Name: analysis of coronary vessels in cleared embryonic hearts
Uploaded: 2016-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts at JoVE.com

O trabalho foi financiado pela British Heart Foundation&#39;and apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde Centro de Investigação Biomédica no Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust e da University College London.

Toda a pesquisa animal foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais sob licença do UK Home Office. 1. Dissecção e Fixação de Embrionárias Corações <ol><li> Euthanize um rato cronometrado-grávida no dia desejado usando uma técnica de abate eticamente aprovado, por exemplo, o CO 2 narcose seguido por deslocamento cervical, e remover os sacos embrionários 14, colocando-os em uma placa de Petri 10 centímetros preenchido com tampão fosfato salino (PBS) . </li><li> Usando um microscópio de dissecção e uma pinça, abrir-se cuidadosamente os sacos uterinos e remover cada embrião, cortando o cordão umbilical e a remoção do saco vitelino. </li><li> Para fins de genotipagem, remova a cauda embrionária e coloque em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para a extração de lise / DNA mais tarde. </li><li> A fim de remover o coração, o pino cada embrião para fora sobre as suas costas num silicone 35 milímetros de Petri revestidas de elastómero PBS-cheia, utilizando pinos de aço inoxidável minutien. Usando uma pinça fina, carefully abrir o peito e cortar os grandes vasos, anterior ao coração. Então chegando atrás do coração com a pinça, segure os vasos por trás do coração e puxe para remover o coração; os pulmões pode também vir de distância ao mesmo tempo. </li><li> Transferir o coração para uma placa de Petri 35 milímetros fresco contendo PBS e utilizar uma pinça fina para aparar o tecido pulmonar, se necessário. Em seguida, transferir o coração a um poço de uma placa de 48 poços com PBS frio. </li><li> Depois de recolher todos os corações na placa de 48 poços, aspirar o PBS com uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina e substituir com 0,5 ml de paraformaldeído a 4% (PFA). CUIDADO: PFA é um conhecido por ser alergénicos, cancerígenos e tóxicos. <ol><li> Fix E11.5 - 12,5 corações durante 15 minutos, os corações E13.5 durante 20 min e E14.5 - 15,5 corações durante 30 min, em PFA a 4%, à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Aspirar o PFA com uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina e enxaguar os corações 2x em PBS frio. CAUTION: PFA é perigoso e deve ser eliminado de acordo com as normas institucionais. </li><li> Se não utilizar imediatamente para toda a imunocoloração de montagem (ver secção 2), desidratar os corações através da realização de sucessivas 5 min lavagens nas seguintes soluções: 25% de metanol / 75% PBS, 50% de metanol / 50% PBS, 75% de metanol / 25 % PBS. CUIDADO: O metanol é tóxico, usar luvas. Armazenar os corações a -20 ° C em metanol a 100%. </li></ol> 2. Whole Mount imunocoramento embrionárias corações com Anti-PECAM1 Antibody NOTA: Os anticorpos anti-PECAM1 funcionar bem para a coloração dos vasos coronários (ver passo 2.4), mas qualquer marcador pan-endotelial, que dá um sinal robusto seria adequado. <ol><li> Se usando corações que foram armazenados em 100% de metanol, a transferência para tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e hidratar efectuando sucessivos 5 min lavagens com as seguintes soluções: 75% de metanol / 25% de PBS, 50% de metanol / 50% de PBS e 25% metanol / 75% PBS. </li&gt; <li> Permeabilizar o coração através da realização de 3 x 10 min lavagens em 0,5-1,0 mL de PBST (PBS / 0,1% de Tween-20), em rotação à temperatura ambiente. </li><li> Bloquear os corações por rotação durante 1 hora à temperatura ambiente em soro de cabra a 1,0 ml de 10% em PBST. </li><li> Remover tampão de bloqueio com um plástico Pasteur pipeta de ponta fina ou 1.000 ul ponta da pipeta e substituir com 400 - 500 ul bloco fresco contendo o anticorpo primário anti-PECAM1 diluída 1:50. Rodar os tubos durante a noite a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, aspirar o anticorpo bloco / primária com uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina ou 1.000 ponteira ul e realizar pelo menos 6x 1 lavagens h em 1,0 ml de PBST, girando os tubos à temperatura ambiente. </li><li> Substituir a última lavagem com tampão de bloqueio fresco contendo o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo-diluído a 1: 500, e incubar durante a noite a 4 ° C, com rotação. Proteger da luz envolvendo os tubos em alumínio. </li><li> No dia seguinte, aspirar o bloco / seganticorpo secundá- com uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina e realizar pelo menos 6x 1 lavagens h em 1,0 ml de PBST, girando os tubos à temperatura ambiente. </li><li> Armazenar os corações a 4 ° C (protegido da luz) até ser necessário. </li></ol> 3. Preparação de Soluções de Compensação e pratos Microscopia NOTA: Quando imagiologia de corações em BABB é vital que nenhuma das Babb a solução entra em contacto com os componentes do microscópio. Para este efeito, o protocolo seguinte contém instruções para a preparação de pratos de silicone selado-de elastómeros adequados para a microscopia de fluorescência, que podem ser preparados com antecedência. O elastómero de silicone proporciona uma barreira para conter o BABB e impedi-la de escorrer potencialmente entre o fundo de vidro e os lados de policarbonato do prato. <ol><li> Para preparar o silicone pratos revestidos de elastómero, tomam ópticos pratos de cultura de vidro de fundo e colocar uma tampa de um frasco de 4 ml parafuso superior (cerca de 1,5 cm de diâmetro) No centro de cada prato. NOTA: Este vai formar um poço para a amostra quando o elastómero é aplicada ao prato. </li><li> Encher os pratos com elastómero de silicone a uma profundidade de aproximadamente 0,5 cm, utilizando um cartucho aplicador para misturar os dois componentes à medida que são aplicados, de acordo com as instruções dos fabricantes. Deixar a curar durante pelo menos 24 horas, certificando-se de que a tampa do frasco permanece no centro de cada prato. NOTA: Use óculos de segurança para evitar o contacto acidental do elastômero de silicone com os olhos. </li><li> Depois da cura do elastómero, remover a tampa do frasco de cada prato, isto irá deixar uma cavidade central em que a amostra a ser trabalhada pode ser colocada em contacto directo com o fundo de vidro do prato. NOTA: quando o elastómero curado deve ser firme e seca ao toque. </li><li> Preparar a solução de BABB (álcool benzílico de 1 parte a 2 partes de benzoato de benzilo). Isto deve ser armazenado num frasco de vidro e protegido da luz. CUIDADO: BABB é uma solução tóxico, corrosivo. Manusear de um exaustor enquanto vestindo vestuário de protecção adequado. </li><li> Mistura BABB e metanol para fazer uma solução 50/50 (1 - 5 ml) num frasco de vidro. Proteger da luz, por exemplo, envolvendo o frasco em folha. </li></ol> 4. Desidratação, Compensação e montagem dos corações para microscopia confocal NOTA: As amostras maior pode ser limpo em frascos de 4 ml de vidro, no entanto, para pequenas amostras (por exemplo, coração até E13.5) é melhor levar a cabo o processo de compensação directamente no prato microscopia. Isso ajuda a evitar &quot;perder&quot; as amostras como os corações se tornam muito transparente, uma vez apagada. Por essas pequenas amostras de compensação é muito rápido, ocorrendo em poucos minutos. NOTA: Proteja as amostras da luz Durante a todas as seguintes etapas envolvendo / cobrindo tubos e pratos com papel alumínio. <ol><li> Antes de limpar, desidratar os-corações imunomarcadas através de uma série de metanol girando os corações na tempe quartotura num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml em alterações sucessivas dos seguintes soluções: 25% de metanol / 75% de PBS, 50% de metanol / 50% de PBS e 75% de metanol / 25% de PBS (5 min cada). Finalmente, rodar para 3 x 5 min em 100% de metanol. </li><li> Para corações até E13.5, coloque no centro do prato de microscopia; sob o microscópio assegurar o coração está orientada com o seu lado mais superior dorsal. Remova qualquer metanol de todo o coração com uma pipeta de plástico Pasteur de ponta fina. </li><li> Usando um Pasteur de plástico pipeta de ponta fina e limpa, adicione BABB: metanol 50:50 solução num volume suficiente para mergulhar o coração (aproximadamente 300-400 mL). Como o coração às vezes pode virar na solução, verifique a orientação novamente, enquanto os corações ainda são opacos. Deixar na solução durante 5 minutos. </li><li> Remover a solução de 50:50 a um frasco de resíduos de vidro no exaustor e substituir com BABB, novamente usando uma pipeta de plástico Pasteur de ponta fina. NOTA: Um grande volume não é necessário; adicionar sufficient modo que o coração fica dentro de uma gota de solução. O coração deve limpar dentro de 5 min. </li><li> Para corações maiores, limpar as amostras em frascos de vidro. NOTA: Um coração E15.5 deve limpar dentro de 30 min-1 hr, mas pode ser deixado durante a noite, se necessário. </li><li> Depois da amostra é clara, remover a solução e substituir por um volume mínimo de BABB. Opcionalmente, cobrir a amostra com uma lamela, para ajudar a mantê-lo no lugar, no entanto, este não é absolutamente necessário. Use o coração para a imagem latente. </li></ol> 5. de imagem Cleared corações por microscopia confocal NOTA: As imagens foram capturadas em um microscópio confocal invertido usando 10X ou 20X objectivos secos. Embora seja possível utilizar os pratos num confocal na posição vertical, um cuidado especial deve ser tomado para evitar o contacto do objectivo com a solução BABB. <ol><li> Colete um z-scan do coração 15. Dependendo do tamanho do coração, uma varredura azulejo pode ser necessária para a imagem inteira do coração 16. <br/&gt; ATENÇÃO: BABB é uma solução corrosiva, usar luvas limpas e garantir o exterior do prato de microscopia é livre de BABB. Lidar com o prato com cuidado e manter a tampa no prato para minimizar o risco de derrame acidental sobre o microscópio. </li><li> Se a distância de trabalho objectivo permitir, usar uma ampliação maior para atingir imagens de alta resolução de regiões de interesse. </li></ol> 6. Análise de Dados Usando Fiji Software <ol><li> Abra a pilha z de imagens em Fiji 17. </li><li> Para fazer projeção az de toda a pilha ou parte dele, clique na imagem e selecione Stack, seguido pelo projeto Z. Digite o início e parar números fatia e selecione o tipo de z projeção, por exemplo, intensidade média, a intensidade máxima. </li><li> Para realçar os vasos individuais dentro de uma pilha de fatias de imagem usam a ferramenta de sopro (da selecione Segmentação do menu Plugins, e depois Funda / ferramenta Lasso) e clique nas áreas da imagem a ser preenchido eafatia ch. Use o comando Fill (clique em Editar, em seguida, selecione Fill) para preencher as áreas selecionadas com a cor de primeiro plano de escolha (clique em Editar, em seguida, selecione Opções, seguido de Cores e Primeiro Plano). </li><li> projeto de Z a imagem empilhar como antes. </li></ol> 7. renderização em 3D da superfície Volume de Artérias Coronárias gerado usando Imaris <ol><li> Clique no ícone Ultrapasse vista no topo da tela e arrastar e soltar o arquivo de imagem para a janela de dados. Clique no ícone 3D View, na parte superior da tela. </li><li> Selecione o ícone de superfícies (ícone azul) e, em seguida, clique na guia criar. Clique na caixa de diálogo &#39;Ir criação automática, editar manualmente &quot;e clique no ícone Draw (ícone de lápis fina). </li><li> Selecione a guia Contorno, e então na aba Modo. Em Modo, clique na varinha mágica ou ícones de isolinhas. Escolha o modo de ponteiro na seleção do ponteiro no lado direito da tela, clicando ao lado de &quot;Select&quot;, em seguida, clique no botão &quot;Desenhar9; box (no canto inferior esquerdo da tela). </li><li> Use o isolinha ou ferramenta varinha mágica para selecionar os contornos das artérias em fatias sucessivas. Navegar de fatia a fatia usando o controle deslizante Fatia posição. </li><li> Quando todos os contornos foram selecionados, clique na caixa Criar Superfície. O volume circundante pode ser tornada invisível, ou tornado mais ou menos opaca usando o modo de mistura; clique no Volume para destacá-lo e, em seguida, selecione a guia Configurações, seguido pelo separador Mode. Selecione Mistura e use o controle deslizante para alterar a opacidade. </li><li> Capturar imagens usando a função Snapshot. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

vasos coronários em corações embrionárias inteiras foram fotografadas pela imunocoloração wholemount com o anticorpo anti-PECAM1 seguido de apuramento óptica e microscopia confocal. O método simples descrito aqui, para o apuramento dos corações embrionárias de rato com BABB, aumenta a penetração óptica e permite a captura de imagens de alta resolução dos vasos sanguíneos localizados nas paredes da aorta e ventriculares. Reagentes de montagem à base de glicerol, tais como Vectashield (índice de refracção 1,45), também têm sido utilizados para imagiologia da vasculatura coronária 22, no entanto, o índice de refracção mais elevado de BABB (1,56) reduz a dispersão de luz ainda mais, permitindo uma penetração mais profunda do tecido. apuramento tecido evita a necessidade de formas mais complexas, caras de microscopia como multiphoton e microscopia folha de luz que pode ser menos prontamente disponíveis para os pesquisadores. O processo de limpeza é extremamente rápida em comparação com outros métodos de 6-9 e para pequenas amostras pode ser carried utilizando pequenos volumes de reagentes directamente sobre o prato de microscopia. robusta coloração da vascularização é necessária, a fim de obter imagens de alta qualidade; anticorpo anti-PECAM1 foi seleccionado, uma vez que todos os tipos de marca ECs coronária e um número de anticorpos comerciais foram encontrados para dar adequadamente elevados níveis de coloração. Além disso, a coloração fluorescente parece ser extremamente estáveis ​​em BABB; As amostras armazenadas à temperatura ambiente em BABB (protegida da luz) mantiveram o seu sinal de fluorescência durante vários meses. O facto de o anticorpo PECAM1 eficientemente rotula o endocárdio coronária, bem como a vasculatura foi ocasionalmente problemático, especialmente quando a captura de imagens do plexo peritruncal. coloração mais forte da luz aórtica em comparação com o ECs peritruncal resultou em um risco de excesso de saturação em algumas áreas das imagens, o que significa que foi necessário um ajuste cuidadoso dos parâmetros de imagem. Idealmente, uma única coloração com anticorpo vascular ECs seria usado; na prática,no entanto, encontrar anticorpos adequados que produzam o nível requerido de coloração wholemount pode ser difícil. Recentemente, a proteína de ligação de ácido gordo 4 (FABP4) foi demonstrado ser um marcador de células endoteliais vasculares coronárias e 23 podem, portanto, representar uma alternativa para PECAM1. A fim de manter a morfologia 3D das câmaras aorta e coração as amostras não eram flat-montados, mas em vez disso foram fotografadas em pratos com fundo de vidro. A profundidade das amostras a ser trabalhada impediu o uso de objetivos de alta ampliação, devido às suas distâncias de trabalho curtas. imagens no entanto de alta resolução ainda eram realizáveis ​​usando uma objetiva de 10X, aumentando o tempo de permanência de pixels e utilizando um tamanho de matriz de pixels de pelo menos 1.024 x 1.024 para captura de imagem. Este foi suficiente para a análise da estrutura e a distribuição dos vasos coronários, no entanto a análise fina de estrutura celular pode exigir-montagem fixa de amostras. A dissecção das peças individuais do coração para a montagem,por exemplo, paredes ventriculares, ou na aorta, também pode ser necessário. Alternativamente, a sobre-amostragem da imagem seguido pela desconvolução pode ser levada a cabo, a fim de aumentar a resolução e sensibilidade; Este, porém, requer consideravelmente mais tempo de análise e cria arquivos de imagem muito grandes que exigem uma grande quantidade de energia para processar computação. Corações até E15.5 foram fotografadas com sucesso usando este método, e é também possível analisar a vasculatura de embriões inteiros (até pelo menos E11.5) utilizando o mesmo protocolo. Outros tipos de células, por exemplo, células do músculo liso também foram visualizados no nosso laboratório usando esta técnica. Para tecidos mais grossos, por exemplo, corações mais de E15.5, a penetração do anticorpo pode ser um fator limitante; incubações mais longas e / ou aumento do detergente pode ser necessária. Além disso, quando a recolha de uma grande pilha de imagens z da intensidade do sinal pode ser reduzida como os lasers de penetrar nas porções mais distantes do tecido; No entanto, o confocal configurações podem ser ajustados para aumentar a potência do laser, com o aumento da distância Z. Este método facilita a análise microscópica confocal de ambas as primeiras fases da formação de vasos coronários e padronização das artérias coronárias em fases posteriores de desenvolvimento. Informações pormenorizadas sobre a distribuição, estrutura e ramificação de vasos sanguíneos podem ser adquiridas num curto período de tempo, tornando esta uma ferramenta valiosa para o estudo de mutantes genéticos específicos do rato com defeitos nas vias de angiogénese.

Estabelecer uma rede coronária funcionamento é crucial para a função cardíaca e desenvolvimento embrionário, e análise de mutantes genéticos do rato podem fornecer informações valiosas sobre os sinais moleculares subjacentes a este processo de desenvolvimento. A capacidade de visualizar o plexo coronárias embrionárias como um todo, em vez de apresentado de uma série de cortes histológicos, é essencial para facilitar a análise de padrões navio em mutantes genéticos, e evita a perda potencial de informação que pode ocorrer como resultado de mecânica o corte do tecido. Vasos fadado para formar artérias e capilares são localizados no fundo das paredes de ambos os ventrículos e aorta 1-3. No entanto, ao mesmo tempo marcação fluorescente de células combinadas com microscopia laser confocal de varrimento pode fornecer imagens de alta resolução dos vasos venosos superficiais wholemount marcado linfáticos / 4,5, a profundidade da imagem é limitada pela penetração óptico. imagens de alta resolução da tampaillaries artérias e ao longo de toda a profundidade do coração não é, portanto, possível, sem alguma forma de compensação de tecido. Óptico penetração pobre é causado pela alta índice de refracção do múltiplo celular e extracelular (por exemplo, o colagénio e as fibras elásticas) componentes de tecidos espessos. Isto espalha a luz de imagem, causando ofuscamento e diminuiu contraste. agentes de compensação tipicamente coincide com o índice de refracção elevado de tais tecidos, o que significa que a luz pode viajar através da amostra desobstruída e penetrar mais fundo no tecido. Antes de compensação, os tecidos são geralmente desidratado como a água tem um índice de refracção relativamente baixo. Uma pletora de novos métodos de compensação foram desenvolvidos recentemente, no entanto, dependendo da técnica utilizada, o processo de limpeza pode levar dias ou semanas e pode necessitar de reagentes dispendiosos 6-9. BABB (uma mistura 1: 2 de álcool benzílico e benzoato de benzilo) é, um agente de compensação utilizada de baixo custo, que tem ovantagem de limpar as amostras de forma extremamente rápida. Técnicas de limpeza e formação de imagens baseada-BABB foram descritos anteriormente para as amostras neurológicas e vários órgãos 10-13. Aqui nós descrevemos uma técnica robusta e direta para o apuramento BABB de amostras imunomarcadas seguido por microscopia confocal, com referência específica ao exame dos vasos sanguíneos no coração murino de E (dia embrionário) 11,5-15,5. No entanto, como também já foi demonstrado, a técnica pode ser igualmente bem aplicado para a análise de embriões inteiros, bem como outros tipos celulares, contanto anticorpos como de alta qualidade para os marcadores de interesse estão disponíveis.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dishes</td><td>Sigma</td><td>P5112</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter</td><td>FST</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip pastettes&amp;nbsp;</td><td>Alpha Laboratories</td><td>LW4061</td><td></td></tr><tr><td>1,000 ml pipette tips</td><td>Sorenson</td><td>34000</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Gard</td><td>World Precision Instrument</td><td>KWIKGARD</td><td>Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing</td></tr><tr><td>Kwik-Gard refill</td><td>World Precision Instrument</td><td>KWIKGLUE</td><td>Refill cartridges and dispensing tips</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Make up in PBS and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>VWR</td><td>20847307</td><td></td></tr><tr><td>Tween&amp;reg;20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA3105</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 400</td></tr><tr><td>Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-65495</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td></tr><tr><td>Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td>Primary antibody, dilute 1 in 250</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11007</td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab173003</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21208</td><td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td></tr><tr><td>Phenolic screw cap</td><td>Wheaton</td><td>240408</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane Imaging</td><td>image analysis software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Freeware</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of coronary vessels in cleared embryonic hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

À medida que o coração se desenvolve, o miocárdio ventricular é invadido por células endoteliais (ECs) a partir de várias fontes, e um plexo vascular é formado. As embarcações que se desenvolvem dentro do miocárdio ventricular vai continuar a formar as redes capilares arteriais e entregando o sangue oxigenado para o tecido cardíaco 18. Ao mesmo tempo (cerca de E11.5) a coronária hastes começam a desenvolver-se independentemente de uma rede capilar separado (conhecido como o plexo peritruncal) que rodeia o lúmen da aorta 14,19,20. Plexo Peritruncal ECs inicialmente formar múltiplas ligações com o lúmen da aorta ao nível dos seios da válvula, porém, finalmente, apenas um vaso persistirá em cada lado da aorta, indo para formar as raízes das artérias coronárias esquerda e direita 21. De todo E13.5 o peritruncal e ventriculares vasos do miocárdio juntar-se para formar uma rede interligada, permitindo o fluxo de sangue a partir da umaorta nos vasos coronários 14,22. A coloração das células endoteliais com anti-PECAM-1 de anticorpos, associado ao esvaziamento das Babb o coração intactos, permite a análise das redes coronárias em desenvolvimento desde as primeiras fases possíveis. Nas fases posteriores de desenvolvimento, também pode ser examinada a padronização das artérias coronárias em maturação. Este método também pode ser utilizado para corar a vasculatura de embriões inteiros (E11.5 até pelo menos), e com anticorpos diferentes, por exemplo, anti-alfa actina de músculo liso (Sm22α) e Endomucin. A Figura 1 mostra o máximo de intensidade z-projeções de um coração E11.5 gerados usando software Fiji. A função Tile foi utilizado para coletar várias imagens parciais do coração e uni-las em uma imagem completa; isto é útil para dar uma visão geral de coloração em toda a amostra. Neste anticorpo estágio PECAM1 manchas principalmente o forro do endocárdio do coração e saída vessels, no entanto algumas células endoteliais pode também ser observado na parede do ventrículo esquerdo (região em caixa da Figura 1A, mostrado ampliado em 1A &#39;). Além disso, o plexo peritruncal pode ser claramente observada na parede da via de saída (OT) (região em caixa da Figura 1B). Neste último caso, a redução do número de fatias na Z-pilha utilizada para gerar a projecção melhorada a clareza da imagem, permitindo que as ligações com o lúmen da aorta para ser visualizado mais distintamente (Figura 1B &#39;). Na Figura 2, o aumento da vasculatura proximal da aorta pode ser observada em E12.5 um coração. A Figura 3 mostra o plexo peritruncal num coração E12.5. A projecção 12 Z-fatia na Figura 3A mostra todo o plexo, no entanto, como alguns vasos estão localizados ventral para o lúmen da aorta (que também é fortemente coradas por anticorpo anti-PECAM1), dividindo a pilha de Z-inpara um número de sub-pilhas (Figura 3B-D) fornece mais informação visual. Por exemplo, o sub-pilha projectada na Figura 3B mostra um navio peritruncal ligar à superfície ventral do lúmen da aorta, o que não é visível na projecção completa. A Figura 4 mostra parte de um coração E15.5; as artérias coronárias são claramente visíveis nesta fase (Figura 4A, a projecção 30 fatias). Nas projecções z 5-fatia mostrados nas Figuras 4B e C, as válvulas aórtica e pulmonar também pode ser visualizada por coloração com PECAM1; os ramos e interconexões da rede capilar coronária também são mais clara nessas projeções sub-stack menores. Técnicas de segmentação manuais foram usados para destacar as artérias coronárias utilizando Fiji (Figura 4D) ou Imaris (Figura 4D e E). A renderização de volume 3D superfície das artérias coronárias / luz aórtica gerado uImaris cante podem ser vistos com ou sem a vasculatura circundante (Figura 4E e F). A vasculatura de embriões inteiros também pode ser corado pelo PECAM1 / BABB apuramento. A Figura 4A e A &#39;, mostram projecções z gerados a partir de sub-pilhas a partir do lado direito (z fatias 11 - 65) e do lado esquerdo (z fatias 66-110) do embrião, respectivamente. A comparação das duas imagens mostra que a intensidade do sinal fluorescente não diminuiu de forma significativa com a penetração mais profunda do tecido. Na Figura 4B, PECAM1 (sinal vermelho) e Endomucin (sinal verde) anticorpos foram combinados para identificar as artérias intersomitic (ISA) e veias, respectivamente, de um embrião E11.5. A Figura 4C mostra SM22α (sinal vermelho) e coloração PECAM1 (sinal verde) das ISA em um embrião E11.5. Na Figura 6 embriões E11.5coradas com PECAM 1 foram fotografadas imediatamente após depuração BABB (Figura 4A), ou após um intervalo de cerca de dois meses (Figura 4B). O sinal fluorescente ainda era forte o suficiente para a imagem com êxito após um armazenamento prolongado da amostra em BABB. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig1.jpg" /> Figura 1. A imunocoloração de um coração E11.5 com Anti-PECAM1 Antibody (detectado com anti-IgG de rato conjugado com Alexa 594). (A, B) uma imagem de 2 x 2 de azulejos foram obtidos utilizando o objetivo 10X de um microscópio confocal invertido. PECAM1 manchas de anticorpos tanto endocárdio ea ECS vascular. As projecções (intensidade máxima) foram gerados a partir de 22 (A) ou 5 (B) z fatias cada um de espessura 4 mm, utilizando o software Fiji. A &#39;e B&#39; são ALARGAMENTTS das áreas encaixotados em A e B, respectivamente. Setas em A &#39;indicam vasos sanguíneos na parede do ventrículo; em B &#39;, o suporte indica o plexo peritruncal. OT, via de saída; VE, do ventrículo esquerdo, RV ventrículo direito. Todas as imagens são vistas frontais. As barras de escala em A e B = 200 um; barras de escala em A &#39;e B&#39; = 100 uM. Painel 1B &#39;foi adaptado de Ivins et al., 2015 19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig2.jpg" /> Figura 2. A imunocoloração de um coração E12.5 com Anti-PECAM1 anticorpo. O painel A mostra projeção az (intensidade máxima) de uma varredura 2x2 azulejos. A região encaixotado A é mostrado enlarged em A &#39;; setas indicam múltiplos vasos sanguíneos proximal à aorta (Ao). VE, do ventrículo esquerdo, RV ventrículo direito. Todas as imagens são vistas frontais. barra de escala em A = 200 mm; barra de escala em A &#39;= 100 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig3.jpg" /> Figura 3. Imagem da Peritruncal Plexus em um coração E12.5. imagens confocal de uma aorta E12.5 (Ao) coradas com anticorpo anti-PECAM1 foram recolhidos usando a objetiva de 10X. A projecção z (intensidade máxima) em A foi gerado a partir de 12 fatias z (4 mm de espessura); setas indicam os vasos do plexo peritruncal. O BD 12 fatias z foram divididos em três sub-pilhas tal como indicado e usado para gerar projecti separadaons; As setas indicam ligações formadas pelo plexo peritruncal para o lúmen da aorta. Peritruncal vasos localizados ventral para o lúmen da aorta são visíveis em B e C. Todas as imagens são vistas frontais. Barra de escala = 50 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig4.jpg" /> Figura 4. artérias coronárias e Capilar Plexus em um coração E15.5. imagens confocal de um coração E15.5 coradas com anticorpo anti-PECAM1 foram recolhidos usando a objetiva de 10X. O painel A mostra uma projecção de intensidade máxima z gerado a partir de 30 fatias z (4 mm de espessura); setas indicam as artérias coronárias esquerda e direita (LCA e RCA) que pode ser visto de ligação à aorta (Ao). usando different 5 z fatia sub-empilha as valvas aórtica e pulmonar (AOV e PV) pode ser visto na B e C, respectivamente (suportes azuis). O plexo capilar ventricular também é mais clara nessas projeções sub-stack menores; vasos sanguíneos proximais a válvula pulmonar (pequena caixa) o são mostrados ampliada no canto inferior direito do painel C (caixa grande). Fiji foi usada para realçar os vasos sanguíneos individuais, por exemplo, para o painel D a ferramenta Sopro / lasso foi usado para preencher as artérias coronárias com vermelho manualmente em cada z fatia antes da projeção. Software Imaris foi usada para criar imagens em 3D das artérias (vermelho) e luz aórtica (verde) em E e F; novamente este foi feito manualmente, utilizando a ferramenta varinha mágica para criar contornos de objetos em cada fatia z. A opacidade do volume envolvente pode ser alterada em modo de mistura, como em E. Alternativamente, a imagem 3D pode ser extraído, como mostrado na F </strong&gt;. LV, ventrículo esquerdo. Todas as imagens são vistas frontais. barra de escala em A = 100 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig5.jpg" /> Figura 5. Imagem de Embryonic Vasculature. Painéis A e mostram imagens confocais de um E10.5 tipo selvagem embrião coradas com anticorpo anti-PECAM1, recolhidos utilizando o objetivo de 10X (varredura de azulejos) A &#39;. Projecções z intensidade média foram gerados a partir de fatias z 11-65 (A) e 66-110 (A &#39;) de uma fatia de digitalização 120 Z (4 uM fatias de espessura), que mostram apenas uma ligeira perda de intensidade de fluorescência em toda a espessura do embrião . O painel B mostra os vasos intersomitic de um embrião E11.5 corados com Antibod<html> s contra PECAM1 (sinal vermelho do anticorpo secundário 594 conjugado) e Endomucin (EMCN, sinal verde do anticorpo secundário 488 conjugado), que mancham as artérias intersomitic (seta) e veias (seta), respectivamente (média de projecção intensidade z de uma telhada digitalizar). O painel C mostra artérias intersomitic (ISA) de um E11.5 tipo selvagem embrião coradas com anticorpos contra PECAM1 (sinal verde do anticorpo secundário 488 conjugado) e SM22α (sinal vermelho do anticorpo secundário 594 conjugado). imagens confocais foram coletadas usando o objetivo seca 20X e usado para gerar projeções de intensidade máxima z. Todas as imagens são vistas sagital. As barras de escala em A e B = 250 um, barra de escala em C = 100 uM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> d / 54800 / 54800fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. As amostras imunocoradas apuradas em BABB Reter fluorescente sinal durante pelo menos dois meses. embriões E11.5 foram coradas com anticorpo PECAM1 e limpou com BABB; embriões a partir do mesmo lote foram fotografadas imediatamente ou após um intervalo de dois meses. O painel A mostra as artérias intersomitic do embrião fotografada imediatamente e o painel B mostra o embrião fotografada dois meses mais tarde. imagens confocais foram coletadas usando o objetivo seca 10X e usado para gerar projeções de intensidade máxima z. Dão, aorta dorsal. Imagens mostram vistas sagital. As barras de escala em A e B = 100 uM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Apresenta-se um protocolo para a análise dos vasos coronários em corações inteiros de murino embrionárias até E15.5, utilizando métodos de coloração imunológicas convencionais seguido pela depuração da óptica e microscopia confocal. Esta técnica permite a visualização dos vasos sanguíneos ao longo de todo o coração, sem a necessidade de uma análise demorada de secções seriadas.

Análise de vasos coronarianos nos corações embrionárias Cancelado

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K visualizações.  UCL Institute of Child Health.  Apresenta-se um protocolo para a análise dos vasos coronários em corações inteiros de murino embrionárias até E15.5, utilizando métodos de coloração imunológicas convencionais seguido pela depuração da óptica e microscopia confocal. Esta técnica permite a visualização dos vasos sanguíneos ao longo de todo o coração, sem a necessidade de uma análise demorada de secções seriadas. 

Vídeo: Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Um método para Etiquetagem Vascularização no embrião do rato

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Imunologia e Infecção

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Biologia do Desenvolvimento

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Usando In Vivo e tecido e célula explante abordagens para estudar a morfogênese e a patogênese da Aorta embrionária e Perinatal

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Análise do desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato usando toda montagem de epifluorescência

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes for CHD are still poorly understood. The developing mouse constitutes a valuable model for the study of CHD, because cardiac developmental programs between mice and humans are highly conserved. The protocol describes in detail how to produce mouse embryos of the desired gestational stage, methods to isolate and preserve the heart for downstream processing, quantitative methods to identify common types of CHD by histology (e.g., ventricular septal defects, atrial septal defects, patent ductus arteriosus), and quantitative histomorphometry methods to measure common muscular compaction phenotypes. These methods articulate all the steps involved in sample preparation, collection, and analysis, allowing scientists to correctly and reproducibly measure CHD.

In this protocol, we describe procedures to qualitatively and quantitatively analyze developmental phenotypes in mice associated with congenital heart defects.

Análise de defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos usando métodos histológicos qualitativos e quantitativos

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

En Face Preparação de Almofadas Endocárdicas para Análise de Morfogênese Planar em Embriões de Camundongos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe CHD died before adulthood, with the maximum mortality during the first week of life. Remarkable advances in surgical techniques, diagnostic approaches, and medical management have led to marked improvements in outcomes. To address the critical research needs of understanding congenital heart defects, murine models have provided an ideal research platform, as they have very similar heart anatomy to humans and short gestation rates. The combination of genetic engineering with high-throughput phenotyping tools has allowed for the replication and diagnosis of structural heart defects to further elucidate the molecular pathways behind CHDs. The use of noninvasive fetal echocardiography to screen the cardiac phenotypes in mouse models coupled with the high fidelity of Episcopic fluorescence image capture (EFIC) using Episcopic confocal microscopy (ECM) histopathology with three-dimensional (3D) reconstructions enables a detailed view into the anatomy of various congenital heart defects. This protocol outlines a complete workflow of these methods to obtain an accurate diagnosis of murine congenital heart defects. Applying this phenotyping protocol to model organisms will allow for accurate CHD diagnosis, yielding insights into the mechanisms of CHD. Identifying the underlying mechanisms of CHD provide opportunities for potential therapies and interventions.

This article details murine congenital heart disease (CHD) diagnostic methods using fetal echocardiography, necropsy, and Episcopic fluorescence image capture (EFIC) using Episcopic confocal microscopy (ECM) followed by three-dimensional (3D) reconstruction.

Um Pipeline para Caracterizar Defeitos Cardíacos Estruturais em Rato Fetal

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de Cultura para o Rato coração embrionário

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Análise de vasos coronarianos nos corações embrionárias Cancelado

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