Bu çalışma BR ömrü / Tufts / Kahverengi SYAO, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 ve K24HD080539 bir arra ek tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda ömrü Pilot Araştırma Fonu (# 701- 5857), Rhode Island Vakfı Tıbbi Araştırma Grant (# 20133969), ve ML NIH COBRE URI / RİH Pilot Araştırma Grant (P20GM104317) tarafından desteklenmiştir. Biz el yazması ve şekil hazırlanması ile ilgili yardım için, James Myall ve Vy Dang teşekkür ederiz.

1. Hücre Kültürü ve HIV-1 enfeksiyonu NOT: deneyler başlamadan önce, bir MTT testi 12 ile Tripan Mavisi boyaması 11 ile hücrelerin canlılığı ve çoğalmasını kontrol edilmesi tavsiye edilir. Aynı zamanda yeni hazırlanan SILAC ortamını kullanmak için kritik öneme sahiptir. Çeşitli hücre çizgileri de aktif olarak çoğalma aşamasında olan ve HIV-1 enfeksiyonu, veya tercih test koşulu duyarlı olduğu sürece, kullanılabilir. Bu protokol, örnek olarak H9 hücre hattı kullanın. <ol><li> Her bir hücre kültür şişesi içine Tohum 2 x 10 6 H9 hücreleri. % 10 diyalize edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 100 mg / L &#39;13C 6 L-lizin ve 100 mg / L 13 C 6 15 N4, L-arginin ihtiva eden RPMI 1640 ortamında etiketli 10 ml bir grup büyütün. FBS% 10 diyalizlenmiş, 100 mg / L L-Lizin ile 100 mg / L L-arginin ile, 10 ml işaretlenmemiş RPMI 1640 ortamı diğer grup büyütün. </li><li>Ağır amino asitler ile etiketlenmiş ortam içinde hücrelerin proteinler, hemen hemen tamamen etiketlenir ve bu noktada altı katlanmaya (&gt;% 99) hücreleri büyütün. taze medya ekleyin veya düzenli ortamı değiştirmek (her 1-3 gün hücre tipine bağlı olarak. H9 hücre için, orta her 3 günde değiştirme). Etiketleme sonunda, daha fazla hücre büyümeyi kültür hacmi (örneğin ~ 30 mi) artar. Not: Tripan Blue lekelemesi ve hücre sayımı ile deneyin başlangıcında ikiye katlanma süresinde tam hücre belirler. </li><li> HIV-1 NL4-3 48 saat boyunca standart bir HIV-1 enfeksiyonu protokolü 13 ile etiketlenmiş hücreleri enfekte etmektedir. 0.3 civarında bir enfeksiyon çokluğu (MOI) virüs uygun miktarlarda hücreleri inkübe edin. Bir HIV-1 p24 antijen ELISA kiti kullanılarak kültür süpernatanlarının p24 miktarının HIV-1 enfeksiyonu kontrol edin. Hücrelerin başarılı enfeksiyonu teyit etmek için bir immünofloresan tahlil 14 gerçekleştirin. Keep, HIV-1 enfeksiyonu olmayan etiketlenmemiş ortam içinde etiketlenmemiş hücrelerin büyüyen. </li><li> enfeksiyon sonunda (adım 2.1) de her iki grubun süpernatantlar hasat. </li></ol> 2. Exosome İzolasyon Not: ultrasantrifügasyon bir dizi aşama ile, kültür süpernatanlarından exosomal kısımlar 15 zenginleştirilmiştir. En az 100,000 x g hızda ulaşabilir Ultrasantrifüj rotoru ile 4 ° C &#39;de, aşağıdaki adımları gerçekleştirir. <ol><li> Hücreleri kaçınarak, 50 ml konik tüplerde kültürlerin süpernatantlar toplayın. kalan hücrelerin çıkarılması için, 300 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Yeni 50 ml konik tüplerde süpernatantlar toplamak ve ölü hücreleri çıkarmak için 2,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj. Ultrasantrifügasyon dayanabildiğinden ticari rotor uyumlu tüplere süpernatantlar elde edilen transfer. </li><li> ultrasantrifüjdeki tüpleri dengelemek için emin olun. çıkarmak için 10,000 x g&#39;de 30 dakika boyunca santrifüj tüplerihücre enkazı. </li><li> 100,000 x g&#39;de 70 dakika süreyle ultrasantrifüj tüplerde süpernatantlar ve santrifüj toplayın. süpernatantlar atın. </li><li> Taze PBS 5 ml eksozom zengin pelet yeniden süspanse edin. 100,000 x g&#39;de 70 dakika boyunca tekrar taze ultrasantrifüj tüpleri ve santrifüj çözüm aktarın. </li><li> Sil süpernatantlar. eksozomlar uzun vadeli saklamak için, -80 ° C de PBS ve mağaza 50 ul pelet tekrar süspansiyon. Aşağıda gösterildiği gibi, alternatif olarak, bir protein ekstre doğrudan devam edin. </li></ol> 3. Protein Ekstraksiyon ve Hazırlık <ol><li> katma proteaz inhibitörü kokteyl ile 100-200 ul RIPA lizis ve ekstraksiyon tamponu izole exosomal pelet çözülür. Tampon pH 7.6, 25 mM Tris-hidroklorür, 150 mM sodyum klorid,% 1 NP-40,% 1 sodyum deoksikolat ve% 0.1 SDS (sodyum dodesil sülfat) oluşmaktadır. proteaz inhibitörü kokteyl Aprotinin, bestatin, l gibi proteaz inhibitörleri, çeşitli içermelidireupeptin, A ve EDTA (etilendiamin tetraasetik asit) pepstatin, bu proteazların bir dizi inhibe edebilir. </li><li> 13.000 xg (4 ° C) &#39;de 10 dakika boyunca eritildi çözüm santrifüj ve yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine temizlenir süpernatantlar aktarın. </li><li> Bisinkoninik asit (BCA) ya da Bradford tahlili 16 kullanılarak eksozom Her numunenin protein konsantrasyonu ölçmek. </li><li> etiketlenmiş ve etiketlenmemiş örneklerden protein eşit miktarda (2 ug) karıştırın ve 120 mA&#39;da% 4-20 SDS-PAGE jel üzerinde eşit bir karışımı çalıştırmak / 200 V, 30 dakika. </li><li> Coomassie Mavisi ile Leke jel 17 lekenin izledi. </li><li> Bir jilet kullanarak, jel örnek şeritten kesti. Sonra 10-15 eşit parçaya jel şeritten kesti. 10-15 tüpler toplam taze bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine her parçası koyun. </li><li> % 50 asetonitril, girdap, 25 mM NH4 HCO3 küpleri daldırın ve süpernatantlar atın. İki kez tekrarlayın. KuruBir vakum konsantratör 18 19 küp. </li><li> 10 mM ditiyotreitol (DTT), girdap ve santrifüj kısaca ile küpleri rehidrate. 1 saat boyunca 56 ° C&#39;de inkübe edin. Süpernatantı atın. </li><li> 55 mM iyodoasetamit, girdap ve spin jel küpleri daldırın. 45 dakika boyunca, karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edin. Süpernatantı atın. </li><li> 25 mM NH 4 HCO 3, girdap, spin küpler daldırın ve supernatant atın. </li><li> % 50 asetonitril, girdap ve spin 25 mM NH 4 HCO 3 küpler daldırın. 3.9 ve 3.10 tekrarlayın. </li><li> bir vakum deriştirme aygıtı içinde, küpler kurutun. 25 mM NH4 HCO3 25 ul sıralaması derecesi modifiye tripsin ekleyin, 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe ve fazla solüsyonu atın. Tripsin olmayan 25 mM NH4 HCO3 küpleri bırakın ve gece boyunca 37 ° C enkübe edilir. </li><li> Kısaca aşağı küpler spin ve ekstra ortaya çıkan peptid transferiyeni bir tüpe CT. 30 dakika ve dönüş için, küp% 50 asetonitril içinde bir girdap% 5 formik asit içinde 30 ul ekle. ekstraktı ile süpernatant birleştirin. en az 5 ul bir vakum konsantratör peptid kurutun. </li><li> LC-MS / MS analizi için kütle spektrometresi çekirdek imkan numuneleri gönder. açık kaynak yazılım elde edilebilir MS analizi verileri, tipik bir katılım tanımlanan her protein için sayı, etiketli / etiketsiz oranları ve belirlenen eşsiz peptidler numarasını içerir. </li></ol> 4. Western Blot Doğrulama Not: Western lekeleme kütle spektrometresi sonuçları doğrulamak için tavsiye edilir. <ol><li> Standart batı lekeleme protokolleri takip ve yüklenen her gruptan protein, eşit miktarda sağlamak. MS tarafından belirlenen faiz proteinlerine karşı antikorlar (örneğin anneksin A5, laktat dehidrogenaz B zinciri) kullanın. dansitometrisi analysi ile Western lekeleme algılamas, MS protein tanımlama ve miktar doğru olduğunu teyit edebilir. </li></ol> 5. Proteomik Veri Analizi NOT: Her MS çoğaltmak için önemli bir protein adayların veri kalitesinin değerlendirilmesi, veri hazırlama, hesaplama ve kararlılık ayrı ayrı yapılır. Yukarıdaki analizler tamamlandığında, çoğaltır analiz verileri karşılaştırılmış ve 21 20, 6 birleştirdi. <ol><li> MS verilerin kalitesini değerlendirin. <ol><li> İlk olarak, SILAC-MS bir elektronik tablo programı / sayısal proteinlerin etiketsiz oranları etiketli dönüşümü log2. </li><li> bilimsel grafik ve istatistiksel yazılım, grup içinde 40-100 oran bidonları içine oranları ve bir histogram oluşturmak için göz başına oranları sayısını arsa. Histogram bir normal dağılım MS verilerinin 6 kaliteli olduğunu gösterir. Tüm MS çoğaltır için bu adımı yapmak. </li></ol></li><li>MS peptid oranları güven ve doğruluğunu artırmak için, en az iki sayısallaştırılmış peptidler olan proteinlerin kaldırmayı düşünün. </li><li> Önemli ölçüde yukarı ve aşağı düzenlenmiş protein adayları belirlemek için, önemi 22 eşikleri hesaplamak için aşağıdaki adımları kullanın. <ol><li> bilimsel grafik ve istatistik yazılımı olarak, frekans dağılım verilerine olmayan bir lineer regresyon veya eğri-fit oluşturmak. Bu adım, kesme değerlerini hesaplamak için kullanılabilir değerleri elde edilir. % 99 güven sınırları için 1.96,% 95 güven sınırları için σ veya 2.56 σ ± medyan olarak kesme değerlerini hesaplayın. NOT: kesilecek hesaplanması spesifik ayrıntılar Emmott ark bulunabilir. 22. </li><li> ya medyan altında (belirgin aşırı ifade edilir) ortanca üzerinde fazla 1.96 (veya 2.56) standart sapmalar veya daha düşük 1.96 (veya 2.56) standart sapmalar (kimin oranları protein adayları seçmekönemli ölçüde altında ifade edilir). </li></ol></li><li> tutarlılığı sağlamak için yukarıda tanımlanan önemli adayların çoğaltır karşılaştırın. Onlar bu son seçim adımı geçmesi için aşağıdaki kriterlere uygun olduğundan emin olun: Adayların sürekli tüm çoğaltır tespit edilmelidir; ve bir adayın çoğaltır düzenleme onların yönünde tutarlı olmalıdır (up-regüle veya aşağı-regüle tercihen bir adayın 3 çoğaltır üzerinden en az 2 ya da olmalıdır). </li><li> onların çoğaltır &#39;verilerini birleştirerek yukarıda belirtilen ölçütleri karşılayan adaylar için veri tamamlayın. </li></ol> 6. Biyoinformatik Doğrulama ve Karakterizasyonu NOT: Mevcut genomik ve biyoinformatik bilgiler hemen hemen her protein için bilgi hazinesi sunuyor. Bu bilgilere Veri madenciliği ve biyoinformatik analizi önemli adayların mülkiyet ve işlevleri içgörü büyük bir kazanma konusunda yardımcı olabilir. bu Process uygun aşağı ıslak laboratuvar deneyleri tasarlamak için genellikle gereklidir. <ol><li> Onların GenBank Erişim numaraları veya UniProt kimlikleri, mevcut eksozom veritabanlarının karşı aday arama (Exocarta 23, Evpedia 24) kullanarak aday proteinleri daha önce exosome bulunmuştur doğrulamak için. Bu adım adayları Eksozomlann gerçekten de olan güven bir katman daha ekler. <ol><li> Erişim http://www.exocarta.org/, &quot;sorgu&quot; ve giriş ya gen veya protein adı / erişim numarası tıklayın. Bir özet sayfası görünecek ve exosome deliller herhangi varsa sağlanan gösterilir. </li></ol></li><li> HIV-1 ve insan Protein Etkileşimi Veri 25 aleyhinde bulundu. Alternatif olarak, aday proteinlerin etkileşim ve deney durumu hakkında bilgi verebilir belirli veritabanlarında arama. <ol><li> www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIV de veritabanına erişmekEtkileşimler. &#39;Protein etki alanı adı&#39; Girişte adayların adlarını veya katılım numaralarını girin ve arama tıklayın. Arama sonuçları HIV-1 ve protein adaylar arasındaki etkileşimlerin içgörü sağlamak ve gerçekten HIV-1 ile ilişkili olabilir adayların hangi önerebilirsiniz. </li></ol></li><li> İthalat GenBank numaraları ya da (örneğin FunRich, Fonksiyonel Zenginleştirme analiz aracı 26 gibi) GO analiz yazılımı içine adayların UniProt kimlikleri ve yazılımı çalıştırmak. <ol><li> http://www.funrich.org/ de yazılımını indirin. Yükleme tamamlandıktan sonra, zenginleştirme analizi altında, tıklayın &quot;Veri Kümesi Ekle&quot; Yazılımı açmak ve protein / genlerin listesini yükleyin. Sonraki GO analizi görselleştirmek için grafik türünü seçin. NOT: GO analiz sonuçları pasta grafikler şeklinde görüntülenmiştir edilecektir. Bu adım (Biyolojik Süreci (BP), Hücresel Bileşeni alanlarında adayları ile ilişkili küresel fikir edinmek için C yardımcı olurC) ve moleküler işlev (MF). </li></ol></li><li> Erişim DAVID http://david.ncifcrf.gov/ 27 de, kendi web sitesinde &quot;Fonksiyonel Annotation Tool&quot; tıklayın. Gibi &quot;UniProt kimliği&quot; olarak genin &quot;Identifier&quot; seçeneğini, aday listesine girin &quot;Gen Listesi&quot; ve arama seçin. zenginleştirilmiş GO şartları, p-değerleri ve diğer parametreler &quot;Gene_Ontology&quot; kategorisi altında &quot;Annotation Özeti Sonuçları&quot; sayfasını tıklayarak ulaşabilirsiniz. </li><li> Diğer proteinler ile adayların potansiyel etkileşimleri araştırmak için, potansiyel protein-protein etkileşimleri ve olası biyokimyasal yollar aydınlatmak için açıkça erişilebilir STRING veritabanı 28 kullanın. NOT: Analiz ve Fonksiyonel Açıklaması (Bölüm 6,3-6,4) GO da son STRING yazılımı kullanılarak yapılabilir. <ol><li> http://string-db.org/ de veritabanına erişmek. belirlenen s girdi protein kimliği veya diziAraması kutu ve analiz için doğru tür seçin. &quot;Ara&quot; düğmesini tıklatın. Sonuçlar hem doğrudan (fiziksel) ve dolaylı (işlevsel) dernekler hakkında bilgi verecektir. exosomal aday için ilk on bilinen maçlar görüntülenir ve önemli aday seçiminde dikkate alınmalıdır. NOT: Adayların ile ilişkili bilgilerin bir hayli yukarıdaki adımları kullanarak analiz edilebilir. en önemli adaylar, daha aşağıda moleküler ve biyokimyasal analiz için seçilebilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Schorey, J. S., Bhatnagar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+function:+from+tumor+immunology+to+pathogen+biology.">Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology.</a> Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li><li>Booth, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+HIV+Gag+bud+from+endosome-like+domains+of+the+T+cell+plasma+membrane.">Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane.</a> J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).</li><li>Van Engelenburg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+ESCRT+machinery+at+HIV+assembly+sites+reveals+virus+scaffolding+of+ESCRT+subunits.">Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits.</a> Science. 343 (6171), 653-656 (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+exosomes+from+HIV-1-infected+lymphocytic+cells.">Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells.</a> Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li><li>Anderson, L., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins.">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).</li><li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+for+quantitative+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics.</a> Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+MTT+lymphocyte+proliferation+assay+for+the+diagnosis+of+neurocysticercosis.">Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis.</a> J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).</li><li>Cepko, C., Pear, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+infection+of+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li><li>Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+immunofluorescence+assay+for+antibodies+to+human+immunodeficiency+virus.">Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus.</a> J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).</li><li>Olson, B. J. S. C., Markwell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2001).</li><li>Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+staining+for+high+sensitivity+gel-based+proteomics.">Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics.</a> J Proteom. 90, 96-106 (2013).</li><li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ChroP+approach+combines+ChIP+and+mass+spectrometry+to+dissect+locus-specific+proteomic+landscapes+of+chromatin.">The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+the+comparative+analysis+of+multiprotein+complexes+based+on+15N+metabolic+labeling+and+quantitative+mass+spectrometry.">A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-loop+binding+protein+is+a+multifaceted+cellular+regulator+of+HIV-1+replication.">Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication.</a> J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).</li><li>Li, M., Ramratnam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Characterization+of+Exosomes+from+HIV-1-Infected+Cells.">Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells.</a> Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).</li><li>Emmott, E., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+interaction+partners+in+mammalian+cells+using+SILAC-immunoprecipitation+quantitative+proteomics.">Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Keerthikumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExoCarta:+A+Web-Based+Compendium+of+Exosomal+Cargo.">ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo.</a> J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).</li><li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EVpedia:+a+community+web+portal+for+extracellular+vesicles+research.">EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research.</a> Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).</li><li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1,+human+protein+interaction+database+at+NCBI.">Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI.</a> Nucleic Acids Res. 37, 417-422 (2009).</li><li>Pathan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FunRich:+An+open+access+standalone+functional+enrichment+and+interaction+network+analysis+tool.">FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool.</a> Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2011:+functional+interaction+networks+of+proteins,+globally+integrated+and+scored.">The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored.</a> Nucleic Acids Res. 39, 561-568 (2011).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2006).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Webber, J., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+pure+are+your+vesicles.">How pure are your vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li><li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1:+purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants.">Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).</li><li>Chertova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+biochemical+analysis+of+purified+human+immunodeficiency+virus+type+1+produced+from+infected+monocyte-derived+macrophages.">Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages.</a> J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).</li><li>Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics:+an+overview.">Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview.</a> Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).</li></ol>

The authors have declared no conflict of interest.

Bu yazıda tarif edilen prosedürlere olarak, ana exosomal proteomu HIV-1 enfeksiyonunun etkisini araştırmak için SILAC tekniğin uygulanmasını göstermektedir. Başlangıçta, enfekte edilmemiş ve HIV-1 ile enfekte edilmiş hücreleri, farklı olarak, izotopla işaretli bulunmaktadır. farklı şekilde etiketlenmiş eksozomlar sonra protein çıkarma yapmadan önce saflaştırılır. Daha sonra, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi exosomal Proteomun analiz için kullanılır. Son olarak, elde edilen ...

viral enfeksiyonlar da dahil olmak üzere bir çok insan hastalıkları, sık sık etkilenen hücrelerin etrafında yer alan farklı hücresel süreçleri ile ilişkilidir. Proteinler, genellikle bu süreçleri arabuluculuk, nihai hücresel efektör olarak hareket. Proteinlerin analizi sıklıkla etkilenen hücrelerin yerel çevreye kadar çok değerli bilgiler sağlar ve hastalık patogenezinde altta yatan mekanizma anlamak için bize yardımcı olabilir. Çeşitli protein analiz teknikleri arasında, proteomik özellikle büyük umut vaat ediyor. güçlü, geniş çaplı bir aracı olarak, proteomik, özellikle fonksiyon ve protein etkileşim alanında, hücresel süreçlerin bir tarihsel sağlayabilir. Belirli proteinlerin analiz İnceleme bölgesinde, araştırmacılar, hücresel bileşenler, özellikle de proteinlerinin ekspresyonunu izlemek için izin etiketleme teknikleri geliştirilmesi yoluyla basit yapılır. Birçok proteomik analizler hücresel gerçekleştirilen olmasına rağmenproteom ölçeği, hücre içi bölmeleri üzerinde proteomik karakterizasyonu 1 özellikle bilgilendirici olduğu kanıtlanmıştır. Bu HIV-1 enfeksiyonu ile ilgili çalışmalarda iyi örneklenmiştir. Eksozomlar, hücre tipleri 2, 3, geniş bir yelpazede tarafından salgılanan 30-100 nm zar vezikülleri arası iletişim ve moleküler taşıma önemli bileşenleridir. Daha önce HIV-1 tomurcuklanma 4, 5 önemli roller oynamaya keşfedildi. Fonksiyonel diseksiyon ile proteomik analizi birleştirerek, HIV-1 ile enfekte hücrelerden salınan eksozomlar hücresel apoptoz ve çoğalması 6 olmak üzere alıcı hücreler, komşu hücresel özelliklerini etkileyecek eşsiz ve nicelik farklı protein imza ve liman düzenleyici moleküller oluşur bulundu. yöntemler bu protokolde tarif edilmiştir,yani SILAC HIV-1 enfekte hücreleri eksozom 7 göre proteomik karakterizasyonu (hücre kültürü içinde amino asitler ile izotop işaretleme). Benzer yaklaşımlar, daha özel bir bölme veya ilgi fraksiyonuna deneysel gerilme ayarlama ve tarif edilen prosedürlere, gerekli değişiklikler yaparak patojenez sırasında, diğer alt-hücresel bölümleri anlamak için uygulanabilir. kantitatif proteomik yöntemlerin son gelişmeleri göz önüne alındığında, belirli bir deney için en etkili yöntem seçerken seçim için pek çok vardır. Bunlar arasında kimyasal bazlı iTRAQ (göreli ve mutlak ölçümü için izobarik etiketleri) 8 ve etiket içermeyen MRM (çoklu reaksiyon izleme) 9 teknikleridir. Her iki yöntem güçlü araçlardır ve özel ayarlar için iyi seçimlerdir. Tipik bir laboratuvar ağırlıklı hücre hatları ile çalışmak için, ancak, bu iki yöntem şansı göreceli vary yüksek maliyetler ve vardır daha zaman alıcı SILAC tabanlı yönteme göre. SILAC hücresel protein olarak kültür ortamından amino asit radyoaktif olmayan izotop formlarını içeren bir metabolik göre etiketleme tekniği. Tipik haliyle, SILAC deneyler, örneğin iki hücre popülasyonlarının, enfekte olan ve olmayan ile başlar. Tam etiketleme elde edilene kadar her diferansiyel kendine özgü izotopik ortamda etiketlenir. Bu hücrelerin etiketli eksozomlar sonra protein ekstre etmeye tabi tutulmaktadır. Bir kez etiketli exosomal proteinleri sıvı kromatografisi tandem kütle spektroskopisi 10 kullanılarak analiz edilmektedir, ayıklanır. Son olarak, kütle spektrometresi sonuçları ve önemli ölçüde etiketli proteinler istatistiksel tabi tutulur ve biyoinformatik titiz biyokimyasal doğrulama yanı sıra analiz eder. Bizim daha önceki soruşturma raporları hücre hatları bir genellikle olduğu gibi SILAC / eksozom prosedürleri, birincil hücrelerden daha hücre hatları için daha uygun olacağı kanısındayızverimli izotop etiketleme için aktif prolifere devlet,

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="625">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">H9 cell line</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td style="width:111px;">HTB-176</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">15250061</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">MTT assay kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">V13154</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:227px;">Dialyzed fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">26400044</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">SILAC Protein Quantitation Kit &#8211; RPMI 1640</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">89982</td>
			<td style="width:168px;">DMEM version (89983)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">88434</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">88431</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">HIV-1NL4-3&#160;&#160;</td>
			<td style="width:121px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:111px;">2480</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit</td>
			<td style="width:121px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:111px;">NEK050001KT</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Refrigerated super-speed centrifuge</td>
			<td style="width:121px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:111px;">22628045</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Refrigerated ultracentrifuge</td>
			<td style="width:121px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">363118</td>
			<td style="width:168px;">Should be able to reach 100,000g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">14-432-22</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Ultracentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:121px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">326823</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">SW 32 Ti Rotor</td>
			<td style="width:121px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">369694</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">89900</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Protease Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">&#160;78430</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">ThermoMixer&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:111px;">5384000020</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">23250</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:111px;">1702525</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">SDS PAGE Gel apparatus</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">EI0001</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td style="width:121px;">Novex</td>
			<td style="width:111px;">XV04200PK20</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Gel staining reagent</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G1041</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">V5111</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">SpeedVac Concentrator</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">SPD131DDA</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Antibody to human annexin A5</td>
			<td style="width:121px;">Abcam</td>
			<td style="width:111px;">ab14196</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Antibody to human lactate dehydrogenase B chain</td>
			<td style="width:121px;">Abcam</td>
			<td style="width:111px;">ab53292</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:227px;">Graphing and Statistical Software</td>
			<td style="width:121px;">Systat&#160;</td>
			<td style="width:111px;">SigmaPlot&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Or GraphPad Prism</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Quantitative proteomics software suite</td>
			<td style="width:121px;">Max Planck Institue of Biochemistry</td>
			<td style="width:111px;">Maxquant&#160;</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Software and databases</td>
			<td style="width:121px;">Various vendors</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:168px;">Refer to main text for details</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silac based proteomic characterization of exosomes from hiv-1 infected cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Şekil 1A SILAC etiketleme prosedürü 21 gösteren bir akış şemasıdır. eksozomlar arındırmak için, numuneler santrifüj yoluyla döndürülür gerekir. Şekil 1B seri Ultrasantrifügasyon 21 exosome saflaştırma adımları göstermektedir. saflaştınldı sonra prosedür de tarif edilen, eksozomlar deney proteomik analize tabi tutulur. ...

Watch this Scientific Journal Video about SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells at JoVE.com

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Burada, ana exosomal proteomlarda HIV-1 enfeksiyonunun etkilerini analiz etmek için hücre kültürü (SILAC) amino asitler ile izotop etiketleme tekniği kullanılarak kantitatif proteomik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, kolayca farklı gerilme veya enfeksiyon koşullarda hücrelere uyarlanabilir.

HIV-1 enfekte olmuş hücrelerden eksozom SILAC Bazlı proteomik Karakterizasyon

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

silac-based-proteomic-characterization-exosomes-from-hiv-1-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.6K Görüntüleme.  Brown University.  Burada, ana exosomal proteomlarda HIV-1 enfeksiyonunun etkilerini analiz etmek için hücre kültürü (SILAC) amino asitler ile izotop etiketleme tekniği kullanılarak kantitatif proteomik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, kolayca farklı gerilme veya enfeksiyon koşullarda hücrelere uyarlanabilir. 

Video: SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.