O trabalho foi financiado pela British Heart Foundation&#39;and apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde Centro de Investigação Biomédica no Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust e da University College London.

Toda a pesquisa animal foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais sob licença do UK Home Office. 1. Dissecção e Fixação de Embrionárias Corações <ol><li> Euthanize um rato cronometrado-grávida no dia desejado usando uma técnica de abate eticamente aprovado, por exemplo, o CO 2 narcose seguido por deslocamento cervical, e remover os sacos embrionários 14, colocando-os em uma placa de Petri 10 centímetros preenchido com tampão fosfato salino (PBS) . </li><li> Usando um microscópio de dissecção e uma pinça, abrir-se cuidadosamente os sacos uterinos e remover cada embrião, cortando o cordão umbilical e a remoção do saco vitelino. </li><li> Para fins de genotipagem, remova a cauda embrionária e coloque em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para a extração de lise / DNA mais tarde. </li><li> A fim de remover o coração, o pino cada embrião para fora sobre as suas costas num silicone 35 milímetros de Petri revestidas de elastómero PBS-cheia, utilizando pinos de aço inoxidável minutien. Usando uma pinça fina, carefully abrir o peito e cortar os grandes vasos, anterior ao coração. Então chegando atrás do coração com a pinça, segure os vasos por trás do coração e puxe para remover o coração; os pulmões pode também vir de distância ao mesmo tempo. </li><li> Transferir o coração para uma placa de Petri 35 milímetros fresco contendo PBS e utilizar uma pinça fina para aparar o tecido pulmonar, se necessário. Em seguida, transferir o coração a um poço de uma placa de 48 poços com PBS frio. </li><li> Depois de recolher todos os corações na placa de 48 poços, aspirar o PBS com uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina e substituir com 0,5 ml de paraformaldeído a 4% (PFA). CUIDADO: PFA é um conhecido por ser alergénicos, cancerígenos e tóxicos. <ol><li> Fix E11.5 - 12,5 corações durante 15 minutos, os corações E13.5 durante 20 min e E14.5 - 15,5 corações durante 30 min, em PFA a 4%, à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Aspirar o PFA com uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina e enxaguar os corações 2x em PBS frio. CAUTION: PFA é perigoso e deve ser eliminado de acordo com as normas institucionais. </li><li> Se não utilizar imediatamente para toda a imunocoloração de montagem (ver secção 2), desidratar os corações através da realização de sucessivas 5 min lavagens nas seguintes soluções: 25% de metanol / 75% PBS, 50% de metanol / 50% PBS, 75% de metanol / 25 % PBS. CUIDADO: O metanol é tóxico, usar luvas. Armazenar os corações a -20 ° C em metanol a 100%. </li></ol> 2. Whole Mount imunocoramento embrionárias corações com Anti-PECAM1 Antibody NOTA: Os anticorpos anti-PECAM1 funcionar bem para a coloração dos vasos coronários (ver passo 2.4), mas qualquer marcador pan-endotelial, que dá um sinal robusto seria adequado. <ol><li> Se usando corações que foram armazenados em 100% de metanol, a transferência para tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e hidratar efectuando sucessivos 5 min lavagens com as seguintes soluções: 75% de metanol / 25% de PBS, 50% de metanol / 50% de PBS e 25% metanol / 75% PBS. </li&gt; <li> Permeabilizar o coração através da realização de 3 x 10 min lavagens em 0,5-1,0 mL de PBST (PBS / 0,1% de Tween-20), em rotação à temperatura ambiente. </li><li> Bloquear os corações por rotação durante 1 hora à temperatura ambiente em soro de cabra a 1,0 ml de 10% em PBST. </li><li> Remover tampão de bloqueio com um plástico Pasteur pipeta de ponta fina ou 1.000 ul ponta da pipeta e substituir com 400 - 500 ul bloco fresco contendo o anticorpo primário anti-PECAM1 diluída 1:50. Rodar os tubos durante a noite a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, aspirar o anticorpo bloco / primária com uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina ou 1.000 ponteira ul e realizar pelo menos 6x 1 lavagens h em 1,0 ml de PBST, girando os tubos à temperatura ambiente. </li><li> Substituir a última lavagem com tampão de bloqueio fresco contendo o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo-diluído a 1: 500, e incubar durante a noite a 4 ° C, com rotação. Proteger da luz envolvendo os tubos em alumínio. </li><li> No dia seguinte, aspirar o bloco / seganticorpo secundá- com uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina e realizar pelo menos 6x 1 lavagens h em 1,0 ml de PBST, girando os tubos à temperatura ambiente. </li><li> Armazenar os corações a 4 ° C (protegido da luz) até ser necessário. </li></ol> 3. Preparação de Soluções de Compensação e pratos Microscopia NOTA: Quando imagiologia de corações em BABB é vital que nenhuma das Babb a solução entra em contacto com os componentes do microscópio. Para este efeito, o protocolo seguinte contém instruções para a preparação de pratos de silicone selado-de elastómeros adequados para a microscopia de fluorescência, que podem ser preparados com antecedência. O elastómero de silicone proporciona uma barreira para conter o BABB e impedi-la de escorrer potencialmente entre o fundo de vidro e os lados de policarbonato do prato. <ol><li> Para preparar o silicone pratos revestidos de elastómero, tomam ópticos pratos de cultura de vidro de fundo e colocar uma tampa de um frasco de 4 ml parafuso superior (cerca de 1,5 cm de diâmetro) No centro de cada prato. NOTA: Este vai formar um poço para a amostra quando o elastómero é aplicada ao prato. </li><li> Encher os pratos com elastómero de silicone a uma profundidade de aproximadamente 0,5 cm, utilizando um cartucho aplicador para misturar os dois componentes à medida que são aplicados, de acordo com as instruções dos fabricantes. Deixar a curar durante pelo menos 24 horas, certificando-se de que a tampa do frasco permanece no centro de cada prato. NOTA: Use óculos de segurança para evitar o contacto acidental do elastômero de silicone com os olhos. </li><li> Depois da cura do elastómero, remover a tampa do frasco de cada prato, isto irá deixar uma cavidade central em que a amostra a ser trabalhada pode ser colocada em contacto directo com o fundo de vidro do prato. NOTA: quando o elastómero curado deve ser firme e seca ao toque. </li><li> Preparar a solução de BABB (álcool benzílico de 1 parte a 2 partes de benzoato de benzilo). Isto deve ser armazenado num frasco de vidro e protegido da luz. CUIDADO: BABB é uma solução tóxico, corrosivo. Manusear de um exaustor enquanto vestindo vestuário de protecção adequado. </li><li> Mistura BABB e metanol para fazer uma solução 50/50 (1 - 5 ml) num frasco de vidro. Proteger da luz, por exemplo, envolvendo o frasco em folha. </li></ol> 4. Desidratação, Compensação e montagem dos corações para microscopia confocal NOTA: As amostras maior pode ser limpo em frascos de 4 ml de vidro, no entanto, para pequenas amostras (por exemplo, coração até E13.5) é melhor levar a cabo o processo de compensação directamente no prato microscopia. Isso ajuda a evitar &quot;perder&quot; as amostras como os corações se tornam muito transparente, uma vez apagada. Por essas pequenas amostras de compensação é muito rápido, ocorrendo em poucos minutos. NOTA: Proteja as amostras da luz Durante a todas as seguintes etapas envolvendo / cobrindo tubos e pratos com papel alumínio. <ol><li> Antes de limpar, desidratar os-corações imunomarcadas através de uma série de metanol girando os corações na tempe quartotura num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml em alterações sucessivas dos seguintes soluções: 25% de metanol / 75% de PBS, 50% de metanol / 50% de PBS e 75% de metanol / 25% de PBS (5 min cada). Finalmente, rodar para 3 x 5 min em 100% de metanol. </li><li> Para corações até E13.5, coloque no centro do prato de microscopia; sob o microscópio assegurar o coração está orientada com o seu lado mais superior dorsal. Remova qualquer metanol de todo o coração com uma pipeta de plástico Pasteur de ponta fina. </li><li> Usando um Pasteur de plástico pipeta de ponta fina e limpa, adicione BABB: metanol 50:50 solução num volume suficiente para mergulhar o coração (aproximadamente 300-400 mL). Como o coração às vezes pode virar na solução, verifique a orientação novamente, enquanto os corações ainda são opacos. Deixar na solução durante 5 minutos. </li><li> Remover a solução de 50:50 a um frasco de resíduos de vidro no exaustor e substituir com BABB, novamente usando uma pipeta de plástico Pasteur de ponta fina. NOTA: Um grande volume não é necessário; adicionar sufficient modo que o coração fica dentro de uma gota de solução. O coração deve limpar dentro de 5 min. </li><li> Para corações maiores, limpar as amostras em frascos de vidro. NOTA: Um coração E15.5 deve limpar dentro de 30 min-1 hr, mas pode ser deixado durante a noite, se necessário. </li><li> Depois da amostra é clara, remover a solução e substituir por um volume mínimo de BABB. Opcionalmente, cobrir a amostra com uma lamela, para ajudar a mantê-lo no lugar, no entanto, este não é absolutamente necessário. Use o coração para a imagem latente. </li></ol> 5. de imagem Cleared corações por microscopia confocal NOTA: As imagens foram capturadas em um microscópio confocal invertido usando 10X ou 20X objectivos secos. Embora seja possível utilizar os pratos num confocal na posição vertical, um cuidado especial deve ser tomado para evitar o contacto do objectivo com a solução BABB. <ol><li> Colete um z-scan do coração 15. Dependendo do tamanho do coração, uma varredura azulejo pode ser necessária para a imagem inteira do coração 16. <br/&gt; ATENÇÃO: BABB é uma solução corrosiva, usar luvas limpas e garantir o exterior do prato de microscopia é livre de BABB. Lidar com o prato com cuidado e manter a tampa no prato para minimizar o risco de derrame acidental sobre o microscópio. </li><li> Se a distância de trabalho objectivo permitir, usar uma ampliação maior para atingir imagens de alta resolução de regiões de interesse. </li></ol> 6. Análise de Dados Usando Fiji Software <ol><li> Abra a pilha z de imagens em Fiji 17. </li><li> Para fazer projeção az de toda a pilha ou parte dele, clique na imagem e selecione Stack, seguido pelo projeto Z. Digite o início e parar números fatia e selecione o tipo de z projeção, por exemplo, intensidade média, a intensidade máxima. </li><li> Para realçar os vasos individuais dentro de uma pilha de fatias de imagem usam a ferramenta de sopro (da selecione Segmentação do menu Plugins, e depois Funda / ferramenta Lasso) e clique nas áreas da imagem a ser preenchido eafatia ch. Use o comando Fill (clique em Editar, em seguida, selecione Fill) para preencher as áreas selecionadas com a cor de primeiro plano de escolha (clique em Editar, em seguida, selecione Opções, seguido de Cores e Primeiro Plano). </li><li> projeto de Z a imagem empilhar como antes. </li></ol> 7. renderização em 3D da superfície Volume de Artérias Coronárias gerado usando Imaris <ol><li> Clique no ícone Ultrapasse vista no topo da tela e arrastar e soltar o arquivo de imagem para a janela de dados. Clique no ícone 3D View, na parte superior da tela. </li><li> Selecione o ícone de superfícies (ícone azul) e, em seguida, clique na guia criar. Clique na caixa de diálogo &#39;Ir criação automática, editar manualmente &quot;e clique no ícone Draw (ícone de lápis fina). </li><li> Selecione a guia Contorno, e então na aba Modo. Em Modo, clique na varinha mágica ou ícones de isolinhas. Escolha o modo de ponteiro na seleção do ponteiro no lado direito da tela, clicando ao lado de &quot;Select&quot;, em seguida, clique no botão &quot;Desenhar9; box (no canto inferior esquerdo da tela). </li><li> Use o isolinha ou ferramenta varinha mágica para selecionar os contornos das artérias em fatias sucessivas. Navegar de fatia a fatia usando o controle deslizante Fatia posição. </li><li> Quando todos os contornos foram selecionados, clique na caixa Criar Superfície. O volume circundante pode ser tornada invisível, ou tornado mais ou menos opaca usando o modo de mistura; clique no Volume para destacá-lo e, em seguida, selecione a guia Configurações, seguido pelo separador Mode. Selecione Mistura e use o controle deslizante para alterar a opacidade. </li><li> Capturar imagens usando a função Snapshot. </li></ol>

<ol>
	<li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Klotz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+lymphatics+are+heterogeneous+in+origin+and+respond+to+injury.">Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury.</a> Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).</li><li>Nam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+veins+determine+the+pattern+of+sympathetic+innervation+in+the+developing+heart.">Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart.</a> Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).</li><li>Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+tissue+optical+clearing.">Recent progress in tissue optical clearing.</a> Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+of+morphology+and+apoptosis+in+organogenesis-stage+mouse+embryos.">Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos.</a> Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cleared+intact+biological+systems+at+a+cellular+level+by+3DISCO.">Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO.</a> J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).</li><li>Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+isolation+from+the+developing+embryonic+mouse+heart+valve+region.">Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region.</a> J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).</li><li>Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+development+using+immunofluorescence+in+embryonic+mouse+heart.">Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart.</a> J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Ivins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CXCL12/CXCR4+Axis+Plays+a+Critical+Role+in+Coronary+Artery+Development.">The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development.</a> Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).</li><li>Theveniau-Ruissy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+stem+development+in+wild-type+and+Tbx1+null+mouse+hearts.">Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts.</a> Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).</li><li>Tomanek, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+coronary+vasculature+during+development.">Formation of the coronary vasculature during development.</a> Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+formation.+De+novo+formation+of+a+distinct+coronary+vascular+population+in+neonatal+heart.">Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart.</a> Science. 345 (6192), 90-94 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

vasos coronários em corações embrionárias inteiras foram fotografadas pela imunocoloração wholemount com o anticorpo anti-PECAM1 seguido de apuramento óptica e microscopia confocal. O método simples descrito aqui, para o apuramento dos corações embrionárias de rato com BABB, aumenta a penetração óptica e permite a captura de imagens de alta resolução dos vasos sanguíneos localizados nas paredes da aorta e ventriculares. Reagentes de montagem à base de glicerol, tais como Vectashield (índice de refracção 1,45), também têm sido utilizados para imagiologia da vasculatura coronária 22, no entanto, o índice de refracção mais elevado de BABB (1,56) reduz a dispersão de luz ainda mais, permitindo uma penetração mais profunda do tecido. apuramento tecido evita a necessidade de formas mais complexas, caras de microscopia como multiphoton e microscopia folha de luz que pode ser menos prontamente disponíveis para os pesquisadores. O processo de limpeza é extremamente rápida em comparação com outros métodos de 6-9 e para pequenas amostras pode ser carried utilizando pequenos volumes de reagentes directamente sobre o prato de microscopia. robusta coloração da vascularização é necessária, a fim de obter imagens de alta qualidade; anticorpo anti-PECAM1 foi seleccionado, uma vez que todos os tipos de marca ECs coronária e um número de anticorpos comerciais foram encontrados para dar adequadamente elevados níveis de coloração. Além disso, a coloração fluorescente parece ser extremamente estáveis ​​em BABB; As amostras armazenadas à temperatura ambiente em BABB (protegida da luz) mantiveram o seu sinal de fluorescência durante vários meses. O facto de o anticorpo PECAM1 eficientemente rotula o endocárdio coronária, bem como a vasculatura foi ocasionalmente problemático, especialmente quando a captura de imagens do plexo peritruncal. coloração mais forte da luz aórtica em comparação com o ECs peritruncal resultou em um risco de excesso de saturação em algumas áreas das imagens, o que significa que foi necessário um ajuste cuidadoso dos parâmetros de imagem. Idealmente, uma única coloração com anticorpo vascular ECs seria usado; na prática,no entanto, encontrar anticorpos adequados que produzam o nível requerido de coloração wholemount pode ser difícil. Recentemente, a proteína de ligação de ácido gordo 4 (FABP4) foi demonstrado ser um marcador de células endoteliais vasculares coronárias e 23 podem, portanto, representar uma alternativa para PECAM1. A fim de manter a morfologia 3D das câmaras aorta e coração as amostras não eram flat-montados, mas em vez disso foram fotografadas em pratos com fundo de vidro. A profundidade das amostras a ser trabalhada impediu o uso de objetivos de alta ampliação, devido às suas distâncias de trabalho curtas. imagens no entanto de alta resolução ainda eram realizáveis ​​usando uma objetiva de 10X, aumentando o tempo de permanência de pixels e utilizando um tamanho de matriz de pixels de pelo menos 1.024 x 1.024 para captura de imagem. Este foi suficiente para a análise da estrutura e a distribuição dos vasos coronários, no entanto a análise fina de estrutura celular pode exigir-montagem fixa de amostras. A dissecção das peças individuais do coração para a montagem,por exemplo, paredes ventriculares, ou na aorta, também pode ser necessário. Alternativamente, a sobre-amostragem da imagem seguido pela desconvolução pode ser levada a cabo, a fim de aumentar a resolução e sensibilidade; Este, porém, requer consideravelmente mais tempo de análise e cria arquivos de imagem muito grandes que exigem uma grande quantidade de energia para processar computação. Corações até E15.5 foram fotografadas com sucesso usando este método, e é também possível analisar a vasculatura de embriões inteiros (até pelo menos E11.5) utilizando o mesmo protocolo. Outros tipos de células, por exemplo, células do músculo liso também foram visualizados no nosso laboratório usando esta técnica. Para tecidos mais grossos, por exemplo, corações mais de E15.5, a penetração do anticorpo pode ser um fator limitante; incubações mais longas e / ou aumento do detergente pode ser necessária. Além disso, quando a recolha de uma grande pilha de imagens z da intensidade do sinal pode ser reduzida como os lasers de penetrar nas porções mais distantes do tecido; No entanto, o confocal configurações podem ser ajustados para aumentar a potência do laser, com o aumento da distância Z. Este método facilita a análise microscópica confocal de ambas as primeiras fases da formação de vasos coronários e padronização das artérias coronárias em fases posteriores de desenvolvimento. Informações pormenorizadas sobre a distribuição, estrutura e ramificação de vasos sanguíneos podem ser adquiridas num curto período de tempo, tornando esta uma ferramenta valiosa para o estudo de mutantes genéticos específicos do rato com defeitos nas vias de angiogénese.

Estabelecer uma rede coronária funcionamento é crucial para a função cardíaca e desenvolvimento embrionário, e análise de mutantes genéticos do rato podem fornecer informações valiosas sobre os sinais moleculares subjacentes a este processo de desenvolvimento. A capacidade de visualizar o plexo coronárias embrionárias como um todo, em vez de apresentado de uma série de cortes histológicos, é essencial para facilitar a análise de padrões navio em mutantes genéticos, e evita a perda potencial de informação que pode ocorrer como resultado de mecânica o corte do tecido. Vasos fadado para formar artérias e capilares são localizados no fundo das paredes de ambos os ventrículos e aorta 1-3. No entanto, ao mesmo tempo marcação fluorescente de células combinadas com microscopia laser confocal de varrimento pode fornecer imagens de alta resolução dos vasos venosos superficiais wholemount marcado linfáticos / 4,5, a profundidade da imagem é limitada pela penetração óptico. imagens de alta resolução da tampaillaries artérias e ao longo de toda a profundidade do coração não é, portanto, possível, sem alguma forma de compensação de tecido. Óptico penetração pobre é causado pela alta índice de refracção do múltiplo celular e extracelular (por exemplo, o colagénio e as fibras elásticas) componentes de tecidos espessos. Isto espalha a luz de imagem, causando ofuscamento e diminuiu contraste. agentes de compensação tipicamente coincide com o índice de refracção elevado de tais tecidos, o que significa que a luz pode viajar através da amostra desobstruída e penetrar mais fundo no tecido. Antes de compensação, os tecidos são geralmente desidratado como a água tem um índice de refracção relativamente baixo. Uma pletora de novos métodos de compensação foram desenvolvidos recentemente, no entanto, dependendo da técnica utilizada, o processo de limpeza pode levar dias ou semanas e pode necessitar de reagentes dispendiosos 6-9. BABB (uma mistura 1: 2 de álcool benzílico e benzoato de benzilo) é, um agente de compensação utilizada de baixo custo, que tem ovantagem de limpar as amostras de forma extremamente rápida. Técnicas de limpeza e formação de imagens baseada-BABB foram descritos anteriormente para as amostras neurológicas e vários órgãos 10-13. Aqui nós descrevemos uma técnica robusta e direta para o apuramento BABB de amostras imunomarcadas seguido por microscopia confocal, com referência específica ao exame dos vasos sanguíneos no coração murino de E (dia embrionário) 11,5-15,5. No entanto, como também já foi demonstrado, a técnica pode ser igualmente bem aplicado para a análise de embriões inteiros, bem como outros tipos celulares, contanto anticorpos como de alta qualidade para os marcadores de interesse estão disponíveis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1544">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">PBS</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:167px;">14190-094</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Forceps</td>
			<td style="width:128px;">FST</td>
			<td style="width:167px;">11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">10cm Petri dishes</td>
			<td style="width:128px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:167px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">35mm Petri dishes</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P5112</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Stainless steel minutien pins 0.2mm diameter</td>
			<td style="width:128px;">FST</td>
			<td style="width:167px;">26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Fine tip pastettes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Alpha Laboratories</td>
			<td style="width:167px;">LW4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">1000ml pipette tips</td>
			<td style="width:128px;">Sorenson</td>
			<td align="right" style="width:167px;">34000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">48-well plate</td>
			<td style="width:128px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:167px;">353078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Kwik-Gard</td>
			<td style="width:128px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:167px;">KWIKGARD</td>
			<td>Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Kwik-Gard refill</td>
			<td style="width:128px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:167px;">KWIKGLUE</td>
			<td>Refill cartridges and dispensing tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P6148</td>
			<td>Make up in PBS and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">100% methanol</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:167px;">20847307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Tween&#174;20</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Goat serum</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse</td>
			<td style="width:128px;">BD Pharmingen</td>
			<td align="right" style="width:167px;">553370</td>
			<td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:167px;">ab28364</td>
			<td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">MA3105</td>
			<td>Primary antibody, dilute 1 in 400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal</td>
			<td style="width:128px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:167px;">sc-65495</td>
			<td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal</td>
			<td style="width:128px;">Abcam</td>
			<td style="width:167px;">ab14106</td>
			<td>Primary antibody, dilute 1 in 250</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">A11007</td>
			<td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:128px;">Abcam</td>
			<td style="width:167px;">ab173003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">A21208</td>
			<td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Phenolic screw cap</td>
			<td style="width:128px;">Wheaton</td>
			<td align="right" style="width:167px;">240408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Benzyl alcohol</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:167px;">402834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Benzyl benzoate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Imaris</td>
			<td style="width:128px;">Bitplane Imaging</td>
			<td style="width:167px;">image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Image J software</td>
			<td style="width:128px;">NIH</td>
			<td style="width:167px;">Freeware</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of coronary vessels in cleared embryonic hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

À medida que o coração se desenvolve, o miocárdio ventricular é invadido por células endoteliais (ECs) a partir de várias fontes, e um plexo vascular é formado. As embarcações que se desenvolvem dentro do miocárdio ventricular vai continuar a formar as redes capilares arteriais e entregando o sangue oxigenado para o tecido cardíaco 18. Ao mesmo tempo (cerca de E11.5) a coronária hastes começam a desenvolver-se independentemente de uma rede capilar separado (conhecido como o plexo peritruncal) que rodeia o lúmen da aorta 14,19,20. Plexo Peritruncal ECs inicialmente formar múltiplas ligações com o lúmen da aorta ao nível dos seios da válvula, porém, finalmente, apenas um vaso persistirá em cada lado da aorta, indo para formar as raízes das artérias coronárias esquerda e direita 21. De todo E13.5 o peritruncal e ventriculares vasos do miocárdio juntar-se para formar uma rede interligada, permitindo o fluxo de sangue a partir da umaorta nos vasos coronários 14,22. A coloração das células endoteliais com anti-PECAM-1 de anticorpos, associado ao esvaziamento das Babb o coração intactos, permite a análise das redes coronárias em desenvolvimento desde as primeiras fases possíveis. Nas fases posteriores de desenvolvimento, também pode ser examinada a padronização das artérias coronárias em maturação. Este método também pode ser utilizado para corar a vasculatura de embriões inteiros (E11.5 até pelo menos), e com anticorpos diferentes, por exemplo, anti-alfa actina de músculo liso (Sm22α) e Endomucin. A Figura 1 mostra o máximo de intensidade z-projeções de um coração E11.5 gerados usando software Fiji. A função Tile foi utilizado para coletar várias imagens parciais do coração e uni-las em uma imagem completa; isto é útil para dar uma visão geral de coloração em toda a amostra. Neste anticorpo estágio PECAM1 manchas principalmente o forro do endocárdio do coração e saída vessels, no entanto algumas células endoteliais pode também ser observado na parede do ventrículo esquerdo (região em caixa da Figura 1A, mostrado ampliado em 1A &#39;). Além disso, o plexo peritruncal pode ser claramente observada na parede da via de saída (OT) (região em caixa da Figura 1B). Neste último caso, a redução do número de fatias na Z-pilha utilizada para gerar a projecção melhorada a clareza da imagem, permitindo que as ligações com o lúmen da aorta para ser visualizado mais distintamente (Figura 1B &#39;). Na Figura 2, o aumento da vasculatura proximal da aorta pode ser observada em E12.5 um coração. A Figura 3 mostra o plexo peritruncal num coração E12.5. A projecção 12 Z-fatia na Figura 3A mostra todo o plexo, no entanto, como alguns vasos estão localizados ventral para o lúmen da aorta (que também é fortemente coradas por anticorpo anti-PECAM1), dividindo a pilha de Z-inpara um número de sub-pilhas (Figura 3B-D) fornece mais informação visual. Por exemplo, o sub-pilha projectada na Figura 3B mostra um navio peritruncal ligar à superfície ventral do lúmen da aorta, o que não é visível na projecção completa. A Figura 4 mostra parte de um coração E15.5; as artérias coronárias são claramente visíveis nesta fase (Figura 4A, a projecção 30 fatias). Nas projecções z 5-fatia mostrados nas Figuras 4B e C, as válvulas aórtica e pulmonar também pode ser visualizada por coloração com PECAM1; os ramos e interconexões da rede capilar coronária também são mais clara nessas projeções sub-stack menores. Técnicas de segmentação manuais foram usados para destacar as artérias coronárias utilizando Fiji (Figura 4D) ou Imaris (Figura 4D e E). A renderização de volume 3D superfície das artérias coronárias / luz aórtica gerado uImaris cante podem ser vistos com ou sem a vasculatura circundante (Figura 4E e F). A vasculatura de embriões inteiros também pode ser corado pelo PECAM1 / BABB apuramento. A Figura 4A e A &#39;, mostram projecções z gerados a partir de sub-pilhas a partir do lado direito (z fatias 11 - 65) e do lado esquerdo (z fatias 66-110) do embrião, respectivamente. A comparação das duas imagens mostra que a intensidade do sinal fluorescente não diminuiu de forma significativa com a penetração mais profunda do tecido. Na Figura 4B, PECAM1 (sinal vermelho) e Endomucin (sinal verde) anticorpos foram combinados para identificar as artérias intersomitic (ISA) e veias, respectivamente, de um embrião E11.5. A Figura 4C mostra SM22α (sinal vermelho) e coloração PECAM1 (sinal verde) das ISA em um embrião E11.5. Na Figura 6 embriões E11.5coradas com PECAM 1 foram fotografadas imediatamente após depuração BABB (Figura 4A), ou após um intervalo de cerca de dois meses (Figura 4B). O sinal fluorescente ainda era forte o suficiente para a imagem com êxito após um armazenamento prolongado da amostra em BABB. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig1.jpg" /> Figura 1. A imunocoloração de um coração E11.5 com Anti-PECAM1 Antibody (detectado com anti-IgG de rato conjugado com Alexa 594). (A, B) uma imagem de 2 x 2 de azulejos foram obtidos utilizando o objetivo 10X de um microscópio confocal invertido. PECAM1 manchas de anticorpos tanto endocárdio ea ECS vascular. As projecções (intensidade máxima) foram gerados a partir de 22 (A) ou 5 (B) z fatias cada um de espessura 4 mm, utilizando o software Fiji. A &#39;e B&#39; são ALARGAMENTTS das áreas encaixotados em A e B, respectivamente. Setas em A &#39;indicam vasos sanguíneos na parede do ventrículo; em B &#39;, o suporte indica o plexo peritruncal. OT, via de saída; VE, do ventrículo esquerdo, RV ventrículo direito. Todas as imagens são vistas frontais. As barras de escala em A e B = 200 um; barras de escala em A &#39;e B&#39; = 100 uM. Painel 1B &#39;foi adaptado de Ivins et al., 2015 19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig2.jpg" /> Figura 2. A imunocoloração de um coração E12.5 com Anti-PECAM1 anticorpo. O painel A mostra projeção az (intensidade máxima) de uma varredura 2x2 azulejos. A região encaixotado A é mostrado enlarged em A &#39;; setas indicam múltiplos vasos sanguíneos proximal à aorta (Ao). VE, do ventrículo esquerdo, RV ventrículo direito. Todas as imagens são vistas frontais. barra de escala em A = 200 mm; barra de escala em A &#39;= 100 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig3.jpg" /> Figura 3. Imagem da Peritruncal Plexus em um coração E12.5. imagens confocal de uma aorta E12.5 (Ao) coradas com anticorpo anti-PECAM1 foram recolhidos usando a objetiva de 10X. A projecção z (intensidade máxima) em A foi gerado a partir de 12 fatias z (4 mm de espessura); setas indicam os vasos do plexo peritruncal. O BD 12 fatias z foram divididos em três sub-pilhas tal como indicado e usado para gerar projecti separadaons; As setas indicam ligações formadas pelo plexo peritruncal para o lúmen da aorta. Peritruncal vasos localizados ventral para o lúmen da aorta são visíveis em B e C. Todas as imagens são vistas frontais. Barra de escala = 50 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig4.jpg" /> Figura 4. artérias coronárias e Capilar Plexus em um coração E15.5. imagens confocal de um coração E15.5 coradas com anticorpo anti-PECAM1 foram recolhidos usando a objetiva de 10X. O painel A mostra uma projecção de intensidade máxima z gerado a partir de 30 fatias z (4 mm de espessura); setas indicam as artérias coronárias esquerda e direita (LCA e RCA) que pode ser visto de ligação à aorta (Ao). usando different 5 z fatia sub-empilha as valvas aórtica e pulmonar (AOV e PV) pode ser visto na B e C, respectivamente (suportes azuis). O plexo capilar ventricular também é mais clara nessas projeções sub-stack menores; vasos sanguíneos proximais a válvula pulmonar (pequena caixa) o são mostrados ampliada no canto inferior direito do painel C (caixa grande). Fiji foi usada para realçar os vasos sanguíneos individuais, por exemplo, para o painel D a ferramenta Sopro / lasso foi usado para preencher as artérias coronárias com vermelho manualmente em cada z fatia antes da projeção. Software Imaris foi usada para criar imagens em 3D das artérias (vermelho) e luz aórtica (verde) em E e F; novamente este foi feito manualmente, utilizando a ferramenta varinha mágica para criar contornos de objetos em cada fatia z. A opacidade do volume envolvente pode ser alterada em modo de mistura, como em E. Alternativamente, a imagem 3D pode ser extraído, como mostrado na F </strong&gt;. LV, ventrículo esquerdo. Todas as imagens são vistas frontais. barra de escala em A = 100 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig5.jpg" /> Figura 5. Imagem de Embryonic Vasculature. Painéis A e mostram imagens confocais de um E10.5 tipo selvagem embrião coradas com anticorpo anti-PECAM1, recolhidos utilizando o objetivo de 10X (varredura de azulejos) A &#39;. Projecções z intensidade média foram gerados a partir de fatias z 11-65 (A) e 66-110 (A &#39;) de uma fatia de digitalização 120 Z (4 uM fatias de espessura), que mostram apenas uma ligeira perda de intensidade de fluorescência em toda a espessura do embrião . O painel B mostra os vasos intersomitic de um embrião E11.5 corados com Antibod<html> s contra PECAM1 (sinal vermelho do anticorpo secundário 594 conjugado) e Endomucin (EMCN, sinal verde do anticorpo secundário 488 conjugado), que mancham as artérias intersomitic (seta) e veias (seta), respectivamente (média de projecção intensidade z de uma telhada digitalizar). O painel C mostra artérias intersomitic (ISA) de um E11.5 tipo selvagem embrião coradas com anticorpos contra PECAM1 (sinal verde do anticorpo secundário 488 conjugado) e SM22α (sinal vermelho do anticorpo secundário 594 conjugado). imagens confocais foram coletadas usando o objetivo seca 20X e usado para gerar projeções de intensidade máxima z. Todas as imagens são vistas sagital. As barras de escala em A e B = 250 um, barra de escala em C = 100 uM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> d / 54800 / 54800fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. As amostras imunocoradas apuradas em BABB Reter fluorescente sinal durante pelo menos dois meses. embriões E11.5 foram coradas com anticorpo PECAM1 e limpou com BABB; embriões a partir do mesmo lote foram fotografadas imediatamente ou após um intervalo de dois meses. O painel A mostra as artérias intersomitic do embrião fotografada imediatamente e o painel B mostra o embrião fotografada dois meses mais tarde. imagens confocais foram coletadas usando o objetivo seca 10X e usado para gerar projeções de intensidade máxima z. Dão, aorta dorsal. Imagens mostram vistas sagital. As barras de escala em A e B = 100 uM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts at JoVE.com

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Apresenta-se um protocolo para a análise dos vasos coronários em corações inteiros de murino embrionárias até E15.5, utilizando métodos de coloração imunológicas convencionais seguido pela depuração da óptica e microscopia confocal. Esta técnica permite a visualização dos vasos sanguíneos ao longo de todo o coração, sem a necessidade de uma análise demorada de secções seriadas.

Análise de vasos coronarianos nos corações embrionárias Cancelado

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

analysis-of-coronary-vessels-in-cleared-embryonic-hearts

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K visualizações.  UCL Institute of Child Health.  Apresenta-se um protocolo para a análise dos vasos coronários em corações inteiros de murino embrionárias até E15.5, utilizando métodos de coloração imunológicas convencionais seguido pela depuração da óptica e microscopia confocal. Esta técnica permite a visualização dos vasos sanguíneos ao longo de todo o coração, sem a necessidade de uma análise demorada de secções seriadas. 

Vídeo: Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

Em larga escala Zebrafish Embryonic Coração de dissecação para a análise transcricional

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptoma Profiling de<em&gt; In-Vivo</em&gt; embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Espaciais e temporais Análise do Active ERK na<em&gt; C. elegans</em&gt; germinativa

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Capturando a resposta de lesão cardíaca de populações de células-alvo através de imagens tridimensionais do coração limpo

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Análise de vasos coronarianos nos corações embrionárias Cancelado

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo