Dieses Protokoll beschreibt modernste Methoden zur Generierung hochauflösender Bildgebungsdaten für die Diagnose von angeborenen Herzfehlern. Wir führen funktionelle Beurteilungen mit nicht-invasiver fetaler Echokardiographie in Kombination mit Nekropsie und anschließender episkopaler konfokaler Mikroskopie-Histopathologie durch, um serielle 2D-Bildstapel und 3D-Rekonstruktionen für eine umfassende KHK-Diagnose zu erstellen. Diese Methode kann die detaillierten anatomischen Veränderungen nicht nur bei angeborenen Herzfehlern aufklären, sondern kann auch verwendet werden, um strukturelle Geburtsfehler in anderen Organen zu untersuchen, einschließlich kranialer Gesichtsfehler, Gliedmaßen- und Skelettanomalien sowie Defekte des Gehirns und anderer viszeraler Organe.
Meghan Holbrook, Carla Guzman, Peizhao Zhang und Benjamin Glennon, alle Forscher aus unserem Labor, werden diese Verfahren demonstrieren. Nachdem Sie die Maus für den Eingriff vorbereitet haben, erwärmen Sie das Ultraschallgel auf eine Körpertemperatur und tragen Sie es großzügig auf den Bildgebungsbereich auf. Legen Sie dann den Schallkopf auf den Bauch, der in einer horizontalen Ebene ausgerichtet ist, und identifizieren Sie die Blase auf dem Bildschirm.
Sobald die Blase identifiziert ist, scannen Sie kranial von der Blase, suchen Sie nach dem Fötus und bestimmen Sie das Gestationsalter, indem Sie die Krone auf die Rumpflänge messen. Als nächstes verwenden Sie den Farbdoppler, um den Blutfluss vom Herzen zu analysieren. Um das Eindringen von Fixiermitteln in die inneren Organe zu ermöglichen, machen Sie Schnitte im seitlichen Brustkorb und Bauch mit einer Pinzette oder einer Sezierschere und lassen Sie die Probe mindestens 24 Stunden in einem Kühlraum fixieren.
Richten Sie dann die Software so ein, dass die Bilder mit einem Namen gespeichert werden, einschließlich der Identifizierung der Probe, der Vergrößerung des Mikroskops und des Bildinhalts. Stecken Sie die Probe durch ihre Handgelenke und Knöchel. Bevor Sie die Haut entlang der Mittelachse in Richtung Schwanz schneiden, heben Sie die Haut in der Mitte des Halses mit einer Pinzette an und schneiden Sie die Haut mit der Schere in Richtung der beiden Achselhöhlen.
Schneiden Sie dann die Haut vom Nabel bis zu den Beinen. Stellen Sie nach dem Einbetten der Proben die Laserprojektionsposition auf die Mitte der Probe auf dem Bildschirm ein und stellen Sie den Zoomknopf auf 20x ein. Um die Auflösung zu optimieren, stellen Sie die Verstärkung auf 1.250 V ein.
Maximieren Sie den blauen Bereich mit dem Fokusknopf und setzen Sie dann die Verstärkung für die Bildgebung auf ca. 750 V zurück. Als nächstes stellen Sie die Schneidemethode auf Auto um. Stellen Sie die Dicke auf etwa 50 Mikrometer ein und lassen Sie die Objektträger laufen.
Hören Sie auf zu schneiden, wenn die Lunge und die Atemwege in Sicht sind. Wählen Sie eine Schnittstärke zwischen acht bis 10 Mikrometern und stoppen Sie die Live-Ansicht offen. Öffnen Sie Microtome Communicator, um die Bildgebung zu starten.
Stellen Sie sicher, dass der temporäre Speicherordner leer ist, bevor Sie Bilder sammeln. Stoppen Sie die Bildsammlung, wenn keine feste Struktur sichtbar ist. Geben Sie die temporär gespeicherten Dateien in eine TIFF-Bildserie aus.
Geben Sie für die Pixel-X-Auflösung und die Pixel-Y-Auflösung die Bildauflösung ein, indem Sie den Zoom angeben, der während der ECM-Bildgebung verwendet wird. Geben Sie für das Schichtintervall die Schichtdicke ein, die während der ECM-Bildgebung zum Schneiden verwendet wird. Verwenden Sie als Nächstes das WWWL-Tool, um die Fensterbreite und die Fensterebene anzupassen.
Klicken Sie auf das Werkzeug und ziehen Sie es auf das Bild nach oben, um die Bildhelligkeit zu verringern, und nach unten, um sie zu erhöhen. Klicken Sie auf das Werkzeug und ziehen Sie es nach rechts, um den Bildkontrast zu verringern, und das linke Wort, um ihn zu erhöhen. Ziehen Sie die Bilder mit dem Schwenkwerkzeug an die gewünschten Positionen.
Verwenden Sie das Zoom-Werkzeug, um das Bild zu vergrößern oder zu verkleinern, und das Drehen-Werkzeug, um das Bild wie gewünscht zu drehen. Klicken Sie nun auf die farbige Achse des ersten Fensters und ziehen Sie sie. Beachten Sie, wie sich die Ausrichtung der beiden anderen Bereiche durch Drehen dieser Achse ändert.
Drehen Sie die Achsen der drei Felder, bis die drei Felder koronale, sagittale und transversale Ansichten der Probe darstellen. Sobald alle drei Panels entsprechend positioniert, ausgerichtet und aufgehellt sind, klicken Sie auf das Panel, das die koronale Ansicht darstellt. Klicken Sie dann auf der rechten Seite der Menüleiste auf Movie Export.
Klicken Sie auf Stapel und ziehen Sie die Schieberegler "Von" und "Bis", um den gesamten Interessenbereich zu erfassen. Wählen Sie für das Intervall die Option "Identisch mit der Dicke" und speichern Sie das Video, das die Ausrichtung der Ansicht angibt. Das Echo zeigt ein intaktes Ventrikelseptum ohne intraventrikulären Shunt und normal verwandte große Arterien in der normalen Kontrolle, was durch ECM bestätigt wurde.
Die Frontalansicht zeigt die Kommunikation zwischen LA, RA, LV und RV sowohl im Echo als auch in der ECM, was auf einen atrioventrikulären Septumdefekt hindeutet. Der Farbfluss zeigt den Fluss über LV und RV, der auf einen Ventrikelseptumdefekt hinweist. Echo und ECM zeigten einen doppelten Ausgang des rechten Ventrikels mit einem Ventrikelseptumdefekt zwischen LV und RV mit nebeneinander liegenden großen Arterien.
Die Ultraschalldiagnostik des persistierenden Truncus arteriosus zeigt die Kommunikation zwischen LV und RV mit einem einzigen Abflusstrakt, der beide Ventrikel überlagert, was auch durch ECM im Stadium E14,5 bestätigt wurde. Die aus der ECM-Histologie gewonnenen Schnitte können für die Immunfärbung, die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung und sogar die Nukleinsäureextraktion für die Genotypisierung und das transkriptionelle Profiling oder die Proteinextraktion für die Proteomikanalyse weiterverarbeitet werden. Die Bilder aus der dreidimensionalen Rekonstruktion können für die Beurteilung von quantitativen Perimetern wie Fläche oder Volumen weiterverarbeitet werden.
Eine genaue Phänotypisierung zur Identifizierung von Defekten in der kardiovaskulären Anatomie ist unerlässlich für die Etablierung von gentechnisch veränderten und mutierten Mausmodellen für angeborene Herzfehler, um die Pathomechanismen angeborener Herzfehler aufzuklären. Dies kann zu potenziellen Möglichkeiten führen, Therapien und Interventionen zu entwickeln, um das klinische Ergebnis bei Patienten mit angeborenen Herzfehlern zu verbessern.
