Name: analysis of coronary vessels in cleared embryonic hearts
Uploaded: 2016-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts at JoVE.com

작품은 어린이 NHS 재단 트러스트와 영국 런던 대학의 완벽한 오몬드 스트리트 병원에서 건강 연구 바이오 메디컬 연구 센터의 국립 연구소에 의해 지원되는 영국 심장 Foundation&#39;and에 의해 투자되었다.

모든 동물 연구는 영국 홈 오피스에서 라이선스 기관의 지침에 따라 실시 하였다. 1. 해부 및 배아 마음의 고정 <ol><li> 윤리적으로 승인 컬링 기술, 자궁 경부 전위 다음에 예를 들면, CO 2 마취를 사용하여 필요한 날에 시간 초과 - 임신 마우스를 안락사, 인산염 완충 식염수로 가득 10cm 페트리 접시에 배치, 배아 낭 (14)을 제거 (PBS) . </li><li> 탯줄을 절단하고 난황을 제거, 신중하게 각각의 배아를 자궁 주머니를 열고 제거, 해부 현미경과 집게를 사용. </li><li> 유전자형을 위해, 나중에 용해 / DNA 추출을위한 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 배아의 꼬리와 장소를 제거합니다. </li><li> 스테인레스 스틸 minutien 핀을 사용하여 PBS 채워진 실리콘 탄성 중합체 코팅 35mm 페트리 접시의 뒷면에 각각의 배아를, 마음을 제거 고정하기 위해. 미세 집게를 ca를 사용하여refully 가슴을 열고 큰 혈관을 절단, 심장에 전방. 그런 마음의 뒤에 배를 잡고 마음을 제거하고 부드럽게 당겨 집게로 마음 뒤에 도달; 폐도 동시에 얻어 올 수있다. </li><li> PBS를 함유하는 신선한 35mm 페트리 접시에 중심을 전송하고, 필요한 경우, 폐 조직을 얻어 트림 미세 핀셋을 사용한다. 그런 다음 차가운 PBS로 가득 찬 48 웰 플레이트의 웰에 마음을 전송합니다. </li><li> 48 웰 플레이트에있는 모든 마음을 수집 한 후, 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 PBS를 대기음 0.5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 교체합니다. 주의 : PFA는, 알레르기 발암 성, 독성 것으로 알려져있다. <ol><li> 수정 E11.5 - 실온에서 4 % PFA에 30 분 동안 15.5 마음 - 20 분, E14.5 12.5에서 15 분 동안 마음, E13.5 마음입니다. </li></ol></li><li> 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 PFA를 대기음과 마음 2 배 차가운 PBS로 씻어. CAUTION : PFA는 위험합니다 및 기관 규정에 따라 폐기해야합니다. </li><li> 25 % 메탄올 / 75 % PBS, 50 % 메탄올 / 50 % PBS, 75 % 메탄올 / 25 : 전체 마운트 면역 염색 즉시 사용하지 않을 경우 다음 해결책에 연속 5 분 세척을 수행하여 마음을 탈수, (섹션 2 참조) % PBS. 주의 : 메탄올은 독성, 장갑을 착용하십시오. 100 % 메탄올에서 -20 ° C에서 마음을 저장합니다. </li></ol> 안티 PECAM1 항체와 배아 마음의 2. 전체 마운트 면역 염색 참고 : 안티 PECAM1 항체가 관상 동맥 혈관을 염색 잘 작동하지만 적합 할 것 강력한 신호를 제공하는 범 내피 세포 마커 (단계 2.4 참조). <ol><li> 100 % 메탄올에 저장되었다 마음을 사용하는 경우, 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 옮기고 다음 방법에 연속 5 분간 세척을 실시하여 재수 : 75 % 메탄올 / 25 % PBS, 50 % 메탄올 / 50 % PBS 및 25 % 메탄올 / 75 % PBS. </li&gt; <li> 실온에서 회전, 1.0 ml의 PBST (PBS / 0.1 % 트윈 -20) - 0.5에서 3 회 10 분 세척을 수행함으로써 마음 Permeabilize 하시려면. </li><li> PBST 1.0 ml의 10 % 염소 혈청을 실온에서 1 시간 동안 회전시켜 하트 차단. </li><li> 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫 또는 1,000 μL 피펫 팁으로 차단 버퍼를 제거하고 400로 교체 - 1시 50분 희석 방지 PECAM1 차 항체를 포함하는 500 ㎕의 신선한 블록. 4 ℃에서 하룻밤 튜브를 돌립니다. </li><li> 다음 날, 실온에서 튜브를 회전, 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫 또는 1,000 μL 피펫 팁과 블록 / 차 항체를 대기음 및 1.0 ml의 PBST 적어도 6 배 1 시간 세척을 실시하고 있습니다. </li><li> 1 희석 형광 접합 된 이차 항체를 포함하는 신선한 차단 버퍼의 마지막 세척 교체 : (500), 및 회전, 4 ° C에서 밤새 품어. 호일에 튜브를 포장하여 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 다음 날, 블록 / 초를 대기음뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 ondary 항체는 실온에서 튜브를 회전, 1.0 ml의 PBST 적어도 6 배 1 시간 세척을 실시하고 있습니다. </li><li> 4 °의 (빛으로부터 보호) C 필요할 때까지의 마음을 저장합니다. </li></ol> 용지 솔루션 및 현미경 요리 3. 준비 참고 : BABB에 마음을 이미징 할 때 BABB 솔루션 중 어느 것도 현미경의 구성 요소와 접촉 없다는 것이 매우 중요합니다. 이를 위해 다음과 같은 프로토콜은 사전에 준비 할 수 형광 현미경에 적합한 실리콘 엘라스토머 밀봉 요리를 준비하기위한 지침이 포함되어 있습니다. 실리콘 엘라스토머는 BABB을 포함하며 잠재적으로 유리 바닥 접시의 폴리 카보네이트 측간 스며드는 것을 방지하기위한 장벽을 제공한다. <ol><li> 직경 실리콘 엘라스토머 코팅 요리를 준비하기 위해, 나사 상단 병을 4 ml의에서 모자를 광학 유리 바닥 문화 요리를 가지고 배치 (약 1.5 cm) 각 요리의 중심입니다. 주 : 엘라스토머 접시에 적용되는 경우는 샘플이 잘 형성된다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라, 이들이 적용되는 바와 같이 두 성분을 혼합하여 도포 카트리지를 이용하여 약 0.5 cm의 깊이로 실리콘 엘라스토머를 요리 채운다. 유리 병 캡은 각 요리의 중심에 남아 있는지 확인하고, 최소 24 시간 동안 치료 둡니다. 주 : 눈을 가진 실리콘 엘라스토머의 우발적 인 접촉을 방지하기 위해 보안경을 사용하십시오. </li><li> 엘라스토머의 경화 후, 각 접시의 바이알 뚜껑을 제거 이것은 샘플 접시의 바닥 유리와 직접 접촉하여 배치 될 수있는, 촬영 중앙 웰을 떠날 것이다. 참고 : 경화 때 엘라스토머 터치에 확고하고 건조해야합니다. </li><li> (2 부품 벤질 벤조 에이트 1 부 벤질 알코올)을 BABB 솔루션을 준비합니다. 이 유리 병에 저장하고 빛으로부터 보호되어야한다. 주의 : BABB는 독성, 부식성 솔루션입니다. 적절한 보호 복을 착용하는 동안 흄 찬장에서 처리합니다. </li><li> 유리 병에 - (5 ㎖ 1) 혼합 BABB 및 메탄올을 50:50 솔루션을 확인합니다. 호일 유리 병 포장으로, 예를 들면 빛으로부터 보호합니다. </li></ol> 4. 탈수, 지우기 및 공 초점 현미경에 대한 마음의 장착 참고 : 큰 샘플은 다소 작은 샘플 4 mL 유리 바이알에 클리어 할 수 (예 E13.5까지 하트)는 현미경 접시에 직접 정화 공정을 수행하는 것이 낫다. 이 방지하는 데 도움이 마음 한 번 클리어 매우 투명 해짐에 따라 샘플을 &#39;손실&#39;. 이 작은 샘플에 대한 청소는 몇 분 이내에 발생, 매우 빠른입니다. 참고 : / 포장 호일로 튜브와 요리를 포함하는 모든 다음 단계에서 빛으로부터 샘플을 보호합니다. <ol><li> 삭제하기 전에, 룸 템피에 마음을 돌려 메탄올 시리즈를 통해 면역 염색 - 마음을 탈수다음 솔루션의 연속적인 변화에 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 rature : 메탄올 / 75 % PBS, 50 % 메탄올 / 50 % PBS 75 % 메탄올 / 25 % PBS (각 5 분) 25 %. 마지막으로, 100 % 메탄올 3 × 5 분 동안 회전합니다. </li><li> 최대 현미경 접시의 중앙에 E13.5, 장소의 마음에 대한; 현미경으로 심장의 지느러미 쪽 맨으로 지향되어 있는지 확인합니다. 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 심장 주위에서 모든 메탄올을 제거합니다. </li><li> 깨끗한 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여, BABB를 추가 : 메탄올 50:50 솔루션을 중심 몰입하기에 충분한 볼륨 (약 300-400 μl를). 마음이 때때로 용액에 뒤집어 수 이상으로 마음은 여전히 ​​불투명 동안, 다시 방향을 확인합니다. 5 분 동안 용액에 둡니다. </li><li> 흄 후드에 유리 폐기물 병에 50:50 솔루션을 제거하고 다시 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여, BABB로 교체합니다. 주 : 많은 양이 요구되지 않는다; suff 추가icient은되도록 마음은 용액 한 방울 내에서 앉아있다. 핵심은 5 분 이내에 취소해야합니다. </li><li> 큰 하트를 들어, 유리 바이알에 샘플을 취소합니다. 주 : E15.5 마음은 30 분 - 1 시간 이내에 취소해야하지만, 필요한 경우 하룻밤 남아있을 수 있습니다. </li><li> 샘플 클리어 한 후, 용액을 제거하고 BABB 최소한의 양으로 대체. 선택적으로, 그러나이 절대적으로 필요하지 않습니다, 장소에 보관하는 데 도움이, 커버 슬립과 샘플을 커버한다. 영상의 마음을 사용합니다. </li></ol> 공 초점 현미경 5. 이미징 해제 하트 참고 : 이미지는 10 배 또는 20 배 건조 목표를 사용하여 반전 공 초점 현미경에 포착되었다. 이 직립 촛점에 식기를 사용할 수있다하더라도, 특별한주의가 BABB 용액 목적의 접촉을 피하도록주의해야한다. <ol><li> 심장 (15)의 Z-검사를 수집합니다. 심장의 크기에 따라 타일 스캔 이미지 전체 심장 (16)에 요구 될 수있다. <br/&gt;주의 : BABB는 부식성 해결책이 깨끗한 장갑을 착용하고 현미경 접시의 외부는 BABB에서 무료로 확인합니다. 주의 접시 처리하고 현미경 상 우연한 누출의 위험을 최소화하기 위해 접시에 뚜껑을 유지한다. </li><li> 목적 작동 거리가 허용하는 경우, 관심 지역의 고해상도 사진을 달성하기 위해 더 높은 배율을 사용합니다. </li></ol> 피지 소프트웨어를 사용 6. 데이터 분석 <ol><li> 피지 (17)의 이미지의 z 스택을 엽니 다. </li><li> 전체 스택 또는 그것의 일부의 아리조나 투사하려면 이미지를 클릭 Z 프로젝트 다음 스택을 선택합니다. 시작을 입력하고 슬라이스 번호를 중지 및 z 투사, 예를 들어, 평균 강도, 최대 강도의 유형을 선택합니다. </li><li> 타격 도구를 사용하여 이미지 조각의 스택 내의 개별 선박을 강조합니다 (플러그인 메뉴 선택 분할에서 다음 올가미 도구 / 불어) 및 이미지의 영역을 클릭하여 개에 가득합니다채널 조각. 선택의 전경 색상으로 선택 영역을 채우기 위해 (다음 채우기를 선택하고 편집을 클릭) 채우기 명령을 사용하여 (색상 및 전경 다음 옵션을 선택한 다음 편집을 클릭합니다). </li><li> 이미지가 이전 스택 Z 프로젝트. </li></ol> 관상 동맥의 7 3D 표면 볼륨 렌더링 Imaris를 사용하여 생성 <ol><li> 화면 상단에있는 능가보기 아이콘을 클릭하고 드래그하여 데이터 창에 이미지 파일을 놓습니다. 화면 상단의 3D 뷰 아이콘을 클릭합니다. </li><li> 표면 아이콘 (파란색 아이콘)을 선택하고 만들기 탭을 클릭합니다. &#39;수동으로 편집, 자동 생성 건너 뛰기&#39;대화 상자를 클릭하고 그리기 아이콘 (얇은 연필 아이콘)을 클릭합니다. </li><li> 컨투어 탭을 클릭 한 다음 모드 탭을 선택합니다. 모드에서는 마법 지팡이 또는 isoline 아이콘을 클릭합니다. &#39;선택&#39;을 클릭하여 다음에 화면의 오른쪽에있는 포인터 선택 포인터의 모드를 선택하고 &#39;그리기 클릭9; (화면의 왼쪽 아래에) 상자. </li><li> 연속적인 조각에 동맥의 윤곽을 선택 isoline 또는 마술 지팡이 도구를 사용합니다. 슬라이스 위치 슬라이더를 사용하여 슬라이스 조각에서 이동합니다. </li><li> 모든 윤곽이 선택되었을 때, 표면을 만들기 상자를 클릭합니다. 주변 음량이 보이지 또는 블렌드 모드를 사용하여 다소 불투명 할 수있다; 강조 표시 한 다음 모드 탭 다음 설정 탭을 선택하기 위해 볼륨을 클릭합니다. 블렌드를 선택하고 불투명도를 변경하려면 슬라이더를 사용합니다. </li><li> 스냅 샷 기능을 사용하여 이미지를 캡처합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

전체 배아 마음에 관상 동맥 혈관 광학 통관 및 공 초점 현미경으로 다음 항 PECAM1 항체 wholemount 면역 염색에 의해 촬영되었다. 간단한 방법은 BABB와 배아 마우스 마음의 정리를 위해, 여기에 기술, 광학 침투를 증가시키고 대동맥과 심실 벽에 지역화 된 혈관의 고해상도 이미지를 캡처 할 수 있습니다. 이러한 Vectashield (굴절률 1.45) 등의 글리세롤 계 장착 시약은 BABB의 고 굴절율 (1.56)는 깊은 조직 침투를 가능 또 광 산란을 감소하지만 관상 혈관 (22)의 촬상을 위해 사용되어왔다. 조직의 간극은 덜 쉽게 사용할 연구자 수있다 광자 빛 시트 현미경 등 현미경의 더 복잡한 고가의 형태에 대한 필요성을 제거한다. 청산 과정은 다른 방법 6-9에 작은 샘플 캘리포니아 될 수를 비교하는 매우 빠르다직접 현미경 접시에 시약의 작은 볼륨을 사용하여 rried. 맥관 구조의 견고한 염색 고품질 화상을 달성하기 위해 요구된다; 안티 PECAM1 항체는 염색 적절히 높은 수준을 수득 발견 된 관상의 EC 및 상업적인 항체의 다수의 모든 유형을 표시로서 선택 하였다. 또한, 형광 염색 BABB에서 매우 안정적인 것으로 보인다; (빛으로부터 보호) BABB 실온에서 저장된 샘플 몇 개월 동안 형광 신호를 유지했다. peritruncal 신경총의 이미지를 캡처 특히 PECAM1 항체 효율적뿐만 아니라 혈관 때때로 문제가 있다는 관상 동맥 내막 레이블 사실. peritruncal되는 EC에 비해 대동맥 루멘의 강력한 염색 이미징 매개 변수의주의 깊은 조정이 필요했다 즉, 이미지의 일부 지역을 통해 포화의 위험이 발생했습니다. 이상적으로, 항체 염색 단지 혈관의 EC가 사용된다; 실제로,그러나 wholemount 염색법의 요구 수준을 산출 적합한 항체를 찾는 것은 어려울 수 있습니다. 최근, 지방산 결합 단백질 4 (FABP4)는 관상 혈관의 EC (23)의 마커로 도시되어 있으므로 PECAM1 대안을 나타낼 수있다. 하지만, 샘플이 평면 장착되지 않은 대동맥과 심장 챔버의 3D 형태를 유지하기 위해 대신 유리 바닥 요리 군데 있었다. 묘화 될 수있는 샘플의 깊이는 그들의 짧은 작동 거리로 높은 배율의 대물 렌즈의 사용을 배제. 그러나 높은 해상도 이미지는 픽셀 체류 시간을 증가시키고 촬상하기위한 적어도 1024 X 024의 픽셀 어레이 크기를 사용하여 10 배의 대물 렌즈를 사용하여 여전히 달성 하였다. 그러나 이것은 세포 구조의 미세한 분석 시료의 평면 설치가 필요할 수 있습니다, 구조 및 관상 동맥 혈관의 분포의 분석에 충분했다. 설치에 대한 마음의 개별 부품의 해부,예를 들어, 심실 벽, 또는 대동맥, 또한 필요할 수 있습니다. 대안 적으로, 오버 샘플링 디콘 볼 루션에 의해 다음 이미지의 해상도와 감도를 증가시키기 위해 수행 될 수있다; 그러나 이것은 상당히 긴 스캔 시간을 필요로하고 처리하는 컴퓨팅 파워를 많이 필요로 매우 큰 이미지 파일을 만듭니다. E15.5까지 하트 성공적이 방법을 이용하여 묘화하고, 동일한 프로토콜을 사용하여 (적어도 E11.5까지) 전체 배아의 혈관계를 분석하는 것도 가능하다. 다른 세포 유형, 예컨대, 평활근 세포는 또한이 기술을 사용하여 실험실에서 촬상되고있다. 두꺼운 조직, 예를 들어, 마음 E15.5보다 나이가 들어, 항체 침투가 제한 요인이 될 수있다; 이상 배양 및 / 또는 증가 된 세제가 필요할 수 있습니다. 많은 이미지 Z 스택을 수집 할 때뿐만 아니라, 레이저는 조직의 가장 먼 부분을 투과으로 강도가 감소 될 수있다 신호; 그러나 conf의OCAL 설정 증가 Z 거리 레이저 전력을 증가하도록 조정될 수있다. 이 방법은 관상 혈관 형성의 초기 단계 이상 발생 단계에서의 관상 동맥의 패터닝 모두 공 촛점 현미경 분석을 용이하게한다. 분포 분지 혈관의 구조에 대한 상세한 정보는 본에게 혈관 형성 경로의 특정 결함 유전자 돌연변이 마우스의 연구를위한 가치있는 도구를 만드는 단시간에 취득 할 수있다.

작동하는 관상 동맥 네트워크를 설정하면이 발달 과정을 기본 분자 신호로 귀중한 통찰력을 제공 할 수있는 심장 기능 및 배아 발달, 유전 마우스 돌연변이의 분석을 위해 매우 중요하다. 전체 배아 관상 신경총을 시각화하는 능력은 오히려 학적 부분의 연속 표시보다는 유전자 돌연변이의 혈관 패턴의 분석을 용이하게하기 위하여 필수적이며, 기계적으로 인해 발생할 수있는 정보의 손실 가능성을 회피 조직의 슬라이스. 동맥을 형성하는 운명 혈관과 모세 혈관이 깊은 심실과 대동맥 1-3 모두의 벽 내에서 지역화됩니다. 그러나 wholemount 표지 표재성 정맥 / 림프관 4,5- 고해상도 화상을 제공 할 수 레이저 스캐닝 공 초점 현미경과 결합 된 세포의 형광 표지 반면 영상의 깊이는 광 투과에 의해 제한된다. 캡의 고해상도 영상화심장의 전체 깊이에 걸쳐 illaries 및 동맥 조직 청산의 형태 않고 따라서 수 없습니다. 불량 광 투과는 여러 세포 및 세포 외 (예컨대, 콜라겐과 탄성 섬유) 두께의 조직 성분의 고 굴절률에 의해 야기된다. 이것은 영상 광을 산란 블러 일으키고 콘트라스트를 감소시켰다. 삭제 에이전트는 일반적으로 빛이 방해받지 샘플을 통과하고 조직으로 깊이 침투 할 수 있다는 것을 의미, 이러한 조직의 높은 굴절률을 일치합니다. 물이 비교적 낮은 굴절률로 클리어 전에 조직은 일반적으로 탈수된다. 새로운 청소 방법의 과다 그러나, 청산 과정이 며칠 또는 몇 주 걸릴 수 있으며 비용이 많이 드는 시약 6-9 필요할 수 있습니다 사용 된 기술에 따라, 최근에 개발되었다. BABB (1 : 벤질 알코올, 벤질 벤조 에이트의 혼합물을 2)는이있는 저렴하고 일반적으로 사용되는 소거 에이전트이며매우 신속하게 샘플을 삭제의 장점. BABB 계 클리어 이미징 기술은 신경 샘플 및 다양한 기관 10-13 위해 전술되었다. 15.5 - 여기에서 우리는 E (배아 일) 11.5에서 쥐의 마음 혈관의 시험에 특정 참조하여, 공 초점 현미경으로 다음 면역 염색 샘플의 BABB 통관을위한 강력하고 간단한 방법을 설명합니다. 또한 입증되었다 그러나, 상기 기술은 동일하게 한 관심 마커 고품질 항체를 사용할 수 있으며, 전체 배아 분석뿐만 아니라 다른 세포 유형에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dishes</td><td>Sigma</td><td>P5112</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter</td><td>FST</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip pastettes&amp;nbsp;</td><td>Alpha Laboratories</td><td>LW4061</td><td></td></tr><tr><td>1,000 ml pipette tips</td><td>Sorenson</td><td>34000</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Gard</td><td>World Precision Instrument</td><td>KWIKGARD</td><td>Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing</td></tr><tr><td>Kwik-Gard refill</td><td>World Precision Instrument</td><td>KWIKGLUE</td><td>Refill cartridges and dispensing tips</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Make up in PBS and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>VWR</td><td>20847307</td><td></td></tr><tr><td>Tween&amp;reg;20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA3105</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 400</td></tr><tr><td>Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-65495</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 250</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11007</td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab173003</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21208</td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Phenolic screw cap</td><td>Wheaton</td><td>240408</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane Imaging</td><td>image analysis software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Freeware</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of coronary vessels in cleared embryonic hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

심장이 개발됨에 따라, 심실 심근는 다양한 소스로부터의 내피 세포 (EC에)에 의해 침입하고, 혈관 총이 형성된다. 심실 심근 내에서 개발 선박은 심장 조직 (18)에 산소 혈액을 전달하는 모세 혈관과 동맥 네트워크를 형성하기에 이동합니다. 대동맥 14,19,20의 루멘을 둘러싸 관상합니다 (peritruncal 신경총라고도 함) 별도의 모세관 네트워크로부터 독립적으로 개발되기 시작 줄기 (E11.5 정도) 동시에. Peritruncal 신경총 EC를 처음하지만 궁극적으로 오직 하나의 용기 좌우 관상 동맥 (21)의 뿌리를 형성하는 일, 대동맥의 각각의 측면에 유지되며, 상기 밸브 부비동의 수준에서 대동맥의 내강으로 여러 개의 연결을 형성한다. 주위 peritruncal을 E13.5 심실의 심근 혈관은 A로부터 혈류있게 상호 연결된 네트워크를 형성하도록 합류오르타 관상 혈관 14, 22로. 본래 마음의 BABB 허가와 함께 안티 PECAM-1 항체와 내장 컴퓨터의 염색은 가장 빠른 단계에서 개발 관상 동맥 네트워크의 분석을 허용한다. 나중에 발달 단계에서 성숙 관상 동맥의 패턴도 검사 할 수 있습니다. 이 방법도 전 배아의 혈관을 염색하는데 이용 될 수있다 (최대 E11.5 적어도), 및 예를 들어 다른 항체와 안티 - 알파 평활근 액틴 (Sm22α) 및 Endomucin. 그림 1은 피지 소프트웨어를 사용하여 생성 된 E11.5 심장의 최대 강도 Z-전망을 보여줍니다. 타일 ​​기능은 심장의 복수의 부분 화상을 수집하여 완전한 이미지로 붙여서하는데 사용되었다; 이 전체 표본의 염색의 개요를 제공하는 데 유용합니다. 이 단계의 PECAM1 항체에서 주로 심장과 유출 V의 내막 안감 얼룩essels 그러나 몇되는 EC는 ( &#39;1A에 확대 표시, 그림 1A에서 박스 영역) 좌심실 벽에서 관찰 할 수있다. 또한 peritruncal 신경총 명확 유출 관 (OT) (도 1b에 박스 영역)의 벽에서 관찰 될 수있다. 후자의 경우, 투영을 생성하는 데 사용되는 Z 스택 슬라이스의 수를 감소시키는 것은 (도 1b &#39;)보다 명확하게 가시화 될 대동맥의 내강으로의 연결을 허용하는, 이미지의 선명도를 향상시켰다. 그림 2에서 대동맥으로 증가 된 혈관의 근위부는 E12.5 마음에서 관찰 할 수있다. 그림 3은 E12.5 마음에 peritruncal 신경 얼기를 보여줍니다. 도 3a의 12 슬라이스 z를 투영은 일부 선박은 Z-스택 내가 분할, (도 많이 방지 PECAM1 항체로 염색한다) 대동맥의 루멘에 복부 지역화 그러나으로, 전체 신경 얼기를 보여줍니다하위 스택의 수 NTO (그림 3B-D)는 시각적 정보를 제공합니다. 예를 들어,도 3b에 투영 된 하위 스택은 전체 투사에 표시되지 대동맥 루멘의 복부 표면에 연결하는 peritruncal 용기를 보여줍니다. 그림 4는 E15.5 심장의 일부를 보여줍니다; 관상 동맥이 단계 (그림 4A, 30 슬라이스 돌기)에서 명확하게 볼 수 있습니다. 5 조각 z는도 4b에 도시 계획과 C에서 대동맥과 폐동맥 밸브는 PECAM1 염색으로 가시화 될 수있다 가지와 관상 동맥 모세 혈관 네트워크의 상호 연결이 더 작은 하위 스택 예측에도 명확하다. 수동 세그멘테이션 기술은 피지 (도 4d) 또는 Imaris (도 4d 및 E)을 사용하여 관상 동맥을 강조하기 위해 사용되어왔다. 관상 동맥의 3D 표면 볼륨 렌더링 / 대동맥 루멘 U 생성노래 Imaris 함께 또는 주변 혈관 (도 4E 및 F)없이 볼 수있다. 전체 배아의 혈관은 PECAM1 염색 / BABB 정리를 사용하여 검사 할 수 있습니다. 각각의 배아 및 좌측 (Z 슬라이스 66-110) -도 4A 및 &#39;는 오른쪽부터 하위 스택에서 발생 Z 돌기 (65 Z 슬라이스 11)을 나타낸다. 두 이미지의 비교는 형광 신호의 세기가 상당히 조직으로 침투 깊이에 따라 감소하지 않았다는 것을 보여준다. 도 4b, PECAM1 (적색 신호) 및 Endomucin (녹색 신호)에서 항체는 E11.5 배아의 각각 intersomitic 동맥 (ISA들)과 정맥 레이블을 결합했다. 도 4c는 SM22α (적색 신호)와 E11.5 배아에서 ISA들의 PECAM1 염색 (녹색 신호)를 보여줍니다. 그림 6에서, E11.5 배아PECAM 1로 염색은 BABB 통관 (그림 4A) 후 즉시 군데, 또는 약 2 개월 (그림 4B)의 간격 후했다. 형광 신호가 성공적으로 BABB에서 샘플의 장기간 보관 후 정지 화상에 충분히 강했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig1.jpg" /> (알렉사 594에 안티 쥐 IgG의 공역으로 감지) 안티 PECAM1 항체를 가진 E11.5 마음의 그림 1. 면역 염색. (A, B)는 2 × 2 타일 이미지 반전 공 촛점 현미경으로 10 배의 대물 렌즈를 사용하여 수집 하였다. PECAM1 항체 얼룩 내막 및 혈관의 EC 양. 돌기 (최대 강도) 피지 소프트웨어를 사용하여 22 (A), 5 (B) Z 슬라이스 4 μm의 두께에서 각각 생성 하였다. A &#39;와 B&#39;enlargemen은각각 A와 B의 박스 영역의 TS. &#39;A에서 화살표 심실 벽 혈관을 나타낸다; B &#39;에서, 브래킷은 peritruncal 총을 나타냅니다. OT, 유출 관; LV, 좌심실, RV 우심실. 모든 이미지는 정면 도면이다. 스케일 A의 바, B = 200 μm의; A &#39;와 B&#39;= 100 μm의 규모 바. 패널 (1B)는 &#39;아이 빈스 등. 2015 년 19에서 적응했다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig2.jpg" /> 안티 PECAM1 항체를 가진 E12.5 심장 그림 2. 면역 염색. 패널 A는 2 × 2 타일 스캔 아리조나 투사 (최대 강도)를 보여줍니다. A의 박스 영역은 enlarg 표시됩니다A의 에디션 &#39;; 화살표는 근위 대동맥 (아오)에 여러 혈관을 나타냅니다. LV, 좌심실, RV 우심실. 모든 이미지는 정면 도면이다. A의 스케일 바 = 200 μm의; A &#39;= 100 μm의 규모 바. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig3.jpg" /> E12.5 마음에 Peritruncal 신경총 3. 이미지를 그림. 안티 PECAM1 항체로 염색 E12.5 대동맥 (ㅡ)의 공 촛점 이미지는 10X 대물 렌즈를 사용하여 수집 하였다. A의 Z 돌기 (최대 강도) 12 Z 조각 (4 μm의 두께)에서 생성 된; 화살표는 peritruncal 총 선박을 나타냅니다. 표시된 분리 projecti를 생성하도록 사용되는 BD 12 Z 슬라이스 세 서브 - 스택으로 나누어기능; 화살촉은 대동맥의 루멘에 peritruncal 총에 의해 형성된 연결을 나타냅니다. 대동맥의 루멘에 복부 지역화 Peritruncal 선박은 B와 C에서 볼 수 있습니다. 모든 이미지는 정면 도면이다. 스케일 바는 50 μm의 =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig4.jpg" /> E15.5 마음에 4. 관상 동맥 및 모세관 신경총 그림. 안티 PECAM1 항체로 염색 E15.5 심장 공 촛점 이미지는 10X 대물 렌즈를 사용하여 수집 하였다. 패널 A는 Z 30 조각 (4 μm의 두께)에서 생성 된 최대 강도 Z 투영을 나타낸다 화살표는 대동맥 (아오)에 연결 볼 수있는 왼쪽과 오른쪽 관상 동맥 (LCA 및 RCA)를 나타냅니다. differen 사용t 5 Z 슬라이스 대동맥과 폐동맥 밸브 (AOV 및 PV)는 각각 (파란색 브래킷) B와 C에서 볼 수있는 서브 - 스택. 심실 모세 혈관 총이 더 작은 하위 스택 예측에도 명확; 폐 밸브 (작은 상자)에 인접 혈관이 패널 C (큰 상자)의 오른쪽 하단에 확대 표시됩니다. 피지는 불어 / 올가미 도구는 이전에 투영 각 Z 슬라이스에서 수동 빨간색으로 관상 동맥을 채우기 위해 사용 된 패널 D에 대해, 예를 들면 개별 혈관을 강조하기 위해 사용되었다. Imaris 소프트웨어 동맥 (적색) 및 E 및 F의 동맥 루멘 (녹색)의 3 차원 이미지를 생성하기 위해 사용되었다; 다시 각 Z 슬라이스의 객체 윤곽을 만들기 위해 마법의 지팡이 도구를 사용하여 수동으로 이루어졌다. 주변 음량의 불투명도는 E에서와 같이, 혼합 모드로 변경 될 수있다. F에 도시 된 바와 같이, 대안 적으로, 3D 이미지는 추출 될 수있다 </strong&gt;. LV, 심실을 떠났습니다. 모든 이미지는 정면 도면이다. A = 100 μm의 규모 바. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig5.jpg" /> 배아 혈관 5. 이미지를 그림. 패널 A 및 10X 대물 렌즈 (바둑판 스캔)을 사용하여 수집 한 항 PECAM1 항체로 염색 E10.5 야생형 배아의 A &#39;표시 촛점 이미지. 평균 강도 Z 돌기 배아의 두께에 걸쳐 형광 강도의 단지 약간의 손실을 나타내는 120 Z 슬라이스 스캔 (4 μm의 두께 조각)의 Z 슬라이스 11-65 (A) 및 66-110 (A &#39;)에서 생성 된 . 패널 B는 antibod로 염색 E11.5 배아의 intersomitic 혈관을 보여줍니다<html> 타일에서 (평균 강도 Z 프로젝션 각각 intersomitic 동맥 (화살표)과 정맥 (화살촉)를 얼룩 PECAM1 (594 - 복합 이차 항체에서 빨간 신호) 및 Endomucin (EMCN, 488 - 복합 이차 항체에서 녹색 신호)에 대한 IES 주사). 패널 C는 PECAM1에 대한 항체로 염색 E11.5 야생형 배아에서 intersomitic 동맥 (ISA들) (녹색 488 - 복합 이차 항체에서 신호) 및 SM22α (594 - 복합 이차 항체에서 빨간 신호)를 보여줍니다. 공 촛점 이미지는 20X 대물 건조를 사용하여 수집 된 최대 강도 Z 돌기 생성에 사용 하였다. 모든 이미지는 시상도이다. A와 B의 스케일 바 = 250 μm의, C = 100 μm의 규모 바. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> D / 54800 / 54800fig6.jpg &quot;/&gt; BABB에서 해제 그림 6. 면역 염색 샘플은 최소 두 달 동안 형광 신호를 보관하십시오. E11.5 배아는 PECAM1 항체로 염색하고 BABB으로 삭제되었다; 같은 배치에서 배아는 즉시 또는 2 개월 간격 후 몇 군데 있었다. 패널 A는 즉시 이미징 배아의 intersomitic 동맥을 보여줍니다 패널 B는 배아가 두 달 후 몇 군데 보여줍니다. 공 촛점 이미지는 10X 대물 건조를 사용하여 수집 된 최대 강도 Z 돌기 생성에 사용 하였다. DAO, 지느러미 대동맥. 이미지는 시상 뷰를 보여줍니다. 스케일 A의 바, B = 100 μm의. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

우리는 광 클리어런스 및 초점 현미경이어서 표준 면역 염색 방법을 이용하여, E15.5까지 온 뮤린 배아 하트 관상 혈관의 분석 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 직렬 섹션 시간 소모 분석 할 필요없이 전체에 걸쳐 심장 혈관의 시각화를 가능하게한다.

해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K 조회수.  UCL Institute of Child Health.  우리는 광 클리어런스 및 초점 현미경이어서 표준 면역 염색 방법을 이용하여, E15.5까지 온 뮤린 배아 하트 관상 혈관의 분석 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 직렬 섹션 시간 소모 분석 할 필요없이 전체에 걸쳐 심장 혈관의 시각화를 가능하게한다. 

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A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

연구

면역학 및 감염병학

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

발생학

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes for CHD are still poorly understood. The developing mouse constitutes a valuable model for the study of CHD, because cardiac developmental programs between mice and humans are highly conserved. The protocol describes in detail how to produce mouse embryos of the desired gestational stage, methods to isolate and preserve the heart for downstream processing, quantitative methods to identify common types of CHD by histology (e.g., ventricular septal defects, atrial septal defects, patent ductus arteriosus), and quantitative histomorphometry methods to measure common muscular compaction phenotypes. These methods articulate all the steps involved in sample preparation, collection, and analysis, allowing scientists to correctly and reproducibly measure CHD.

In this protocol, we describe procedures to qualitatively and quantitatively analyze developmental phenotypes in mice associated with congenital heart defects.

정성적 및 정량적 조직학적 방법을 사용하여 마우스 배아의 선천성 심장 결함 분석

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe CHD died before adulthood, with the maximum mortality during the first week of life. Remarkable advances in surgical techniques, diagnostic approaches, and medical management have led to marked improvements in outcomes. To address the critical research needs of understanding congenital heart defects, murine models have provided an ideal research platform, as they have very similar heart anatomy to humans and short gestation rates. The combination of genetic engineering with high-throughput phenotyping tools has allowed for the replication and diagnosis of structural heart defects to further elucidate the molecular pathways behind CHDs. The use of noninvasive fetal echocardiography to screen the cardiac phenotypes in mouse models coupled with the high fidelity of Episcopic fluorescence image capture (EFIC) using Episcopic confocal microscopy (ECM) histopathology with three-dimensional (3D) reconstructions enables a detailed view into the anatomy of various congenital heart defects. This protocol outlines a complete workflow of these methods to obtain an accurate diagnosis of murine congenital heart defects. Applying this phenotyping protocol to model organisms will allow for accurate CHD diagnosis, yielding insights into the mechanisms of CHD. Identifying the underlying mechanisms of CHD provide opportunities for potential therapies and interventions.

This article details murine congenital heart disease (CHD) diagnostic methods using fetal echocardiography, necropsy, and Episcopic fluorescence image capture (EFIC) using Episcopic confocal microscopy (ECM) followed by three-dimensional (3D) reconstruction.

태아 마우스의 구조적 심장 결함을 특성화하는 파이프라인

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...