Name: analysis of coronary vessels in cleared embryonic hearts
Uploaded: 2016-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
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Il lavoro è stato finanziato dal cuore Foundation&#39;and britannico sostenuto dal National Institute for Biomedical Research Centre Health Research al Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust e University College di Londra.

Tutte le ricerche degli animali è stata effettuata in conformità con le linee guida istituzionali sotto licenza dal Regno Unito Home Office. 1. dissezione e la fissazione di cuori embrionali <ol><li> Euthanize un mouse scaduta incinta sul giorno desiderato utilizzando una tecnica di abbattimento etico approvato, ad esempio, di CO 2 narcosi seguita da dislocazione cervicale, e rimuovere le sacche embrionali 14, ponendole in una capsula di Petri 10 centimetri riempito con tampone fosfato salino (PBS) . </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione e pinze, aprire con cautela le sacche uterine e rimuovere ogni embrione, recidere il cordone ombelicale e la rimozione del sacco vitellino. </li><li> Ai fini di genotipizzazione, rimuovere la coda embrionale e posto in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per l&#39;estrazione di lisi / DNA in seguito. </li><li> Per rimuovere cuore, pin ogni embrione sul dorso in un elastomero siliconico rivestito 35 millimetri Petri PBS-riempite, utilizzando perni minutien acciaio inossidabile. Utilizzando una pinza sottile, carefully aprire il torace e tagliare i grossi vasi, anteriore al cuore. Poi raggiungendo dietro il cuore con le pinze, afferrare i vasi dietro il cuore e tirare delicatamente per rimuovere il cuore; polmoni può anche venire via allo stesso tempo. </li><li> Trasferire il cuore ad un fresco 35 millimetri Petri contenenti PBS e utilizzare una pinza sottile per tagliare via il tessuto polmonare, se necessario. Poi il trasferimento cuore in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti riempiti con PBS freddo. </li><li> Dopo aver raccolto tutti i cuori nella piastra 48 pozzetti, aspirare il PBS con una punta fine pipetta Pasteur di plastica e sostituirlo con 0,5 ml 4% paraformaldeide (PFA). ATTENZIONE: PFA è un noto per essere allergenico, cancerogeno e tossico. <ol><li> Fix E11.5 - 12,5 cuori per 15 min, cuori E13.5 per 20 min e E14.5 - 15.5 cuori per 30 minuti, a 4% PFA a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Aspirare il PFA con una punta fine pipetta Pasteur di plastica e sciacquare i cuori 2x in PBS freddo. CAUTION: PFA sono pericolosi e devono essere smaltiti secondo le norme istituzionali. </li><li> Se non si utilizza immediatamente per tutto il monte immunostaining (vedere la sezione 2), disidratano i cuori mediante la realizzazione di successivi 5 min lavaggi nelle seguenti soluzioni: 25% di metanolo / 75% PBS, il 50% di metanolo / 50% PBS, il 75% di metanolo / 25 % PBS. ATTENZIONE: Il metanolo è tossico, indossare guanti. Conservare i cuori a -20 ° C in 100% metanolo. </li></ol> 2. monte intero Immunocolorazione di embrionali cuori con Anti-PECAM1 anticorpo NOTA: Gli anticorpi anti-PECAM1 funzionano bene per la colorazione dei vasi coronarici (vedi punto 2.4), ma qualsiasi marcatore pan-endoteliale, che dà un segnale robusto sarebbe adatto. <ol><li> Se si utilizza cuori che sono stati conservati in 100% metanolo, trasferire 1,5 ml provette da microcentrifuga e reidratare effettuando successivi 5 min lavaggi nelle seguenti soluzioni: 75% metanolo / 25% PBS, 50% metanolo / 50% PBS e 25% metanolo / 75% PBS. </li&gt; <li> Permeabilize i cuori effettuando 3 x 10 min lavaggi in 0,5 - 1,0 ml PBST (PBS / 0.1% Tween-20), rotante a temperatura ambiente. </li><li> Bloccare i cuori ruotando per 1 ora a temperatura ambiente in 1,0 ml di 10% siero di capra in PBST. </li><li> Rimuovere tampone bloccante con una plastica pipetta Pasteur a punta fine o 1.000 ml puntale e sostituirlo con 400 - 500 ml di blocco fresco contenente l&#39;anticorpo primario anti-PECAM1 diluito 1:50. Ruotare i tubi notte a 4 ° C. </li><li> Il giorno successivo, aspirare l&#39;anticorpo blocco / primaria con una pipetta Pasteur di plastica a punta fine o 1.000 ml puntale ed eseguire almeno 6x 1 ora lavaggi in 1,0 ml di PBST, ruotando i tubi a temperatura ambiente. </li><li> Sostituire l&#39;ultimo lavaggio con tampone di bloccaggio fresco contenente l&#39;anticorpo secondario fluoroforo coniugato diluito 1: 500, e incubare una notte a 4 ° C, con rotazione. Proteggere dalla luce avvolgendo i tubi in carta stagnola. </li><li> Il giorno seguente, aspirare il blocco / secanticorpo daria con una punta fine pipetta Pasteur di plastica e di effettuare almeno 6x 1 ora lavaggi in 1,0 ml di PBST, ruotando i tubi a temperatura ambiente. </li><li> Conservare i cuori a 4 ° C (protetto dalla luce) fino a quando necessario. </li></ol> 3. preparazione di soluzioni di compensazione e piatti Microscopia NOTA: Quando l&#39;imaging cuori BABB è vitale che nessuna soluzione BABB entra in contatto con i componenti del microscopio. A tal fine il seguente protocollo contiene le istruzioni per la preparazione di piatti di elastomeri di silicone sigillato adatti per microscopia a fluorescenza, che possono essere preparate in anticipo. L&#39;elastomero siliconico fornisce una barriera per contenere la BABB e impedire che potenzialmente infiltrazioni tra il fondo di vetro ed i lati policarbonato del piatto. <ol><li> Per preparare i piatti elastomero di silicone, prendere piatti ottici con fondo trasparente della cultura e mettere un tappo da un 4 ml con tappo a vite flaconcino (circa 1,5 cm di diametro) Al centro di ogni piatto. NOTA: Questo sarà un bene per il campione quando l&#39;elastomero viene applicata al piatto. </li><li> Riempire i piatti con elastomero siliconico ad una profondità di circa 0,5 cm usando una cartuccia applicatore di mescolare i due componenti sono applicati, in base alle istruzioni del fabbricante. Lasciare curare per almeno 24 ore, facendo attenzione che il tappo del flacone rimane al centro di ogni piatto. NOTA: Usare occhiali di sicurezza per evitare il contatto accidentale del elastomero di silicone con gli occhi. </li><li> Dopo la polimerizzazione l&#39;elastomero, rimuovere il cappuccio della fiala da ogni piatto, Questo lascerà un pozzo centrale dove il campione da acquisire può essere posto a diretto contatto con il fondo di vetro del piatto. NOTA: quando curato l&#39;elastomero deve essere robusto e asciutta al tatto. </li><li> Preparare la soluzione BABB (1 parte di alcool benzilico a 2 parti benzilico benzoato). Questo deve essere conservato in una bottiglia di vetro al riparo dalla luce. ATTENZIONE: BABB è una soluzione tossici, corrosivi. Maneggiare sotto cappa mentre indossa abbigliamento protettivo adeguato. </li><li> Mix BABB e metanolo per ottenere una soluzione 50:50 (1 - 5 ml) in un flacone di vetro. Proteggere dalla luce, ad esempio, avvolgendo la fiala in un foglio. </li></ol> 4. La disidratazione, di compensazione e di montaggio di Cuori per Microscopia confocale NOTA: ingrandita campioni possono essere cancellati in 4 ml fiale di vetro, tuttavia per piccoli campioni (per esempio, cuori fino a E13.5) è meglio effettuare il processo di compensazione direttamente nel piatto microscopia. Questo aiuta a prevenire &#39;perdere&#39; i campioni come i cuori diventano molto trasparente una volta eliminato. Per questi piccoli campioni di compensazione è molto rapida, che si verifica entro pochi minuti. NOTA: Proteggere i campioni dalla luce durante tutte le seguenti fasi di confezionamento / rivestimento tubi e piatti con un foglio. <ol><li> Prima di cancellare, disidratano i-cuori immunostained attraverso una serie di metanolo facendo ruotare i cuori a camera Temperatura in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga a modifiche successive delle seguenti soluzioni: 25% metanolo / 75% PBS, 50% metanolo / 50% PBS e 75% metanolo / 25% PBS (5 min in ciascuna). Infine, ruotare per 3 x 5 min a 100% di metanolo. </li><li> Per i cuori fino a E13.5, posto al centro del piatto microscopio; al microscopio garantire cuore è orientato con il suo alto lato dorsale. Rimuovere eventuali metanolo da tutto il cuore con una punta fine pipetta di plastica Pasteur. </li><li> Utilizzando un pulito a punta fine di plastica pipetta Pasteur, aggiungere BABB: metanolo 50:50 soluzione in un volume sufficiente per immergere il cuore (circa 300-400 ml). Come il cuore a volte può capovolgere nella soluzione, prova di nuovo l&#39;orientamento mentre i cuori sono ancora opachi. Lasciare nella soluzione per 5 min. </li><li> Rimuovere la soluzione 50:50 a una bottiglia di rifiuti di vetro in cappa e sostituirlo con BABB, ancora una volta con un a punta fine di plastica pipetta Pasteur. NOTA: Un grande volume non è necessaria; aggiungi sufficient modo che il cuore si trova all&#39;interno di una goccia di soluzione. Il cuore deve cancellare entro 5 minuti. </li><li> Per i cuori più grandi, cancellare i campioni in fiale di vetro. NOTA: Un cuore E15.5 dovrebbe risolversi entro 30 minuti-1 ora, ma può essere lasciata durante la notte se necessario. </li><li> Dopo che il campione è chiaro, rimuovere la soluzione e sostituirlo con un volume minimo di BABB. Facoltativamente, coprire il campione con un vetrino, per aiutare a mantenere in posizione, tuttavia questo non è assolutamente necessario. Utilizzare il cuore per l&#39;imaging. </li></ol> 5. Imaging Azzerato Cuori da Microscopia confocale NOTA: Le immagini sono state catturate su un microscopio confocale invertito utilizzando 10X o 20X obiettivi a secco. Sebbene sia possibile utilizzare i piatti su un confocale verticale, particolare attenzione deve essere presa per evitare il contatto dell&#39;obiettivo con la soluzione BABB. <ol><li> Raccogliere un z-scan del cuore 15. A seconda delle dimensioni del cuore, una scansione tegola può essere richiesto di immagine tutto il cuore 16. <br/&gt; ATTENZIONE: BABB è una soluzione corrosiva, indossare guanti puliti e garantire la parte esterna del piatto di microscopia è esente da BABB. Maneggiare il piatto con attenzione e tenere il coperchio sul piatto per minimizzare il rischio di contatto accidentale con il microscopio. </li><li> Se la distanza di lavoro obiettivo permette, utilizzare un ingrandimento maggiore per ottenere immagini ad alta risoluzione di regioni di interesse. </li></ol> 6. Analisi dei dati mediante Fiji Software <ol><li> Aprire la z pila di immagini in Fiji 17. </li><li> Per rendere la proiezione az di tutta la pila o parte di esso, clicca sull&#39;immagine e selezionate Pila, seguito dal progetto Z. Inserisci Start e Stop numeri delle sezioni, e selezionare il tipo di z di proiezione, ad esempio, l&#39;intensità media, intensità max. </li><li> Per evidenziare i singoli vasi all&#39;interno di una pila di fette di immagine utilizzano lo strumento Blow (dal menu di selezione Plugin segmentazione, e poi soffiare / strumento Lazo) e cliccare sulle aree dell&#39;immagine da compilare e bisfetta ch. Utilizzare il comando Fill (fare clic su Modifica, quindi selezionare Fill) per riempire le aree selezionate con il colore di primo piano della scelta (fare clic su Modifica, quindi selezionare Opzioni, seguito da colori e primo piano). </li><li> Progetto Z l&#39;immagine pila come prima. </li></ol> 7. 3D Surface Volume Rendering delle arterie coronarie generato utilizzando Imaris <ol><li> Fare clic sulla vista icona di sorpassare nella parte superiore dello schermo e trascinare il file immagine nella finestra dei dati. Fare clic sulla icona Vista 3D nella parte superiore dello schermo. </li><li> Selezionare l&#39;icona superfici (icona blu) e quindi fare clic sulla scheda Crea. Fare clic nella finestra di dialogo &#39;Skip creazione automatica, modificare manualmente&#39; e cliccare sull&#39;icona Draw (sottile icona della matita). </li><li> Selezionare la scheda Contour, e poi la scheda Modalità. In modalità, cliccare sulla bacchetta magica o le icone ISOLINE. Scegliere la modalità puntatore nella selezione puntatore sul lato destro dello schermo facendo clic su accanto a &#39;Seleziona&#39;, e quindi fare clic su &#39;Draw9; scatola (in basso a sinistra dello schermo). </li><li> Utilizzare lo ISOLINE o strumento bacchetta magica per selezionare i contorni delle arterie a fette successive. Passare dalla fetta di tagliare con il cursore Slice posizione. </li><li> Quando tutti i contorni sono stati selezionati, fare clic sulla casella Crea superficie. Il volume circostante può essere reso invisibile, o resa più o meno opaca utilizzando la modalità di fusione; cliccare sul volume per evidenziarlo e quindi selezionare la scheda Impostazioni, quindi la scheda Modalità. Selezionare Miscela e utilizzare il cursore per modificare l&#39;opacità. </li><li> Cattura immagini utilizzando la funzione Snapshot. </li></ol>

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	<li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Klotz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+lymphatics+are+heterogeneous+in+origin+and+respond+to+injury.">Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury.</a> Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).</li><li>Nam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+veins+determine+the+pattern+of+sympathetic+innervation+in+the+developing+heart.">Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart.</a> Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).</li><li>Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+tissue+optical+clearing.">Recent progress in tissue optical clearing.</a> Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+of+morphology+and+apoptosis+in+organogenesis-stage+mouse+embryos.">Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos.</a> Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cleared+intact+biological+systems+at+a+cellular+level+by+3DISCO.">Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO.</a> J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).</li><li>Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+isolation+from+the+developing+embryonic+mouse+heart+valve+region.">Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region.</a> J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).</li><li>Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+development+using+immunofluorescence+in+embryonic+mouse+heart.">Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart.</a> J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Ivins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CXCL12/CXCR4+Axis+Plays+a+Critical+Role+in+Coronary+Artery+Development.">The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development.</a> Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).</li><li>Theveniau-Ruissy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+stem+development+in+wild-type+and+Tbx1+null+mouse+hearts.">Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts.</a> Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).</li><li>Tomanek, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+coronary+vasculature+during+development.">Formation of the coronary vasculature during development.</a> Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+formation.+De+novo+formation+of+a+distinct+coronary+vascular+population+in+neonatal+heart.">Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart.</a> Science. 345 (6192), 90-94 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

vasi coronarici in interi cuori embrionali sono stati ripresi da immunostaining wholemount con anticorpi anti-PECAM1 seguito da gioco ottica e la microscopia confocale. Il metodo semplice qui descritto, per la liquidazione dei cuori embrionali di topo con BABB, aumenta la penetrazione ottica e consente la cattura di immagini ad alta risoluzione dei vasi sanguigni localizzati nelle pareti dell&#39;aorta e ventricolari. Glicerolo a base di reagenti di montaggio, come Vectashield (indice di rifrazione 1,45) sono stati utilizzati anche per l&#39;imaging del sistema vascolare coronarico 22 invece l&#39;indice di rifrazione più elevato di Babb (1,56) riduce la dispersione della luce ancora di più, consentendo la penetrazione nei tessuti più profondi. passaggio Tissue elimina la necessità di più complesse, costose forme di microscopia come multifotonica e microscopia foglio leggero che può essere meno prontamente disponibile per i ricercatori. Il processo di compensazione è estremamente rapido rispetto ad altri metodi 6-9 e per piccoli campioni possono essere caRRied utilizzando piccoli volumi di reagenti direttamente sul piatto microscopia. colorazione robusta della vascolarizzazione è necessaria al fine di ottenere immagini di alta qualità; anti-PECAM1 anticorpo è stato selezionato come segna tutti i tipi di coronarica EC e una serie di anticorpi commerciali sono stati trovati invia opportunamente elevati livelli di colorazione. Inoltre, la colorazione fluorescente appare estremamente stabile in BABB; campioni conservati a temperatura ambiente in BABB (protetti dalla luce) mantenuto la loro segnale fluorescente per diversi mesi. Il fatto che PECAM1 anticorpo marca efficacemente l&#39;endocardio coronarica e vascolare era talvolta problematico, soprattutto durante la cattura immagini del plesso peritruncal. Forte colorazione del lume aortico rispetto al peritruncal EC determinato un rischio di sovra-saturazione in alcune zone delle immagini, il che significa che è stato richiesto un&#39;attenta regolazione dei parametri di imaging. Idealmente, una colorazione anticorpi solo vascolare EC sarebbe stato utilizzato; in pratica,tuttavia, trovare gli anticorpi adatti che producono il livello di colorazione wholemount può essere difficile. Recentemente, acido grasso proteina legante 4 (FABP4) ha dimostrato di essere un indicatore della coronaria EC vascolare 23 e può quindi rappresentare un&#39;alternativa alla PECAM1. Al fine di mantenere la morfologia 3D delle camere aorta e cuore i campioni non erano piatto montato, ma sono stati invece ripreso in piatti con fondo trasparente. La profondità dei campioni da acquisire precluso l&#39;uso di obiettivi ad alto ingrandimento, a causa delle loro brevi distanze di lavoro. Tuttavia immagini ad alta risoluzione erano ancora raggiungibili utilizzando un obiettivo 10X, aumentando il tempo di permanenza dei pixel e con una dimensione di matrice di pixel di almeno 1.024 x 1.024 per la cattura delle immagini. Questo era sufficiente per l&#39;analisi della struttura e distribuzione dei vasi coronarici, tuttavia Un&#39;analisi più accurata struttura cellulare può richiedere piatta montaggio dei campioni. La dissezione di singole parti del cuore per il montaggio,ad esempio, pareti ventricolo o aorta, può anche essere necessario. In alternativa, sovracampionamento dell&#39;immagine seguita da deconvoluzione può essere effettuata al fine di aumentare la risoluzione e la sensibilità; questo però richiede molto più tempo i tempi di scansione e crea file di immagini molto grandi che richiedono molta potenza di calcolo per elaborare. Cuori fino a E15.5 sono stati ripresi con successo utilizzando questo metodo, ed è anche possibile analizzare la vascolarizzazione di embrioni interi (almeno fino a E11.5) utilizzando lo stesso protocollo. Altri tipi di cellule, ad esempio, cellule muscolari lisce sono state anche ripreso nel nostro laboratorio utilizzando questa tecnica. Per i tessuti più spessi, per esempio, cuori di età superiore a E15.5, la penetrazione degli anticorpi può essere un fattore limitante; può essere richiesto incubazione più lunghi e / o un aumento di detergente. Inoltre, quando si raccolgono una grande z pila di immagini intensità del segnale può essere ridotto come i laser penetrano più lontane porzioni di tessuto; tuttavia il confimpostazioni ocal possono essere regolate per aumentare la potenza del laser con l&#39;aumentare della distanza z. Questo metodo facilita l&#39;analisi al microscopio confocale di entrambe le prime fasi della formazione dei vasi coronarici e il patterning delle arterie coronarie in fasi di sviluppo successive. Informazioni dettagliate sulla distribuzione, ramificazione e la struttura dei vasi sanguigni può essere acquisita in breve tempo, rendendo questo un prezioso strumento per lo studio di mutanti genetici di topo con difetti specifici percorsi di angiogenesi.

Creazione di una rete coronarica funzionante è fondamentale per la funzione del cuore e lo sviluppo embrionale, e l&#39;analisi di mutanti genetici del mouse in grado di fornire informazioni preziose in segnali molecolari alla base di questo processo di sviluppo. La capacità di visualizzare plesso coronarie embrionali nel suo complesso, piuttosto che presentato in una serie di sezioni istologiche, è essenziale per facilitare l&#39;analisi di patterning nave in mutanti genetici, ed evita la perdita potenziale di informazioni che possono verificarsi a seguito di meccanico affettatura del tessuto. Vasi destinata a formare le arterie e capillari sono localizzati in profondità all&#39;interno delle mura di entrambi i ventricoli e l&#39;aorta 1-3. Tuttavia, mentre marcatura fluorescente di cellule in combinazione con scansione laser confocale in grado di fornire immagini ad alta risoluzione di navi wholemount marcato superficiali venose / linfatici 4,5, la profondità delle immagini è limitata dalla penetrazione ottica. immagini ad alta risoluzione di tappoillaries e arterie in tutto il tutta la profondità del cuore non è quindi possibile senza una qualche forma di compensazione dei tessuti. Penetrazione ottica scadente è causato dalla alto indice di rifrazione del multiplo cellulare e extracellulare (per esempio, collagene e fibre elastiche) componenti di tessuti spessi. Questo disperde la luce di imaging, causando la sfocatura e una diminuzione del contrasto. gli agenti di compensazione genere corrispondono l&#39;elevato indice di rifrazione di tali tessuti, il che significa che la luce può viaggiare attraverso il campione senza ostacoli e penetrare in profondità nel tessuto. Prima di compensazione, i tessuti sono generalmente disidratati come l&#39;acqua ha un indice di rifrazione relativamente basso. Una pletora di nuovi metodi di compensazione sono stati sviluppati di recente, tuttavia a seconda della tecnica utilizzata, il processo di compensazione può richiedere giorni o settimane e può richiedere costosi reagenti 6-9. BABB (una miscela 1: 2 di alcool benzilico e benzil benzoato) è un agente di compensazione comunemente usato poco costoso, che ha lavantaggio di compensazione campioni in modo estremamente rapido. Tecniche di compensazione BABB-based e di imaging sono stati descritti in precedenza per i campioni neurologici e vari organi 10-13. Qui si descrive una tecnica solida e lineare per la liquidazione BABB di campioni immunostained seguita da microscopia confocale, con specifico riferimento all&#39;esame dei vasi sanguigni nei cuori murini da E (giorno embrionale) 11,5-15,5. Tuttavia, come è stato anche dimostrato, la tecnica può essere ugualmente applicata ad analisi di embrioni interi, così come altri tipi di cellule, purché anticorpi alta qualità ai marcatori di interesse sono disponibili.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dishes</td><td>Sigma</td><td>P5112</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter</td><td>FST</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip pastettes&amp;nbsp;</td><td>Alpha Laboratories</td><td>LW4061</td><td></td></tr><tr><td>1,000 ml pipette tips</td><td>Sorenson</td><td>34000</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Gard</td><td>World Precision Instrument</td><td>KWIKGARD</td><td>Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing</td></tr><tr><td>Kwik-Gard refill</td><td>World Precision Instrument</td><td>KWIKGLUE</td><td>Refill cartridges and dispensing tips</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Make up in PBS and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>VWR</td><td>20847307</td><td></td></tr><tr><td>Tween&amp;reg;20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA3105</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 400</td></tr><tr><td>Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-65495</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 250</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11007</td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab173003</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21208</td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Phenolic screw cap</td><td>Wheaton</td><td>240408</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane Imaging</td><td>image analysis software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Freeware</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of coronary vessels in cleared embryonic hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

Come il cuore si sviluppa, il miocardio ventricolare è invaso da cellule endoteliali (EC) da varie fonti, e si forma un plesso vascolare. Le navi che si sviluppano all&#39;interno del miocardio ventricolare andranno a formare le reti capillari e arterie che forniscono sangue ossigenato al cuore del tessuto 18. Allo stesso tempo (circa E11.5) coronaria steli cominciare a sviluppare indipendentemente da una rete capillare separata (noto come plesso peritruncal) che circonda il lume dell&#39;aorta 14,19,20. Peritruncal plesso EC inizialmente forma più connessioni con il lume dell&#39;aorta a livello dei seni valvolari, tuttavia definitiva solo vaso persisterà su ciascun lato della aorta, andando a formare le radici delle arterie coronarie destra e sinistra 21. Dalla intorno E13.5 il peritruncal e ventricolare vasi del miocardio si uniscono per formare una rete interconnessa, permettendo il flusso di sangue dal unorta nei vasi coronarici 14,22. La colorazione di EC con anti-PECAM-1 anticorpi, combinato con BABB liquidazione dei cuori intatti, permette l&#39;analisi delle reti coronariche in via di sviluppo dalle prime fasi possibili. Nelle fasi di sviluppo successive alla patterning delle arterie coronarie in scadenza può anche essere esaminato. Questo metodo può anche essere utilizzato per colorare la vascolarizzazione di embrioni interi (fino a E11.5 almeno), e con differenti anticorpi, per esempio, anti-alfa del muscolo liscio actina (Sm22α) e Endomucin. La figura 1 mostra il massimo di intensità z-proiezioni di un cuore E11.5 generata utilizzando il software Fiji. La funzione Tile stato usato per raccogliere più immagini parziali del cuore ed unirle in un&#39;immagine completa; questo è utile per fornire un quadro della colorazione nell&#39;intero campione. A questo anticorpo fase PECAM1 macchie principalmente il rivestimento endocardica del cuore e deflusso vessels, tuttavia alcuni EC può anche essere osservato nella parete ventricolare sinistra (regione scatola in figura 1A, mostrata ingrandita in 1A &#39;). Inoltre, il plesso peritruncal possono essere osservati chiaramente nella parete del tratto di efflusso (OT) (regione scatola nella Figura 1B). In quest&#39;ultimo caso, la riduzione del numero di fette nel z-stack utilizzato per generare la proiezione migliorata la chiarezza dell&#39;immagine, consentendo i collegamenti con il lume dell&#39;aorta da visualizzare più distintamente (Figura 1B &#39;). In figura 2, l&#39;aumentata vascolarizzazione prossimale all&#39;aorta può essere osservato in un cuore E12.5. La Figura 3 mostra il plesso peritruncal in un cuore E12.5. La z sporgenza 12-fetta in figura 3A mostra l&#39;intero plesso, tuttavia, come alcuni vasi sono localizzate ventralmente al lume dell&#39;aorta (che è anche fortemente colorate con anticorpo anti-PECAM1), dividendo la z-stack into una serie di sotto-cataste (Figura 3B-D) fornisce ulteriori informazioni visive. Per esempio, la sotto-mazzetta proiettata nella Figura 3B mostra una nave peritruncal collegamento alla superficie ventrale del lume aortico, che non è visibile nella piena proiezione. La figura 4 mostra una parte di un cuore E15.5; le arterie coronarie sono chiaramente visibili in questa fase (Figura 4A, proiezione 30-slice). Nei 5 slice z proiezioni mostrate nelle figure 4B e C le valvole aortica e polmonare possono anche essere visualizzati da PECAM1 colorazione; i rami e le interconnessioni della rete capillare coronarica sono anche più chiaro in queste proiezioni sub-stack più piccoli. Tecniche di segmentazione manuale sono state utilizzate per evidenziare le arterie coronarie utilizzando Fiji (Figura 4D) o Imaris (Figura 4D ed E). Il volume rendering 3D della superficie delle arterie coronarie / lume aortico u generaticantare Imaris può essere visualizzato con o senza il sistema vascolare circostante (Figura 4E e F). La vascolarizzazione degli embrioni interi può anche essere esaminata usando PECAM1 colorazione / BABB spazio. Figura 4A e A &#39;, mostrano z proiezioni generati dal sotto-cataste dal lato destro (z fette 11 - 65) e sinistra (z fette 66-110) dell&#39;embrione, rispettivamente. Il confronto delle due immagini mostra che l&#39;intensità del segnale fluorescente non diminuiva significativamente con maggiore penetrazione nel tessuto. Nella Figura 4B, PECAM1 (segnale rosso) e Endomucin (segnale verde) anticorpi sono stati combinati per etichettare le arterie intersomitic (ISA) e le vene, rispettivamente, di un embrione E11.5. La figura 4C mostra SM22α (segnale rosso) e PECAM1 colorazione (segnale verde) di ISA in un embrione E11.5. In figura 6, embrioni E11.5macchiato con PECAM 1 sono stati ripresi subito dopo BABB gioco (Figura 4A), oppure dopo un intervallo di circa due mesi (Figura 4B). Il segnale fluorescente era ancora abbastanza forte da un&#39;immagine con successo dopo conservazione prolungata del campione in BABB. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig1.jpg" /> Figura 1. Immunocolorazione di un cuore E11.5 con Anti-PECAM1 anticorpo (rilevato con anti-topo IgG coniugato Alexa 594). (A, B) un&#39;immagine di 2 x 2 piastrellato stati raccolti usando l&#39;obiettivo 10X di un microscopio confocale invertito. anticorpo colora PECAM1 sia endocardici ed ECS vascolare. Le proiezioni (intensità massima) sono stati generati da 22 (A) o 5 (B) z fette ciascuno di 4 micron di spessore, utilizzando il software Fiji. A &#39;e B&#39; sono enlargements delle aree in scatola, rispettivamente A e B. Frecce in A &#39;indicano i vasi sanguigni nella parete del ventricolo; in B &#39;, la staffa indica il plesso peritruncal. OT, tratto di efflusso; LV, ventricolo sinistro, RV ventricolo destro. Tutte le immagini sono viste frontali. Barre di scala in A e B = 200 micron; barre di scala in A &#39;e B&#39; = 100 micron. Pannello 1B &#39;è stato adattato da Ivins et al. 2015 19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig2.jpg" /> Figura 2. Immunocolorazione di un cuore E12.5 con Anti-PECAM1 anticorpo. Pannello A mostra la proiezione az (massima intensità) di una scansione 2x2 piastrelle. La regione in scatola in A è mostrato AMPLIAEd in A &#39;; frecce indicano multipli vasi sanguigni prossimale all&#39;aorta (Ao). LV, ventricolo sinistro, RV ventricolo destro. Tutte le immagini sono viste frontali. Barra di scala in A = 200 micron; barra della scala in A &#39;= 100 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig3.jpg" /> Figura 3. Imaging del plesso Peritruncal in un cuore E12.5. immagini confocale di un dell&#39;aorta E12.5 (Ao) colorati con anticorpo anti-PECAM1 sono stati raccolti utilizzando l&#39;obiettivo 10X. La proiezione z (intensità massima) in A è stata generata da 12 fette z (4 micron di spessore); frecce indicano i vasi del plesso peritruncal. BD Il 12 z fette sono stati divisi in tre sotto-cataste come indicato e usato per generare projecti separataons; frecce indicano connessioni formate dal plesso peritruncal al lume dell&#39;aorta. Vasi Peritruncal localizzate ventralmente al lume dell&#39;aorta sono visibili in B e C. Tutte le immagini sono viste frontali. Barra di scala = 50 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig4.jpg" /> Figura 4. arterie coronarie e capillare plesso in un cuore E15.5. immagini confocale di un cuore E15.5 macchiato con anticorpi anti-PECAM1 sono stati raccolti utilizzando l&#39;obiettivo 10X. Pannello A mostra una proiezione massima intensità z generato da 30 fette z (4 micron di spessore); frecce indicano le arterie coronarie destra e sinistra (LCA e RCA) che si possono vedere il collegamento con l&#39;aorta (Ao). utilizzando different 5 z fetta sub-impila le valvole aortica e polmonare (AOV e PV) possono essere visti rispettivamente (parentesi blu) in B e C. Il capillare del plesso ventricolare è anche più chiaro in queste proiezioni sub-stack più piccoli; vasi sanguigni prossimali alla valvola polmonare (piccola scatola) sono mostrati allargato in basso a destra del pannello C (grande scatola). Fiji è stato utilizzato per evidenziare i vasi sanguigni individuali, ad esempio, per il pannello D il / strumento lazo colpo è stato utilizzato per riempire le arterie coronarie con il colore rosso manualmente in ogni z fetta prima di proiezione. Software Imaris è stato utilizzato per creare immagini in 3D delle arterie (rosso) e lume aortico (verde) in E e F; ancora una volta questo è stato fatto manualmente, utilizzando lo strumento bacchetta magica per creare contorni degli oggetti in ogni z fetta. L&#39;opacità del volume circostante può essere modificata nel modalità di fusione, come in E. In alternativa, l&#39;immagine 3D può essere estratto, come illustrato in F </sTrong&gt;. LV, ventricolo sinistro. Tutte le immagini sono viste frontali. Barra di scala in A = 100 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig5.jpg" /> Figura 5. Imaging di embrionali Vasculature. Pannelli A e A &#39;mostrare immagini confocale di un E10.5 embrione wild type macchiato con anticorpi anti-PECAM1, raccolti con l&#39;obiettivo 10X (scansione piastrelle). Intensità media z proiezioni sono stati generati da z fette 11-65 (A) e 66-110 (A &#39;) di una scansione fetta 120 z (4 micron fette spesse), mostrando solo una leggera perdita di intensità di fluorescenza attraverso lo spessore dell&#39;embrione . Pannello B mostra i vasi intersomitic di un embrione E11.5 colorati con gli anticorpi<html> i contro PECAM1 (segnale rosso da anticorpo secondario 594-coniugato) e Endomucin (EMCN, segnale verde da anticorpo secondario 488-coniugato), che macchiano le arterie intersomitic (freccia) e vene (punta di freccia), rispettivamente (media intensità z proiezione da un piastrellato scansione). Pannello C mostra arterie intersomitic (ISA) da un E11.5 embrione wild type macchiato con anticorpi contro PECAM1 (segnale verde da anticorpo secondario 488-coniugato) e SM22α (segnale rosso da anticorpo secondario 594-coniugato). immagini confocale sono stati raccolti utilizzando l&#39;obiettivo a secco 20X e utilizzati per generare il massimo proiezioni intensità z. Tutte le immagini sono viste sagittali. Barre di scala in A e B = 250 micron, bar scala C = 100 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> d / 54800 / 54800fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. I campioni immunostained sgomberati a Babb Conservare segnale fluorescente per almeno due mesi. embrioni E11.5 sono state colorate con l&#39;anticorpo PECAM1 e liquidati con BABB; embrioni dello stesso lotto sono stati ripresi immediatamente o dopo un intervallo di due mesi. Pannello A mostra le arterie intersomitic dell&#39;embrione imaged immediatamente e il pannello B mostra l&#39;embrione ripreso due mesi più tardi. immagini confocale sono stati raccolti utilizzando l&#39;obiettivo a secco 10X e utilizzati per generare il massimo proiezioni intensità z. dAO, aorta dorsale. Immagini mostrano viste sagittali. Barre di scala in A e B = 100 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Vi presentiamo un protocollo per l&#39;analisi dei vasi coronarici, in tutto cuori murini embrionali fino a E15.5, usando metodi di colorazione immunologici standard, seguiti da gioco ottica e la microscopia confocale. Questa tecnica permette la visualizzazione dei vasi sanguigni durante tutto cuore senza la necessità di analizzare tempo di sezioni seriali.

Analisi dei vasi coronarici in sgomberati cuori embrionali

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K Views.  UCL Institute of Child Health.  Vi presentiamo un protocollo per l'analisi dei vasi coronarici, in tutto cuori murini embrionali fino a E15.5, usando metodi di colorazione immunologici standard, seguiti da gioco ottica e la microscopia confocale. Questa tecnica permette la visualizzazione dei vasi sanguigni durante tutto cuore senza la necessità di analizzare tempo di sezioni seriali. 

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A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Un metodo per l&#39;etichettatura vasi embrionali nei topi

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Biologia dello sviluppo

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Usando In Vivo e del tessuto e delle cellule Explant approcci per studiare la morfogenesi e la patogenesi dell'Aorta embrionale e perinatale

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Analisi quantitativa intero-monta immunofluorescenza delle popolazioni di cellule progenitrici cardiache in embrioni di topo

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes for CHD are still poorly understood. The developing mouse constitutes a valuable model for the study of CHD, because cardiac developmental programs between mice and humans are highly conserved. The protocol describes in detail how to produce mouse embryos of the desired gestational stage, methods to isolate and preserve the heart for downstream processing, quantitative methods to identify common types of CHD by histology (e.g., ventricular septal defects, atrial septal defects, patent ductus arteriosus), and quantitative histomorphometry methods to measure common muscular compaction phenotypes. These methods articulate all the steps involved in sample preparation, collection, and analysis, allowing scientists to correctly and reproducibly measure CHD.

In this protocol, we describe procedures to qualitatively and quantitatively analyze developmental phenotypes in mice associated with congenital heart defects.

Analisi dei difetti cardiaci congeniti negli embrioni dei topi utilizzando metodi istologici qualitativi e quantitativi

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

En Face Preparazione del cuscino endocardico per l'analisi della morfogenesi planare negli embrioni di topo

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe CHD died before adulthood, with the maximum mortality during the first week of life. Remarkable advances in surgical techniques, diagnostic approaches, and medical management have led to marked improvements in outcomes. To address the critical research needs of understanding congenital heart defects, murine models have provided an ideal research platform, as they have very similar heart anatomy to humans and short gestation rates. The combination of genetic engineering with high-throughput phenotyping tools has allowed for the replication and diagnosis of structural heart defects to further elucidate the molecular pathways behind CHDs. The use of noninvasive fetal echocardiography to screen the cardiac phenotypes in mouse models coupled with the high fidelity of Episcopic fluorescence image capture (EFIC) using Episcopic confocal microscopy (ECM) histopathology with three-dimensional (3D) reconstructions enables a detailed view into the anatomy of various congenital heart defects. This protocol outlines a complete workflow of these methods to obtain an accurate diagnosis of murine congenital heart defects. Applying this phenotyping protocol to model organisms will allow for accurate CHD diagnosis, yielding insights into the mechanisms of CHD. Identifying the underlying mechanisms of CHD provide opportunities for potential therapies and interventions.

This article details murine congenital heart disease (CHD) diagnostic methods using fetal echocardiography, necropsy, and Episcopic fluorescence image capture (EFIC) using Episcopic confocal microscopy (ECM) followed by three-dimensional (3D) reconstruction.

Una pipeline per caratterizzare i difetti cardiaci strutturali nel topo fetale

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metodo di Cultura per il mouse embrionale del cuore

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Analisi dei vasi coronarici in sgomberati cuori embrionali

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Un metodo per l'etichettatura vasi embrionali nei topi