Diese Arbeit wurde von einer ARRA Ergänzung zur Lebensdauer / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 und K24HD080539 BR unterstützt. Diese Arbeit wurde auch von Lifespan Pilot Research Fund (# 701- 5857), Rhode Island Foundation Medical Research Grant (# 20133969), und NIH COBRE URI / RIH Pilot Research Grant (P20GM104317) bis ML unterstützt. Wir danken James Myall und Vy Dang für die Hilfe bei der Handschrift und Figur Vorbereitung.

1. Zellkultur und HIV-1-Infektion HINWEIS: Bevor Experimente starten, wird empfohlen , 12 der Zellen Lebensfähigkeit durch Trypan - Blau - Färbung 11 und deren Proliferation durch einen MTT - Test zu überprüfen. Es ist auch wichtig neu vorbereitet SILAC Medium zu verwenden. Verschiedene Zelllinien können verwendet werden, solange sie in einem aktiv proliferative Phase, und sind anfällig gegenüber HIV-1-Infektion, oder die Testbedingung der Wahl. In diesem Protokoll verwenden H9-Zelllinie als Beispiel. <ol><li> Seed 2 x 10 &amp; sup6 ; H9 - Zellen in jeder Zellkulturflasche. Wachsen eine Gruppe in 10 ml RPMI 1640 - markiertem Medium , enthaltend 10% dialysiertes fötales Rinderserum (FBS), 100 mg / L 13 C 6 L-lysin und 100 mg / L 13 C 6 15 N 4 L-Arginin. Wachsen die andere Gruppe in 10 ml unmarkierten RPMI 1640-Medium, das mit 10% dialysiertem FBS, 100 mg / l L-Lysin und 100 mg / l L-Arginin. </li><li>Wachsen die Zellen für sechs Verdopplungen an welchem ​​Punkt der Proteine ​​der Zellen in dem markierten Medium praktisch vollständig markiert (&gt; 99%) mit schweren Aminosäuren. Fügen Sie frische Medien oder Medien regelmäßig zu ändern (alle 1-3 Tage, je nach der Art der Zelle. Für H9 Zelle ändern Medium alle 3 Tage). Am Ende der Markierung erhöhen Kulturvolumen (zB ~ 30 ml) das Wachstum von Zellen unterzubringen. HINWEIS: Bestimmen genaue Zellenzeit am Beginn des Experiments über den Trypan-Blau-Färbung und Zellzählung zu verdoppeln. </li><li> Infect die markierten Zellen mit HIV-1 NL4-3 mit Standard - HIV-1 - Infektion Protokoll 13 für 48 Stunden. Inkubieren der Zellen mit geeigneten Mengen an Virus mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) etwa 0,3. Überprüfen, HIV-1-Infektion durch p24 Quantifizierung der Kulturüberstände unter Verwendung eines HIV-1 p24-Antigen-ELISA-Kit. Führen Sie eine Immunfluoreszenztest 14 erfolgreiche Infektion von Zellen zu bestätigen. Keep wächst die unmarkierten Zellen in unmarkierten Medium ohne HIV-1-Infektion. </li><li> Ernte der Überstände beider Gruppen am Ende der Infektion (Schritt 2.1). </li></ol> 2. exosome Isolation Hinweis: Durch eine Reihe von Schritten Ultrazentrifugation, exosomalen Fraktionen aus Kulturüberstände werden 15 angereichert. Führen alle folgenden Schritte wurden bei 4 ° C mit einer Ultrazentrifuge Rotor, der eine Geschwindigkeit von mindestens 100.000 x g erreichen kann. <ol><li> Sammle den Überständen der Kulturen in 50 ml konischen Röhrchen, die Vermeidung Zellen. Zentrifugieren für 10 min bei 300 xg, um die verbleibenden Zellen zu entfernen. </li><li> Sammeln Sie die Überstände in neue 50 ml konische Röhrchen und zentrifugieren 10 min bei 2000 × g tote Zellen zu entfernen. Übertragungsüberstände auf kommerzielle Rotor-kompatiblen Röhren führt, die fähig sind Ultrazentrifugation zu widerstehen. </li><li> Achten Sie darauf, die Ultrazentrifugenröhrchen zu balancieren. Zentrifugieren der Röhrchen für 30 min bei 10.000 × g zu entfernenZelltrümmer. </li><li> Sammeln Sie die Überstände in Ultraröhrchen und Zentrifuge für 70 min bei 100.000 x g. Die Überstände verwerfen. </li><li> Resuspendieren der exosome reichen Pellets in 5 ml frischem PBS. Übertragen Sie die Lösungen an die frische Ultrazentrifuge Rohre und Zentrifuge wieder für 70 min bei 100.000 x g. </li><li> Verwerfen Stände. Zum Speichern der Exosomen langfristig Resuspendieren der Pellets in 50 ul PBS und bei -80 ° C. Alternativ gehen Sie direkt zur Proteinextraktion, wie unten gezeigt. </li></ol> 3. Proteinextraktion und Vorbereitung <ol><li> Löse isoliert exosomalen Pellets in 100-200 ul RIPA-Lyse und Extraktionspuffer mit zusätzlichen Protease-Inhibitor-Cocktails. Der Puffer besteht aus 25 mM Tris-Hydrochlorid, 150 mM Natriumchlorid, 1% NP-40, 1% Natriumdesoxycholat und 0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei pH 7,6. Die Protease-Inhibitor-Cocktails sollte eine Vielzahl von Protease-Inhibitoren enthalten, wie Aprotinin, Bestatin, leupeptin, Pepstatin A und EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), das kann eine vollständige Palette von Proteasen hemmen. </li><li> Zentrifugieren Sie die gelösten Lösungen für 10 Minuten bei 13.000 × g (4 ° C), und übertragen Sie die gelöscht Stände auf neue 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Quantifizieren Proteinkonzentration jeder Probe von Exosomen mit Bicinchoninsäure (BCA) oder Bradford - Test 16. </li><li> Mischen Sie eine gleiche Menge an Proteinen (2 ug) von markierten und unmarkierten Proben und führen Sie die gleiche Mischung auf einem 4-20% SDS-PAGE-Gel bei 120 mA / 200 V für 30 min. </li><li> Stain Gel mit Coomassie - Blau , gefolgt von 17 Entfärben. </li><li> Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie die Probenspur aus dem Gel. Dann schneiden Sie das Gel Spur in 10-15 gleich große Stücke. Legen Sie jedes Stück in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für insgesamt 10-15 Rohre. </li><li> Tauchen Sie Würfel in 25 mM NH 4 HCO 3 in 50% Acetonitril, Wirbel, und -Überstände verwerfen. Zweimal wiederholen. TrockenWürfel in einem Vakuum - Konzentrator 18, 19. </li><li> Rehydrate Würfel mit 10 mM Dithiothreitol (DTT), Wirbel und Zentrifuge kurz. Inkubieren bei 56 ° C für 1 Stunde. Überstand verwerfen. </li><li> Tauchen Gelwürfel in 55 mM Iodacetamid, Wirbel, und Spin. Inkubieren bei Raumtemperatur im Dunkeln für 45 min. Überstand verwerfen. </li><li> Tauchen Sie Würfel in 25 mM NH 4 HCO 3, Wirbel, Spin und Überstand verwerfen. </li><li> Tauchen Sie Würfel in 25 mM NH 4 HCO 3 in 50% Acetonitril, Wirbel, und Spin. Wiederholen 3.9 und 3.10. </li><li> Trocknen Sie die Würfel in einem Vakuum-Konzentrator. In 25 ul Sequenziergrad modifizierte Trypsin in 25 mM NH 4 HCO 3, Inkubation bei 4 ° C für 30 min, und entsorgen Sie die überschüssige Lösung. Tauchen Sie Würfel in 25 mM NH 4 HCO 3 ohne Trypsin und Inkubation über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Spin Kurz Würfel nach unten und übertragen die resultierenden Peptid Extract in ein neues Röhrchen. In 30 ul 5% Ameisensäure in 50% Acetonitril zu den Kuben, Wirbel für 30 Minuten, und Spin. Kombinieren Sie den Überstand mit dem Extrakt. Trocknen Sie die Peptidextrakte mit einem Vakuumkonzentrator auf weniger als 5 &amp; mgr; l. </li><li> Senden Proben Massenspektrometrie Core Facility für die LC-MS / MS-Analyse. Die MS-Analysedaten, die von Open Source Software erzeugt werden kann, enthält typischerweise eine Zugangsnummer für jedes identifizierte Protein, gekennzeichnet / nicht-markiertem Verhältnisse und die Anzahl der einzelnen Peptide identifiziert. </li></ol> 4. Western Blotting Verification HINWEIS: Western-Blot wird empfohlen Massenspektrometrie Ergebnisse zu überprüfen. <ol><li> Folgen Standard-Western-Blotting Protokollen und sicherzustellen, dass gleiche Mengen an Protein aus jeder Gruppe geladen werden. Verwenden Antikörper gegen Proteine von Interesse (zB Annexin A5, Laktat - Dehydrogenase - B - Kette) identifiziert durch MS. Western-Blot-Detektion, zusammen mit Densitometrie analysis, kann bestätigen, dass MS Protein Identifizierung und Quantifizierung korrekt sind. </li></ol> 5. Proteomik Datenanalyse HINWEIS: Die Bewertung der Datenqualität, Datenvorbehandlung, Berechnung und Bestimmung der signifikanten Proteinkandidaten werden separat erfolgen für jede MS replizieren. Sobald obigen Analysen abgeschlossen sind, werden die analysierten Daten von Replikaten verglichen und 6 kombiniert, 20, 21. <ol><li> Bewerten Sie die Qualität der MS-Daten. <ol><li> Zunächst log2 die SILAC-MS in einem Tabellenkalkulationsprogramm markierten / nicht markierten Verhältnisse von quantifizierten Proteine ​​verwandeln. </li><li> In der wissenschaftlichen Grafiken und statistische Software, Gruppe die Verhältnisse in 40-100 Verhältnis Bins und zeichnen Sie die Anzahl der Verhältnisse pro Fach ein Histogramm zu erzeugen. Eine normale Verteilung von Histogramm zeigt eine gute Qualität der MS - Daten 6. Führen Sie diesen Schritt für alle MS repliziert. </li></ol></li><li>Um das Vertrauen und die Genauigkeit der MS Peptidverhältnisse erhöhen, sollten Proteine ​​zu entfernen, die weniger als zwei quantifizierten Peptide haben. </li><li> Um zu bestimmen , deutlich nach oben und nach unten reguliert Protein Kandidaten, verwenden Sie die folgenden Schritte zur Berechnung Bedeutung 22 Schwellen. <ol><li> In der wissenschaftlichen Grafiken und statistische Software erzeugen, die den Frequenzverteilungsdaten eine nichtlineare Regression oder Kurvenanpassung. Dieser Schritt ergibt Werte, die verwendet werden können, die Cutoff-Werte zu berechnen. Berechnen Sie die Cut-off-Werte als Median ± 1,96 σ für 95% Vertrauensgrenzen oder 2,56 σ für 99% Vertrauensgrenzen. HINWEIS: Nähere Einzelheiten des Cutoffs Berechnung kann bei Emmott et al. 22. </li><li> Wählen Sie die Proteinkandidaten, deren Verhältnisse sind entweder größer als 1,96 (oder 2,56) Standardabweichungen über dem Mittelwert (signifikant überexprimiert) oder niedriger als 1,96 (oder 2,56) Standardabweichungen unter dem Mittelwert (deutlich unter ausgedrückt). </li></ol></li><li> Vergleichen die Replikate der oben identifizierten signifikanten Kandidaten Konsistenz zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass sie die folgenden Kriterien erfüllen diese letzte Auswahlschritt weitergeben müssen: Kandidaten müssen konsequent in allen Replikaten identifiziert werden; und Replikate eines Kandidaten müssen in der Richtung der Regulierung im Einklang stehen (vorzugsweise mindestens 2 von 3 Wiederholungen eines Kandidaten sollte entweder hochreguliert oder herunterreguliert). </li><li> Finalisieren Daten für die Kandidaten, die die oben genannten Kriterien durch ihre Replikate &quot;Zusammenführen von Daten erfüllen. </li></ol> 6. Bioinformatics Verifikation und Charakterisierung HINWEIS: Die bestehenden genomischen und bioinformatischen Informationen bietet eine Fülle von Informationen für fast jedes Protein. Data Mining und bioinformatische Analyse dieser Informationen können gewinnen viel Einblick in das Eigentum und die Funktionen der bedeutenden Kandidaten helfen. Diese process ist in der Regel notwendig, die richtige nachgeschalteten Nasslaborexperimenten zu entwerfen. <ol><li> Mit ihren GenBank Zugangsnummern oder UniProt IDs, die Kandidaten gegen aktuelle exosome Datenbanken zu suchen (Exocarta 23, Evpedia 24) , um zu überprüfen , dass die Kandidatenproteine zuvor in exosome gefunden wurden. Dieser Schritt fügt eine Schicht von Vertrauen, dass die Kandidaten sind in der Tat in Exosomen. <ol><li> Zugang http://www.exocarta.org/, klicken Sie auf &quot;Abfrage&quot; und geben Sie entweder das Gen oder Protein Name / Zugangsnummer. Eine Zusammenfassung Seite wird angezeigt und die Beweise in exosome wird gezeigt, zur Verfügung gestellt werden, wenn es irgendein. </li></ol></li><li> Suche die Kandidaten gegen die HIV-1 und dem Human Protein - Interaktion Datenbank 25. Alternativ können Sie die spezifischen Datenbanken, die Informationen über die Interaktion der Kandidatenproteine ​​und die Testbedingungen zur Verfügung stellen kann. <ol><li> Zugriff auf die Datenbank bei www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVWechselwirkungen. Auf dem Eintrag &#39;Protein Domain-Namen &quot;, geben Sie die Namen der Kandidaten oder Zugangsnummern, und klicken Sie auf Suche. Die Suchergebnisse können Einblick in die Wechselwirkungen zwischen HIV-1 zur Verfügung stellen und die Protein-Kandidaten, und welche der Kandidaten vorschlagen könnte wirklich HIV-1 in Verbindung gebracht werden. </li></ol></li><li> Import GenBank Zugangsnummern oder UniProt IDs der Kandidaten in GO - Analyse - Software (wie FunRich, Functional Enrichment - Analyse - Tool 26) und die Software ausführen. <ol><li> Laden Sie die Software auf http://www.funrich.org/. Nach der Installation öffnen Sie die Software unter Anreicherung Analyse, klicken Sie auf &quot;Add Data Set&quot;, und die Liste der Protein / Gene hochladen. Als nächstes wählen Sie den Diagrammtyp die GO-Analyse zu visualisieren. HINWEIS: GO Analyseergebnisse werden in Form von Tortendiagrammen visualisiert werden. Dieser Schritt hilft uns, mit den Kandidaten in den Bereichen biologische Verfahren (BP), Cellular Komponente (C assoziiert globalen Einblick zu gewinnenC) und Molecular Funktion (MF). </li></ol></li><li> Zugang DAVID bei http://david.ncifcrf.gov/ 27, klicken Sie auf das &quot;Functional Annotation Tool&quot; auf ihrer Website. Geben Sie die Kandidatenliste, wählen Sie die &quot;Identifier&quot; des Gens wie die &quot;UniProt ID&quot;, wählen Sie &quot;Gene List&quot; und suchen. Die angereicherten GO Begriffe, p-Werte und weitere Parameter können durch Klicken auf die &quot;Annotation Zusammenfassung Ergebnisse&quot; unter der &quot;Gene_Ontology&quot; Kategorie zu finden. </li><li> Um mögliche Wechselwirkungen der Kandidaten mit anderen Proteinen zu untersuchen, verwenden offen zugängliche STRING - Datenbank 28 potentielle Protein-Protein - Wechselwirkungen und mögliche biochemische Wege aufzuklären. HINWEIS: GO Analysis and Functional Annotation (Abschnitt 6,3-6,4) können hier auch die neuesten STRING-Software durchgeführt werden. <ol><li> Zugriff auf die Datenbank bei http://string-db.org/. Geben Sie die Protein-ID oder eine Sequenz in die vorgesehenen search Feld und wählen Sie die richtigen Spezies für die Analyse. Klicken Sie auf &quot;Suchen&quot;. Die Ergebnisse werden Informationen zu den beiden direkten (physischen) geben und indirekte (funktionelle) Verbände. Die Top-Ten bekannte Spiele für die exosomalen Kandidat wird angezeigt und sollte für eine signifikante Kandidatenauswahl berücksichtigt werden. ANMERKUNG: Eine große Menge an Informationen mit den Kandidaten im Zusammenhang analysiert werden können, die Schritte oben. Die wichtigsten Kandidaten zur weiteren nachgelagerten molekularen und biochemischen Analyse ausgewählt werden. </li></ol></li></ol>

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	<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Schorey, J. S., Bhatnagar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+function:+from+tumor+immunology+to+pathogen+biology.">Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology.</a> Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li><li>Booth, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+HIV+Gag+bud+from+endosome-like+domains+of+the+T+cell+plasma+membrane.">Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane.</a> J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).</li><li>Van Engelenburg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+ESCRT+machinery+at+HIV+assembly+sites+reveals+virus+scaffolding+of+ESCRT+subunits.">Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits.</a> Science. 343 (6171), 653-656 (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+exosomes+from+HIV-1-infected+lymphocytic+cells.">Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells.</a> Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li><li>Anderson, L., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins.">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).</li><li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+for+quantitative+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics.</a> Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+MTT+lymphocyte+proliferation+assay+for+the+diagnosis+of+neurocysticercosis.">Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis.</a> J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).</li><li>Cepko, C., Pear, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+infection+of+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li><li>Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+immunofluorescence+assay+for+antibodies+to+human+immunodeficiency+virus.">Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus.</a> J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).</li><li>Olson, B. J. S. C., Markwell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2001).</li><li>Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+staining+for+high+sensitivity+gel-based+proteomics.">Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics.</a> J Proteom. 90, 96-106 (2013).</li><li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ChroP+approach+combines+ChIP+and+mass+spectrometry+to+dissect+locus-specific+proteomic+landscapes+of+chromatin.">The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+the+comparative+analysis+of+multiprotein+complexes+based+on+15N+metabolic+labeling+and+quantitative+mass+spectrometry.">A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-loop+binding+protein+is+a+multifaceted+cellular+regulator+of+HIV-1+replication.">Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication.</a> J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).</li><li>Li, M., Ramratnam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Characterization+of+Exosomes+from+HIV-1-Infected+Cells.">Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells.</a> Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).</li><li>Emmott, E., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+interaction+partners+in+mammalian+cells+using+SILAC-immunoprecipitation+quantitative+proteomics.">Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Keerthikumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExoCarta:+A+Web-Based+Compendium+of+Exosomal+Cargo.">ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo.</a> J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).</li><li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EVpedia:+a+community+web+portal+for+extracellular+vesicles+research.">EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research.</a> Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).</li><li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1,+human+protein+interaction+database+at+NCBI.">Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI.</a> Nucleic Acids Res. 37, 417-422 (2009).</li><li>Pathan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FunRich:+An+open+access+standalone+functional+enrichment+and+interaction+network+analysis+tool.">FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool.</a> Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2011:+functional+interaction+networks+of+proteins,+globally+integrated+and+scored.">The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored.</a> Nucleic Acids Res. 39, 561-568 (2011).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2006).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Webber, J., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+pure+are+your+vesicles.">How pure are your vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li><li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1:+purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants.">Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).</li><li>Chertova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+biochemical+analysis+of+purified+human+immunodeficiency+virus+type+1+produced+from+infected+monocyte-derived+macrophages.">Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages.</a> J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).</li><li>Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics:+an+overview.">Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview.</a> Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).</li></ol>

The authors have declared no conflict of interest.

In den in diesem Dokument beschrieben, haben wir gezeigt, die Anwendung der SILAC Technik, um die Wirkung von HIV-1-Infektion auf dem Host exosomalen Proteom zu untersuchen. Anfänglich nicht infizierten und HIV-1-infizierten Zellen sind unterschiedlich isotopenmarkierten. Die differentiell markierten Exosomen werden dann gereinigt, bevor die Proteinextraktion durchgeführt wird. Als nächstes wird die Massenspektrometrie-Flüssigchromatographie-Tandem eingesetzt, um die exosomalen Proteom zu analysieren. Schließlich w...

Viele menschliche Erkrankungen, einschließlich Virusinfektionen sind häufig mit ausgeprägten zellulären Prozessen verbunden, die stattfinden und um in den betroffenen Zellen. Die Proteine, die oft als die ultimative zelluläre Effektoren wirken, diese Prozesse vermitteln. Die Analyse der Proteine ​​können oft wertvolle Informationen über die lokale Umgebung der betroffenen Zellen liefern und uns helfen, die zugrunde liegenden Mechanismus der Pathogenese der Erkrankung zu verstehen. Unter den verschiedenen Techniken der Proteinanalytik, hält Proteomik besonders vielversprechend. Als leistungsstarker, groß angelegte Tool können Proteomik ein systemisches Verständnis zellulärer Prozesse schaffen, vor allem im Bereich der Funktion und Interaktion von Proteinen. spezifische Proteine ​​zu analysieren ist einfacher durch die Entwicklung von Markierungstechniken hergestellt, die Forscher ermöglichen, die Expression von zellulären Komponenten zu überwachen, insbesondere Proteine, in den Ort der Untersuchung. Obwohl viele Proteom-Analysen wurden auf zellulärer durchgeführt worden istProteom - Skala, Proteomik Charakterisierungen auf subzellulärer Kompartimente haben sich als besonders informativ 1 zu sein. Dies wird beispielhaft auch in den Studien von HIV-1-Infektion. Exosomen, 30-100 nm Membranvesikel von einer Vielzahl von Zelltypen sekretiert 2, 3, sind kritische Komponenten der interzellulären Kommunikation und molekularen Transport. Sie waren zuvor eine wichtige Rolle bei der HIV-1 - Knospungsvorgang 4, 5 zu spielen entdeckt. Durch die Proteomanalyse mit funktionellen Dissektion kombiniert, fanden wir , dass von HIV-1 - infizierten Zellen freigesetzt Exosomen bestehen aus einer einzigartigen und quantitativ unterschiedliche Proteinsignatur und Hafen regulatorische Moleküle , die auf benachbarten empfänglichen Zellen zelluläre Eigenschaften beeinflussen, einschließlich der zellulären Apoptose und Proliferation 6. Die Verfahren werden in diesem Protokoll beschrieben ist,nämlich SILAC (Silac) 7 basierend proteomic Charakterisierung von Exosomen aus HIV-1 - infizierten Zellen. Ähnliche Ansätze können durch Einstellen der experimentellen Spannung auf den bestimmten Kompartiment oder einen Bruchteil von Interesse und die erforderlichen Änderungen an den beschriebenen Verfahren besser verstehen zu anderen subzellulären Kompartimenten während der Pathogenese angewendet werden. In Anbetracht der jüngsten Entwicklung von quantitativen Proteomik Methoden gibt es viele zur Auswahl, wenn die effizienteste Methode für ein bestimmtes Experiment ausgewählt. Unter diesen sind die chemisch-basierte iTRAQ (isobar Tags für relative und absolute Quantifizierung) 8 und die markierungsfreie MRM (multiple reaction monitoring) 9 Techniken. Beide Methoden sind leistungsfähige Werkzeuge und sind eine gute Wahl für spezifische Einstellungen. Für eine typische Labor hauptsächlich mit Zelllinien arbeiten, jedoch sind diese beiden Methoden relatively höheren Kosten und sind zeitaufwendig, wenn sie der SILAC basierte Methode verglichen. SILAC ist eine Stoffwechsel basierten Markierungstechnik, die Formen der Aminosäuren aus dem Kulturmedium in zelluläre Proteine ​​nicht-radioaktiven Isotopen enthält. Typischerweise beginnen, SILAC Experimente mit zwei Zellpopulationen, beispielsweise infizierte und nicht infizierte. Jedes Zimmer ist unterschiedlich in seiner spezifischen Isotopen Umgebung markiert bis zur vollständigen Kennzeichnung erreicht wird. Die markierten Exosomen dieser Zellen werden dann an die Proteinextraktion unterzogen. Sobald extrahiert, werden die markierten exosomalen Proteine analysiert Flüssigchromatographie Tandem - Massenspektroskopie 10. Schließlich werden die Ergebnisse der Massenspektrometrie und deutlich markierten Proteine ​​zu statistischen unterworfen und Bioinformatik-Analysen sowie strenge biochemische Überprüfung. Unsere bisherigen Untersuchungsberichte deuten darauf hin, dass die SILAC / exosome Verfahren besser geeignet sind für Zelllinien als primäre Zellen, wie Zelllinien sind in der Regel in einaktiv proliferierenden Zustand für eine effiziente Isotopenmarkierung,

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="625">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">H9 cell line</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td style="width:111px;">HTB-176</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">15250061</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">MTT assay kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">V13154</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:227px;">Dialyzed fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">26400044</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">SILAC Protein Quantitation Kit &#8211; RPMI 1640</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">89982</td>
			<td style="width:168px;">DMEM version (89983)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">88434</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">88431</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">HIV-1NL4-3&#160;&#160;</td>
			<td style="width:121px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:111px;">2480</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit</td>
			<td style="width:121px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:111px;">NEK050001KT</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Refrigerated super-speed centrifuge</td>
			<td style="width:121px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:111px;">22628045</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Refrigerated ultracentrifuge</td>
			<td style="width:121px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">363118</td>
			<td style="width:168px;">Should be able to reach 100,000g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">14-432-22</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Ultracentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:121px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">326823</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">SW 32 Ti Rotor</td>
			<td style="width:121px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">369694</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">89900</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Protease Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">&#160;78430</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">ThermoMixer&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:111px;">5384000020</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">23250</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:111px;">1702525</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">SDS PAGE Gel apparatus</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">EI0001</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td style="width:121px;">Novex</td>
			<td style="width:111px;">XV04200PK20</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Gel staining reagent</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G1041</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">V5111</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">SpeedVac Concentrator</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">SPD131DDA</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Antibody to human annexin A5</td>
			<td style="width:121px;">Abcam</td>
			<td style="width:111px;">ab14196</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Antibody to human lactate dehydrogenase B chain</td>
			<td style="width:121px;">Abcam</td>
			<td style="width:111px;">ab53292</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:227px;">Graphing and Statistical Software</td>
			<td style="width:121px;">Systat&#160;</td>
			<td style="width:111px;">SigmaPlot&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Or GraphPad Prism</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Quantitative proteomics software suite</td>
			<td style="width:121px;">Max Planck Institue of Biochemistry</td>
			<td style="width:111px;">Maxquant&#160;</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Software and databases</td>
			<td style="width:121px;">Various vendors</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:168px;">Refer to main text for details</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silac based proteomic characterization of exosomes from hiv-1 infected cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

1A ist ein Flussdiagramm , umreißt das SILAC Markierungsverfahren 21. Um die Exosomen zu reinigen, müssen die Proben über Zentrifuge geschleudert werden. 1B zeigt die Schritte exosome Reinigung durch Ultrazentrifugation serielle 21. Nach der Reinigung sind die Exosomen unter experimentellen Proteomanalyse wie in dem Verfahren beschrieben. <str...

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SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Hier beschreiben wir eine quantitative Proteomik Verfahren die Technik der Silac (SILAC) mit Hilfe der Wirkung von HIV-1-Infektion auf Host exosomalen Proteome zu analysieren. Dieses Protokoll kann leicht an Zellen unter verschiedenen Stress oder Infektionsbedingungen angepasst werden.

SILAC Based Proteomic Charakterisierung von Exosomen aus HIV-1-infizierten Zellen

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

silac-based-proteomic-characterization-exosomes-from-hiv-1-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.6K Aufrufe.  Brown University.  Hier beschreiben wir eine quantitative Proteomik Verfahren die Technik der Silac (SILAC) mit Hilfe der Wirkung von HIV-1-Infektion auf Host exosomalen Proteome zu analysieren. Dieses Protokoll kann leicht an Zellen unter verschiedenen Stress oder Infektionsbedingungen angepasst werden. 

Serie: SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Verstärkung und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-infizierten Personen mit Viruslast unter der Nachweisgrenze von Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Neue Tools erweitern regulatorischen T-Zellen von HIV-1-infizierten Personen

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualisierung von HIV-1 Gag Bindung an Riesen unilamellare Vesikeln (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.