefäßen mit TTBS, die nicht immunes (oder präimmunes) Serum oder Ig des gleichen Tieres (Spezies) enthalten, in dem primäre Antikörper hergestellt wurden, gefolgt von Inkubation mit einem sekundären Antikörper. </li><li> Weglassen Sie die Inkubation mit einem sekundären Antikörper. Diese Kontrollproben müssen in gleicher Weise behandelt werden und gleichzeitig bei der Färbung mit spezifischen Antikörpern durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Blutgefäße 3 mal mit TTBS für jeweils 10 min mit Schaukeln bei RT. </li><li> Inkubieren mit fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern, die in geeigneter Weise in TTBS mit 10% normalem Serum (wie oben beschrieben) für 1 h mit Schütteln bei RT verdünnt werden. Die Kernfärbung mit DAPI (4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol) kann gleichzeitig durchgeführt werdenT diese Stufe durch Zugabe von 1/5000 Volumen einer DAPI-Stammlösung, die 5 mg / ml DAPI in H 2 O enthält. </li><li> 3 mal mit TTBS für jeweils 10 min mit Schaukeln bei RT waschen. </li><li> Spülen Sie kurz in PBS. </li><li> Legen Sie einen Tropfen des Anti-Fade-Reagenzes auf ein Deckglas (22 mm x 50 mm) und legen Sie ein Blutgefäß auf das Deckglas mit dem Endothel nach unten. </li><li> Legen Sie ein Gleitglas (22 mm x 75 mm) auf das Blutgefäß und vermeiden Sie dabei, Blasen zu fangen. </li><li> Legen Sie die Folie auf ein sauberes Laborwischtuch ( zB Kimwipe) und bedecken Sie die Folie mit zwei Laborlöchern. Legen Sie leicht 3,5 kg Gewicht ( z. B. eine Flasche Wasser auf ein dickes Buch.) Auf der Folie für maximal 5 min, um die En-Face-Blutgefäßprobe zu glätten. </li><li> Entfernen Sie das Gewicht und wischen Sie überschüssige Lösung aus dem Deckglas ab. </li><li> Nagellack an den 4 Ecken des Deckglases anbringen, die Rutschen in eine Schiebebox legen, Deckel nach oben legen und bei RT im Dunkeln halten(Oder 4 ° C) über Nacht. Dieser Prozess pflanzt das Gewebe weiter und macht es leichter, die Mikroskopie bei hohen Vergrößerungen durchzuführen. </li><li> Das Deckglas komplett mit Nagellack abdichten. </li><li> Führen Sie die Mikroskopie durch, sobald der Nagellack trocken ist. </li><li> Falls erforderlich, lagern Sie die Folien bei -20 ° C. </li></ol>

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	<li>Jelev, L., Surchev, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+simple+technique+for+en+face+endothelial+observations+using+water-soluble+media+-'thinned-wall'+preparations.">A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations.</a> J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).</li><li>Neill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+on+venous+endothelium+of+alterations+in+blood+flow+through+the+vessels+in+vein+walls,+and+the+possible+relation+to+thrombosis.">The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis.</a> Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).</li><li>Rogers, K. A., Kalnins, V. 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Bei der Handhabung von Maus-Blutgefäßen ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Endothel zerbrechlich ist und dass jede übermäßige mechanische Kraft die Endothelzellen beschädigt. Zum Beispiel brechen oder lösen sich Endothelzellen von der Gefäßwand, wenn das Gefäß zu kräftig perfundiert wird, was leicht passieren kann, wenn das Gefäßsystem mit einer handbetriebenen Spritze perfundiert wird. Um einen konstanten Perfusionsdruck zu erhalten, verwenden wir ein Schwerkraft...

Für histopathologische Untersuchungen durch Lichtmikroskopie werden dreidimensionale Stücke biologischer Gewebe routinemäßig für die Paraffin-Einbettung verarbeitet, gefolgt von Schnitt und Färbung. Eine Gewebeprobe, die paraffineingebaut worden ist, kann in allen drei Dimensionen mehrere Millimeter betragen. Jedoch muss es zum Zwecke der Lichtmikroskopie zuerst geschnitten werden, so dass Licht durchlaufen und dann gefärbt werden kann, so dass der dünne Abschnitt genügend Kontrast für die Bildgebung ergibt. Da abgetrennte Proben üblicherweise 5-10 μm dick sind, sieht man nur einen sehr kleinen Bruchteil der gesamten Probe in zwei Dimensionen zu einer Zeit. Es ist möglich, sequentielle Abschnitte zu sammeln und nach der Bildgebung jedes Abschnitts einzeln eine computergestützte Rekonstruktion der 3D-Bilder durchzuführen, aber das ist ein langwieriger Job. Die Histopathologie der Blutgefäße, insbesondere für das Studium der Pathogenese der Atherosklerose, stellt einzigartige Probleme dar. Atherosklerose ist eine fokale Krankheit, die sich entwickeltLokal in Gebieten, in denen gestörter Blutfluss auftritt. Darüber hinaus wird die Krankheit innerhalb der Intima, ein dünnes Gewebe, bestehend aus einer Monoschicht von Endothelzellen und extrazelluläre Matrix, von großen Arterien initiiert. Aus diesen Gründen ist es eine Herausforderung, frühe Läsionen mit geschnittenen Blutgefäßen zu lokalisieren und zu studieren, weil man die Läsion leicht vermissen kann. Auch wenn ein Abschnitt einen kranken Bereich einschließt, sieht man nur einen 5-10 μm-Anteil, der Endothelzellen und andere vaskuläre Wandzellen in den Medien und Adventitia enthält. Die ganze Aufmachung erlaubt es uns, ein weites Gebiet der Blutgefäßoberfläche zu übersehen, wie die gesamte Aorta von der Aortenwurzel bis hinunter zu den iliaca arterien. Unter Verwendung einer solchen Probe, die mit spezifischen Antikörpern und anderen spezifischen Sonden gefärbt ist, kann man die Lage von Läsionen lokalisieren und auch dort, wo verschiedene molekulare Ereignisse in Endothelzellen in Verbindung mit wi auftretenTh atherogenese wie Veränderungen in der Expression, Lokalisierung und posttranslationalen Modifikationen von Proteinen. Neben der Untersuchung der Atherogenese wird die in En-Face-Präparaten beobachtete endotheliale Zellform als Indikator für das regionale zeitlich gemittelte Blutflussmuster verwendet. Solche Daten sind wichtig für das Studium der Mechanosignierung von Endothelzellen in situ. Zu diesem Zweck sind routinemäßige histologische Querschnittsblutgefäße nicht sinnvoll. Für die Gefäßmedizin und die Biologie ist es daher besonders wichtig, eine Technik zur Herstellung von Gesichtspräparationen von Blutgefäßen zu erwerben, die es ermöglichen, einen weiten Bereich der Gefäßoberfläche sowie die tieferen Untergrundgebiete des Gefäßes zu beobachten. Wie von Jelev und Surchev 1 überprüft, haben Gefäßbiologen verschiedene Methoden entwickelt, um die Auskleidung der Blutgefäße zu betrachten. In den 1940er und 1950er Jahren wurden einige geniale Methoden entwickelt. Mit diesen Methoden waren sie<html> In der Lage, die grundlegende Organisation der endothelialen Zellen, die die innere Oberfläche der Blutgefäße Linie zu studieren. Wegen der Art und Weise, wie diese Vorbereitungen hergestellt werden (das sogenannte Hautchen-Verfahren 2 , 3 , 4 oder Abziehen der Gefäßoberfläche 5 ) und die Art und Weise, wie die Probe gefärbt wurde, war es nicht immer möglich, eine ununterbrochene morphologische zu erhalten Information von der Gefäßoberfläche in die tieferen Bereiche der Blutgefäßwand. Die gesamte Pflanze, die mit der Immunfluoreszenzfärbung kombiniert wurde, erlaubte uns, nicht nur die endotheliale Zellmorphologie und die Proteinexpression und die Lokalisierung in diesen Zellen zu untersuchen, sondern auch solche Untersuchungen an den subendothelialen Bereich der Gefäßwand zu erweitern. Frühe Studien mit Blutgefäß en Gesicht Vorbereitungen gefärbt immunoflurescently begann in den 1980er Jahren erscheinen ,F &quot;&gt; 7. Mit dem Aufkommen der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und der jüngsten Multiphotonenmikroskopie kann man nun in den immunfluoreszenzgefärbten Gefäßproben sowie im Gefäßnetzwerk bei lebenden Tieren klare, fokussierte Bilder der Blutgefäßwandstruktur erhalten 8 , 9 , 10 , 11. Diese computerbasierten bildgebenden Verfahren erzeugen in-fokussierte optisch geschnittene Bilder, und durch Stapeln solcher Bilder kann man rekonstruierte 3D-Bilder der Gefäßwand und des Gefäßnetzwerks in Geweben erhalten Kann Bilder von einem Abschnitt erzeugen , der entlang der Z-Achse des rekonstruierten Bildes 12 , 13 gemacht wird . In diesem Artikel werden wir eine Methode zur Vorbereitung von En-Face-Präparationen der Mausaorta und der Carotis-Arterie zur Immunfluoreszenz-Färbung veranschaulichen. En Gesicht VorbereitungenKann gemacht werden, auch nachdem diese Gefäße experimentell manipuliert worden sind. Zum Beispiel kann eine Carotis-Arterie teilweise ligiert werden und dann eine En-Gesicht Vorbereitung nach einer solchen Operation gemacht. Aus diesem Grund werden wir auch in diesem Artikel beschreiben, wie wir eine partielle Ligation an der Carotis-Arterie machen. Im Vergleich zu ähnlichen Vorbereitungen von größeren Tieren wie Ratten, Kaninchen und Menschen sind die Mausgefäße klein und zerbrechlicher und erfordern so eine zusätzliche Pflege für die Handhabung während der chirurgischen Isolierung von Gefäßen und deren Herstellung für die Antikörperfärbung und Mikroskopie. Weil das am häufigsten verwendete Tiermodell für die genetische Veränderung die Maus ist, wird es für viele Forscher kritisch, Mausgefäße zu behandeln, ohne sie zu beschädigen. In diesem Manuskript werden wir beschreiben, wie man mit den Maus-Blutgefäßen umgehen kann, wenn man Gesichtsvorbereitungen der Maus-Aorta und der Carotis-Arterie herstellt. Zum Zwecke der Demonstration verwenden wir Wildtyp C57 / b6 Mäuse.

<table><tbody><tr><td>0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9788429</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>12556005</td><td></td></tr><tr><td>6-0 coated vicryl suture</td><td>Ethicon</td><td>J833G</td><td></td></tr><tr><td>AF488 goat anti-rat IgG&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11006</td><td></td></tr><tr><td>AF546 goat anti-rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>Sc-8304</td><td></td></tr><tr><td>Aoto Flow System</td><td>Braintree Scientific</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch</td><td>Cardinal Health</td><td>4024</td><td></td></tr><tr><td>Blunt retractors, 2.5 mm wide</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-10</td><td></td></tr><tr><td>Caprofen (Rimadyl)&amp;nbsp;</td><td>zoetis</td><td>NADA#141-199</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine Scrub, 2%</td><td>Med-Vet International</td><td>RXCHLOR2-PC</td><td></td></tr><tr><td>Curity gauze sponges 2 x 2</td><td>Cardinal Health</td><td>KC2146</td><td></td></tr><tr><td>Electric heating pad, 12 x 14</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0667724</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass 22 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393059</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-18</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Equitech-Bio</td><td>GS05</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade mountant with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P-36935</td><td></td></tr><tr><td>Puritan cortton swabs</td><td>VWR</td><td>10806-005</td><td></td></tr><tr><td>Puritan Mini cotton tipped aplicators</td><td>VWR</td><td>82004-050</td><td></td></tr><tr><td>Round handled Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>Silk Suture 6/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5601</td><td></td></tr><tr><td>Strabismus Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14075-09</td><td></td></tr><tr><td>Super Grip Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>Transparent Dressing</td><td>Cardinal Health</td><td>TD-26C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

en face preparation of mouse blood vessels

Abschnitte von Paraffin eingebetteten Geweben werden routinemäßig für das Studium der Gewebe Histologie und Histopathologie verwendet. Es ist jedoch schwierig zu bestimmen, was die dreidimensionale Gewebemorphologie aus solchen Abschnitten ist. Darüber hinaus dürfen die untersuchten Abschnitte der Gewebe nicht die Region innerhalb des Gewebes enthalten, die für den Zweck der laufenden Studie notwendig ist. Diese letztere Begrenzung behindert histopathologische Untersuchungen von Blutgefäßen, da sich vaskuläre Läsionen fokalisiert entwickeln. Dies erfordert eine Methode, die es uns ermöglicht, eine breite Fläche der Blutgefäßwand von ihrer Oberfläche zu tieferen Regionen zu untersuchen. Ein ganzes Vorfeld der Vorbereitung der Blutgefäße erfüllt diese Anforderung. In diesem Artikel werden wir zeigen, wie man Vorbereitungen der Maus-Aorta und der Carotis-Arterie vorbereitet und sie immunofluoreszierend für konfokale Mikroskopie und andere Arten der fluoreszenzbasierten Bildgebung färbt.

Ein typisches En-Face-Immunfluoreszenzbild des Endothels ist in Abbildung 3 dargestellt. Dieses Bild zeigt einen einzigen optischen Abschnitt einer Maus-Aorta in der Nähe der Öffnung einer Intercostal-Arterie (die große dunkle Ei-förmigen Bereich). Die Aorta wurde mit Anti-VE-Cadherin (grün) und Anti-VCAM-1 (vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1) (rot) doppelt gebeizt. Jede endotheliale Zelle wird mit einer grünen linearen Färbung am Adherens-Übergang umrissen. Weg...

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En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Ein Verfahren zur Herstellung von Gesichtspräparaten der Kartoffel-Arterie und Aorta der Maus ist beschrieben. Solche Präparate, wenn sie mit spezifischen Antikörpern immunfluoreszenz gefärbt sind, ermöglichen es uns, die Lokalisation von Proteinen und die Identifizierung von Zelltypen innerhalb der gesamten Gefäßwand durch konfokale Mikroskopie zu untersuchen.

En Face Vorbereitung der Maus Blutgefäße

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

20.9K Aufrufe.  University of Texas MD Anderson Cancer Center.  Ein Verfahren zur Herstellung von Gesichtspräparaten der Kartoffel-Arterie und Aorta der Maus ist beschrieben. Solche Präparate, wenn sie mit spezifischen Antikörpern immunfluoreszenz gefärbt sind, ermöglichen es uns, die Lokalisation von Proteinen und die Identifizierung von Zelltypen innerhalb der gesamten Gefäßwand durch konfokale Mikroskopie zu untersuchen. 

Serie: En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. Its unique anatomy makes the spinotrapezius useful for investigation of ischemic injury and subsequent microvascular remodeling. Here, we demonstrate an arteriolar ligation model in the murine spinotrapezius muscle that was developed by our research team and previously published1-3. For certain vulnerable mouse strains, such as the Balb/c mouse, this ligation surgery reliably creates skeletal muscle ischemia and serves as a platform for investigating therapies that stimulate revascularization. Methods of assessment are also demonstrated, including the use of intravital and confocal microscopy. The spinotrapezius is well suited to such imaging studies due to its accessibility (superficial dorsal anatomy) and relative thinness (60-200 &mu;m). The spinotrapezius muscle can be mounted en face, facilitating imaging of whole-muscle microvascular networks without histological sectioning. We describe the use of intravital microscopy to acquire metrics following a functional vasodilation procedure; specifically, the increase in arterilar diameter as a result of muscle contraction. We also demonstrate the procedures for harvesting and fixing the tissues, a necessary precursor to immunostaining studies and the use of confocal microscopy.

We demonstrate a novel arterial ligation model in murine spinotrapezius muscle, including a step-by-step procedure and description of required instrumentation. We describe the surgery and relevant outcome measurements relating to vascular network remodeling and functional vasodilation using intravital and confocal microscopy.

Murine Spinotrapezius Modell, um die Auswirkungen der Arteriolen Ligation auf mikrovaskuläre Funktion und Remodeling beurteilen

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

Forschung

Medizin

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.
IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 &plusmn; 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 &#181;g/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 &#181;g/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

Vasodilatation isolierter Gefäße und die Isolierung der extrazellulären Matrix von Fest-Haut Mäuse

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Immunologie und Infektion

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Reinigung von Maus-Hirngefäße

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Neurowissenschaften

<meta charset="utf8"></head><body>Visualisierung von retinalen Perizyten mittels Gewebeclearing und Fluoreszenzmarkierung

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

Biochemie

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Vorbereitende Schritte für die Messung der Reaktivität in Maus retinalen Arteriolen Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

Beurteilung der therapeutischen Angiogenese in einem Murine-Modell von Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

Dolichoektasie: Vaskuläre Demenz und Alzheimer

A Visual Approach for Inducing Dolichoectasia in Mice to Model Large Vessel-Mediated Cerebrovascular Dysfunction

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to enter and expel excessive amino acids or toxins from the brain. To model how the BBB can be compromised in diseases like vascular dementia (VaD) or Alzheimer's disease (AD), researchers developed novel methods to model vessel dilatation. A compromised BBB in these disease states can be detrimental and result in the dysregulation of the BBB leading to untoward and pathological consequences impacting brain function. We were able to modify an existing technique that enabled us to inject directly into the Cisterna magna (CM) to induce dilatation of blood vessels using elastase, and disrupt the tight junctions (TJ) of the BBB. With this method, we were able to see various metrics of success over previous techniques, including consistent blood vessel dilatation, reduced mortality or improved recovery, and improving the fill/opacifying agent, a silicone rubber compound, delivery for labeling blood vessels for dilatation analysis. This modified minimally invasive method has had promising results, with a 19%-32% increase in sustained dilatation of large blood vessels in mice from 2 weeks to 3 months post-injection. This improvement contrasts with previous studies, which showed increased dilatation only at the 2 week mark. Additional data suggests sustained expansion even after 9.5 months. This increase was confirmed by comparing the diameter of blood vessels of the elastase and the vehicle-injected group. Overall, this technique is valuable for studying pathological disorders that affect the central nervous system (CNS) using animal models.

Autor im Rampenlicht: Modellierung vaskulärer Beiträge zur Alzheimer-Krankheit bei transgenen Mäusen

We demonstrate chemically inducing large blood vessel dilatation in mice as a model for investigating cerebrovascular dysfunction, which can be used for vascular dementia and Alzheimer's disease modeling. We also demonstrate visualizing the vasculature by injecting silicone rubber compound and providing clear visual guidance for measuring changes in blood vessel size.

Ein visueller Ansatz zur Induktion von Dolichoektasie bei Mäusen zur Modellierung der durch große Gefäße vermittelten zerebrovaskulären Dysfunktion

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to ...

En Face Vorbereitung der Maus Blutgefäße

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Murine Spinotrapezius Modell, um die Auswirkungen der Arteriolen Ligation auf mikrovaskuläre Funktion und Remodeling beurteilen

Vasodilatation isolierter Gefäße und die Isolierung der extrazellulären Matrix von Fest-Haut Mäuse

Reinigung von Maus-Hirngefäße

3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung

3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung

3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung

Vorbereitende Schritte für die Messung der Reaktivität in Maus retinalen Arteriolen Ex Vivo

Beurteilung der therapeutischen Angiogenese in einem Murine-Modell von Hindlimb Ischemia

Ein visueller Ansatz zur Induktion von Dolichoektasie bei Mäusen zur Modellierung der durch große Gefäße vermittelten zerebrovaskulären Dysfunktion

Ein visueller Ansatz zur Induktion von Dolichoektasie bei Mäusen zur Modellierung der durch große Gefäße vermittelten zerebrovaskulären Dysfunktion