Work in the Arur Lab is supported by grants from the National Institutes of Health, NIHGM98200; Cancer Prevention Research Institute of Texas, CPRIT RP160023; the American Cancer Society Research Scholar Award (ACS RSG014-044-DDC); and by the Anna Fuller Funds.

Das hier beschriebene Protokoll ist in erster Linie für die wirbellosen Modellsystem C. elegans, und folgt den ethischen Richtlinien her durch die Institution. 1. Tierpflege <ol><li> Pflegen C. elegans Arbeitsstammkulturen auf Nematode Growth Medium 20,21 (NGM, siehe Materialien Tabelle) Agar mit E. ausgesät coli OP50. </li><li> Pflegen Wurm Bestände bei Temperaturen zwischen 16 ° C und 25 ° C. HINWEIS: Würmer bei höheren Temperaturen führt zu einer schnelleren Wachstumsrate Anzucht, oft anomale Keimbahnentwicklung und niedriger Brut Größen. Zusätzlich temperaturempfindliche Genotypen werden verschiedene Phänotypen bei verschiedenen Temperaturen anzeigen. </li><li> Übertragen Sie Würmer auf neue Platten NGM alle 2 - 3 Tage in Abhängigkeit von ihrer Wachstumsrate, um eine konstante Versorgung mit gut genährten Würmern zu halten. HINWEIS: Bei jedem Experiment mit dpERK Ebenen, Würmer sollten nicht von einem verhungert oder Masse erhalten werdened Platte. Crowding oder Insulin Verhungern Auswirkungen Signalisierung in Würmern 22 und Insulin - Signal regelt ERK 12 Aktivität. So Würmer aus verhungert oder überfüllten Platten werden in variabel und schwer zu reproduzierende führen Färbungsmuster. </li></ol> 2. Dissektion der erwachsenen Würmer Gonaden zur Gewinnung von <ol><li> Pick - 100-150 WT (N2) oder gewünschten Genotyp von Würmern an der gewünschten und spezifischen Entwicklungsstufe (L1, L2, L3, L4, Erwachsene, etc.) In 100 &amp; mgr; l M9 - Puffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Füllen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 &amp; mgr; l M9 - Puffer (siehe Materialien Tabelle). Zentrifugiere die Röhrchen bei 1000 · g in einer Mikrozentrifuge für 1 min bei Raumtemperatur. </li><li> Sanft 900 ul der M9-Puffer entfernen und entsorgen. Entfernen Sie die Puffer unter einem Präpariermikroskop zu gewährleisten, dass die Würmer nicht versehentlich entfernt werden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,3 zwei weitere Male mit frischen M9 jedesmal puffern.Dadurch wird sichergestellt, dass alle Bakterien, die wurden mit den Würmern übertragen werden entfernt effektiv gewaschen. </li><li> Nach dem letzten Waschen 900 &amp; mgr; l M9-Puffer von dem Rohr und Verwerfen entfernen. </li><li> Übertragen Sie die restlichen 100 &amp; mgr; l M9-Puffer, die 100 enthält - 150 Würmer mit einem 200 &amp; mgr; l-Mikropipettenspitze zu einem flachen Boden Glas Uhr Teller. Stellen Sie sicher, dass die Mikropipettenspitze an der vor der Verwendung Marke 10 &amp; mgr; l geschnitten wird. Nicht schneiden die Spitze in Scherung der Würmer führen. </li><li> In 1-3 &amp; mgr; l von 0,1 M Levamisol auf die Glas Uhr Schale die Würmer in M9-Puffer enthält. wirbeln Sie leicht die Levamisol und die M9 sogar zu ermöglichen, Mischen, bis die Würmer bewegen zu stoppen. HINWEIS: Levamisol Bestände können bei -20 ° C zur Langzeitlagerung gelagert werden. Hier verwenden die höhere Konzentration von 1 - 3 mM als das, was in der Literatur 23 von 0,2 beschrieben worden - 0,25 mM Levamisol zu erhalten , um einen schnellen Verlust der Mobilität in den Tieren. Wenn die Tiere zu l schinden umOng in der flüssigen Suspension können die resultierenden Muster der dpERK in den Gonaden variabel sein (aufgrund von Stress oder mangelnde Ernährung oder beides). 3 mM Levamisol für die Präparation - reproduzierbarer Färbemustern mit 1 erreicht wurden. </li><li> Befestigen Sie zwei 25 G Nadeln auf zwei 1 ml-Spritzen (die Größe der Spritze spielt keine Rolle, die Lehre der Nadel kritisch ist). Positionieren Sie eine Spritze in jeder Hand (Abbildung 2). </li><li> Unter einem Binokular, positionieren Sie jede Nadel unter und über jeder Wurm , wie in Abbildung 2 und legen Sie eine Feinschnitt an der Schnecke in der Nähe des zweiten Schlund Glühbirne in einer scherenartigen Bewegung gezeigt. Nach einem Schnitt in der Schnecke auf das nächste Tier zu bewegen, bis alle Tiere in der Schale mindestens einmal geschnitten worden. HINWEIS: Denken Sie, dass 2.8 Schritte - 2.9 sind zeitempfindlich. Präparieren Sie alle Würmer in der Schale in weniger als fünf Minuten für eine reproduzierbare dpERK Muster. Längere Dissektion Zeiten wird aus der Signal dpERK in einem Wende führen, vor allem in Zein 1. Stellen Sie die Anzahl der Würmer pro Runde Dissektion (dh 50 Würmer vs. 150) bei Bedarf in der vorgegebenen Zeitrahmen zu bleiben. <ol><li> Falls ein extrudierter Gonaden ist während der Präparation nicht sichtbar, nicht versuchen, einen anderen Schnitt im gleichen Tier. Normalerweise werden, dass nur das Tier scheren und nicht in der Extrusion der Gonaden führen. Stattdessen gehen Sie zum nächsten Tier auf. Worms, wo die Gonaden nicht extrudieren, werden als solche auf den Folien angezeigt werden, die in Abschnitt gestellt werden 6 und kann während der Bildgebung ignoriert werden HINWEIS: Durch all die Dissektion und Verarbeitungsschritte ist es wichtig, im Auge zu behalten, dass die Gonaden an den Körper / Karkasse befestigt bleiben. Sie nicht die Gonaden zwingen und den Körper auseinander mit der Nadel. Oft eine aberrant Riss im Gonadengewebe in einem Versuch, die Gonade von dem Körper zu trennen, können in unechten Antikörper Signal führen. Die Körper / Karkasse während der Abbildungsschritte (Abschnitt 6), und nur die Gonaden abgebildet ignoriert werden. Zusätzlich sometimes die Darmzellen auch als interne Kontrollen / somatische Kontrollen für den Antikörper, der getestet dienen kann. </li></ol></li></ol> 3. Gonad Fixation <ol><li> Nachdem die Präparation abgeschlossen ist, fügen Sie 2 ml 3% Paraformaldehyd (PFA) direkt auf das Glas Uhr Schüssel, die die 100 &amp; mgr; l M9 und den sezierten Tiere und Deckel mit Parafilm enthält. Legen Sie die bedeckte Uhrglas in einer chemischen Abzugshaube. Achtung: PFA ist eine gefährliche Chemikalie. Somit sollte die Fixierung in der chemischen Laborabzug durchgeführt werden. </li><li> 10 min bei RT inkubiert. </li><li> Eine Einweg - 9 &quot;Pasteur - Glaspipette 3 ml 1x PBS-T hinzufügen (Werkstoff - Tabelle zu sehen) an das Uhrglas die sezierten Tiere. Mix durch die PFA - Lösung zeichnen und die 1x PBS-T mit den sezierten Tiere in das Pasteur enthält Pipette und sanft zurück in die Uhrglas freigibt. verwirbeln Sie nicht die Rohre während der Wäschen. </li><li> Mit Hilfe eines fresh Glas Pasteur Pipette die 5 ml Flüssigkeit (enthaltend seziert Würmer, PFA und 1x PBS-T) aus dem Uhrglas in die Pasteurpipette zu ziehen und den Inhalt in ein frisches 5-ml-Glas konischen Röhrchen übertragen. </li><li> Zentrifuge die konischen Röhrchen für 30 sec in einer klinischen Zentrifuge bei 1.000 x g. Verwenden Sie Glas Pasteur Pipetten und konische Röhrchen wie seziert Gonaden halten Sie sich an Kunststoff. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie den Überstand darauf zu achten, um nicht die sezierten Tiere zu stören. Entfernen Sie die Flüssigkeit nach jeder Wäsche von der konischen Röhre unter einem Binokular, um nicht die seziert Gonaden zu beeinflussen, und minimieren den Verlust. </li><li> Mit einer frischen Pasteurpipette 5 ml 1x PBS-T auf die konische Röhrchen. Zentrifuge die konischen Röhrchen in einer klinischen Zentrifuge für 30 s bei 1.000 x g. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand darauf zu achten, um nicht die sezierten Tiere zu stören. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.7 für insgesamt dreimal. </li><li> Mit einer frischen Pasteurpipette 2 mL 100%Methanol zu den Rohren, und sanft die Gonaden mit dem Methanol mischen, indem sie in der Pasteurpipette aufzustellen. Inkubieren der Röhrchen bei -20 ° C für mindestens 1 h. HINWEIS: Dissected Gonaden kann für bis zu 2 Tage für dpERK Färbung in Methanol gelagert werden. Lagerung für länger als 2 Tage und bis zu 2 Wochen ist kompatibel mit anderen Antikörperfärbung von Anwendungen, wie beispielsweise anti-Lamin-Antikörper, aber nicht mit dem Antikörper dpERK. </li><li> Nach der gewünschten Inkubationszeit wiederholen Schritt 3.7 für insgesamt drei Mal, um die Gonaden zu waschen. Sie nicht die Rohre während der Wäschen verwirbeln. Nach dem letzten Waschen 500 ul 1x PBS-T in dem konischen Rohr 5 mL verlassen. </li><li> Mit einem frischen Pasteur-Pipette, den Inhalt des konischen Glasrohr in eine frische 1-ml-Glasrohr (6 mm x 50 mm) übertragen. Lassen Sie die sezierten Tiere durch Schwerkraft absetzen 5 - 10 min. </li><li> Mit einer frischen Pasteurpipette und unter einem Binokular, entfernen Sie so viel von der Wäsche wie möglich aus dem 1 ml Glasröhrchen without Störung der sezierten Gonaden. </li></ol> 4. Sperren und primärer Antikörper-Behandlung <ol><li> Je 100 &amp; mgr; l 30% normalem Ziegenserum (NGS) , verdünnt in 1x PBS-T (siehe Materialien Tabelle) zu den sezierten Tiere in den 1 - ml - Glasröhrchen. 30% NGS dient als Blockierungspuffer. Decken das Rohr mit Parafilm Verdampfung der Flüssigkeit zu vermeiden. bei RT inkubieren 1 h oder bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Nach der gewünschten Zeit der Inkubation, entfernen Sie den Blockierungspuffer eine frische Pasteur-Pipette, die Beseitigung so viel Flüssigkeit wie möglich zu verwenden. Verwenden Sie ein Binokular, um sicherzustellen, dass Gonaden sind nicht in der Pasteurpipette erstellt. </li><li> Verdünne die MAPKYT Antikörper (siehe Materialien Tabelle, in diesem Verfahren als dpERK bezeichnet) bei 1: 400 in 30% NGS. Bereiten Sie genügend Antikörper Verdünnung zu verwenden, 100 &amp; mgr; l pro Röhrchen. Nicht verwendete, verdünnte Antikörper kann für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Geben Sie 100 ul der Antikörper anti-dpERK verdünnt, solution auf die 1 Glasröhrchen ml die sezierten Tiere enthalten. Verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm. Inkubieren der Röhrchen bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Nach Inkubation über Nacht, fügen 800 ul 1x PBST auf die Röhrchen bei RT. </li><li> Zeichnen Sie die Probe in einem frischen Glas Pasteur Pipette auf und lassen Sie sanft, um sicherzustellen, dass die Gonaden gleichmäßig in der 1x PBS-T suspendiert sind. Lassen Sie die Gonaden auf den Boden mit der Schwerkraft absetzen. Entfernen Sie den Überstand. Dies stellt sicher, dass die sezierten Gonaden gewaschen werden, aber nicht während des Verfahrens beschädigt wird. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,5-4,6 für insgesamt drei Waschungen. Sie nicht die Rohre während der Wäschen verwirbeln. Nach dem dritten Waschen sicher sein, wie viel Überstand wie möglich zu entfernen und zu entsorgen, ohne die sezierten Tiere zu stören. Stellen Sie sicher, dass eine frische Pasteur-Pipette jedes Mal verwendet wird. </li></ol> 5. Sekundäre Antikörper-Behandlung <ol><li> Während der primären Antikörper herzustellen wäscht die Verdünnung für den sekundären Antikörper. Verdünnen Sie die Anti-Maus-sedäre Antikörper bei 1: 500 in 30% NGS. Wie bei dem primären Antikörper, verwenden 100 &amp; mgr; l pro Röhrchen. Nicht verwendete Antikörper kann für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> 100 l sekundären Antikörperlösung auf die 1-ml-Glasröhrchen, die sezierten Tiere enthält. Decken Sie jedes Röhrchen mit Parafilm, und dann wickeln die Röhrchen in Aluminiumfolie, um den Inhalt des Rohrs in dunkel halten. Inkubieren der Röhrchen bei RT für 2 h oder alternativ bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Nach der gewünschten Zeit der Inkubation, fügen 800 ul 1x PBS-T mit den Rohren und wiederholen Sie die Schritte 4,5-4,6 für insgesamt dreimal. Nach dem letzten Waschen, zu entfernen und so viel von der Überstand wie möglich unter einem Präpariermikroskop mit einem frischen Pasteur pipette verwerfen. </li><li> Bereiten Sie die DAPI-Lösung während der Waschungen für den sekundären Antikörper. Verdünnen Sie 1 ul DAPI (von 1,000x Lager von 1 mg / ml bei -20 ° C gelagert) in-1 ml 1x PBST. </li><li> Hinzufügen 800 &amp; mgr; l der verdünnten DAPI-Lösung auf die Rohre enthält, dieseziert Tiere. Decken Sie den Mund des Rohrs mit Parafilm und wickeln jedes Röhrchen in Aluminiumfolie. 20 min bei RT inkubiert. </li><li> Nach der Inkubation mit DAPI, entfernen, so viel von der DAPI-Lösung wie möglich mit einer frischen Pasteurpipette unter einem Binokular, um nicht die sezierten Tiere zu stören. </li><li> 1 Tropfen Lösung auf die Rohre montieren. Wickeln Sie jedes Röhrchen in Aluminiumfolie. HINWEIS: Für die Visualisierung dpERK Färbung gefärbt Gonaden sollte sofort für die Mikroskopie montiert werden. Für andere Antikörperanwendungen wie phosphoryliertes Serin 10 Histone H3, Gonaden können in Befestigungsmedium für bis zu 2 Wochen bei 4 ° C im Dunkeln gehalten werden. </li></ol> 6. Montage von Folien und Imaging <ol><li> Eine Schicht Labor Band der Länge nach , oben, aus zwei Glasobjektträger (25 mm x 75 mm x 1 mm) , wie in Abbildung 3 zu sehen. Legen Sie eine frische , saubere Objektträger aus Glas zwischen den beiden verklebten Folien. HINWEIS: Die Dickedes Bandes hilft, eine Agarose-Pad auf dem Mittelschlitten erzeugen. Dicke der Agarose-pad ist fast gleich derjenigen des Bandes, wenn das Band als Abstandshalter dient, um ein Agarose-Pad zu schaffen. </li><li> Drop ~ 200 &amp; mgr; l 2% geschmolzener Agarose auf dem Objektträger in der Mitte (in destilliertem Wasser). Schnell legen Sie eine frische, saubere Rutsche, die senkrecht zu und auf der Oberseite, der Agarose. </li><li> Lassen Sie die Agarose solidify (1 - 2 min). </li><li> Entfernen Sie die obere Objektträger sehr sanft, so dass die Agarose-Pad nicht zerstört wird. Die Agarose-Pad kann entweder an der oberen oder unteren Schlitten befestigt bleiben. Es ist egal, welche gleiten die Agarose-Pad bleibt an, solange es sich um eine glatte Oberfläche von Agarose ist. </li><li> Unter Verwendung einer Pasteur-Pipette die sezierten Tiere auf dem Agarose-Pad übertragen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Folie mit einer Pasteurpipette unter einem Binokular mit. </li><li> Mit einem Wimpernhaar oder fein gezeichnet Kapillare, drücken Sie die Gonaden und Darm einArt und Weise voneinander, um die Gonaden aus auf der Folie zu verbreiten. </li><li> Decken Sie den Mikroskop-Objektträger mit einem 24 mm x 50 mm Größe Deckglas. Achten Sie darauf, daß die Deckplättchen sanft auf den Objektträger mit minimaler Luftblasen zwischen dem Deckglas ausgebildet ist, und dem Schlitten abgesenkt wird. </li><li> Lagerung bei 4 ° C über Nacht in einer Dia-Box (eine undurchsichtige Gleitkastens mit den Folien flach liegen, das Deckglas nach oben) um überschüssige Flüssigkeit zu verdampfen lassen und Gonaden etwas abgeflacht werden (aufgrund des Gewichts des Deckglases auf die Gonaden). Die leichte Abflachung der Gonaden ermöglicht eine bessere Bildgebung eines ansonsten runden Gonaden-Rohr. <ol><li> Sobald das Deckglas montiert ist, keinen Druck auf die Oberseite des Deckglases mit den Fingern anzuwenden. Häufig führt dies zu Verzerrungen der Gonaden und der Verlust des dpERK Signals. </li><li> Flatten die Gonaden über Nacht nur für eine effektivere Bildgebung. Die Objektträger werden bereit betrachtet werden, sobald sie zusammengebaut sind. Um sofort Bilder nehmen, sanft aufnehmendie überschüssige Flüssigkeit zwischen dem Deckglas und dem Objektträger aus den Ecken eines sauberen Labor Gewebe verwendet wird. </li></ol></li><li> Nach der über Nacht Zeit, versiegeln Sie die Folie und das Deckglas mit transparentem Nagellack Deckschicht an den vier Ecken des Deckglases und der Schiebe Grenze. Der Nagellack / Deckdichtung sorgt dafür, dass das Deckglas nicht während Bildgebung bewegt und schützt vor Zerstörung der Proben. </li><li> Bild die Gonaden mit einer Verbindung Mikroskop bei 63X. Jedoch ist die Objektivlinse und Mikroskop kann auf der Basis der Verfügbarkeit von Mikroskopen und Benutzeranwendung variiert werden. Da die Größe des gesamten Gonade von der proliferative Bereich zu den Oozyten größer ist als in einem Bild erfasst werden, werden die Bilder als Montage mit überlappenden Grenzen genommen , wie in 4 gezeigt. 11-14, 18. <ol><li> In vielen Fällen bearbeiten, um die Karkasse nach dem letzten Imaging und Montage, solange keine größeren Veränderungen der Keimbahn-Bild gemacht werden. Speicher ter Rohbilder entlang der zusammengesetzten Bildvergleich der &quot;vor&quot; Montage / Bearbeitung und &quot;nach&quot; Montage / Bearbeitung der Bilder zu ermöglichen. HINWEIS: Die Mikroskopiebilder dürfen nicht für die Signalstärke oder Sättigung bei der Montage der Montage verändert werden. </li></ol></li></ol>

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The authors declared that no competing interests exist.

Aktive ERK (dpERK) folgt eine stereotypisch räumliche und dynamische Lokalisierung Muster in C. elegans Keimbahn. Diese klischee dpERK räumliche Muster (Figur 5), und die Amplitude bei einem erwachsenen C. elegans Gonade, kann wirksam mit den vielen biologischen Prozessen in Beziehung gesetzt werden , die ERK reguliert. Zum Beispiel kann eine Unfähigkeit ERK in Zone 2 führt zu einer Verhaftung in Oozyten in der Prophase der Meiose zu aktivieren, einen Phänotyp in der weiblichen Keimbahnen beobachtet , dass Spermien nicht angeben, und somit nicht aktivieren ERK in reifen Eizellen (Abbildung 5). Paarung mit Männchen führt zu einer wirksamen Anhäufung von dpERK in Zone 2 in den weiblichen Keimbahnen 11,13, verbunden mit Beginn der Eizellreifung und Eisprung. So Analyse von räumlichen Mustern und zeitlichen Aktivierung von dpERK auf bestimmte genetische Störungen (wie RNA-Interferenz-vermittelte Gen-Inaktivierung) oder chemische Behandlungen können für die Identifizierung von Faktoren, die REGUspät ERK-Signal und damit ERK-abhängige biologische Prozesse. Solche Analysen auch Entdeckung neuer genetischer Interaktionen zwischen Signalwege aktivieren. Ein kritischer Engpass für jede Abbildungsbasierte Analyse ist die Verfügbarkeit von funktionellen Reagenzien, wie Antikörper, die für die Anwendung spezifisch sind. Wenn ein solches Reagens dann leicht für die Analyse von Lokalisierungsmuster für jedes Protein von Interesse angepasst werden kann, oben beschriebenen Verfahren, wie das eine existiert. Die Anwendung ist somit durch die Verfügbarkeit eines funktionierenden Antikörper beschränkt. Darüber hinaus, da das Verfahren Präparation und Färbung bei einer gegebenen Entwicklungszeit beschreibt, ermöglicht es nur die Erfassung von Informationen in einem Zeitrahmen, und nicht Licht in Echtzeit oder die Geschwindigkeit der Proteinumsatzes auf die Dynamik oder Proteinregulierung nicht vergießen. Das oben beschriebene Verfahren wird von Francis et al angepasst. 23, die aus dem Seydoux und Dunn m verschieden istethode 24 für gonad Extrusion und Antikörper - Färbung. Das Verfahren basiert auf Francis et al. Wird die &quot;Suspensionsverfahren&quot; und das Seydoux und Dunn Methode den &quot;einfrieren Crackverfahren&quot; zum Vergleich genannt aufgerufen werden. Das Suspensionsverfahren hat für den Erhalt reproduzierbarer Lokalisierungsmuster von Signalmolekülen in unseren Händen sehr effektiv wie dpERK, die von Natur aus empfindlicher auf harten Behandlungsbedingungen sind. Im Falle von dpERK Lokalisierung, in unserer Erfahrung ist das Signal in Zone 1 praktisch mit dem gefrierCrackVerfahren nicht nachweisbar. Zusätzlich Probentrocknung, die oft mit dem gefrierCrackVerfahren führt zu störenden Antikörper Signalen auftreten können. Die Suspension Methode minimiert Probentrocknung, da die Gonaden in Flüssigkeit während des gesamten Prozesses suspendiert sind. Wir finden auch, dass die Suspensionsverfahren zur Abbildung mehrerer verschiedener Genotypen auf einer einzelnen Folie geeignet ist. Wenn beispielsweise zwei Genotypen, wie Hermaphroditen vsWeibchen sind direkt verglichen dpERK Lokalisierung werden die beiden Genotypen zusammengemischt und verarbeitet werden können. Dies ist möglich , weil die Phänotypen unterschieden sind und über DAPI Morphologien unterscheiden. Färbung im gleichen Röhrchen, gefolgt von Abbildungs ​​auf derselben Folie ermöglicht den direkten Vergleich zwischen den Gonaden von verschiedenen Genotypen. Alternativ, wenn die DAPI Morphologien nicht unterscheidbar sind, dann ist ein Zweischritt-Antikörperfärbung kann angenommen werden. Zuerst jede einzelne Genotyp mit zwei unterschiedlichen Antikörpern, Antikörper A für WT und Antikörper B für Mutante behandelt wird (beide Antikörper müssen in einem Wirt verschieden von dem dpERK Antikörper gezüchtet werden). Sobald die beiden Genotypen wurden mit dem primären Antikörper gefärbt wurden und gewaschen, können sie zusammen in einem Röhrchen gemischt und nun mit dem dpERK Antikörper, gefolgt von einem sekundären Antikörper-Behandlung zu visualisieren alle Antikörper in dem Röhrchen gefärbt. Eine Fähigkeit, verschiedene Genotypen auf einer einzelnen Folie zu vergleichen, vor allem, wenn deductions von Aktivierungsmustern werden gewährleistet eine präzise Interpretationen vorgenommen und nicht von deutlichen Färbungsbedingungen beeinflusst. Während vorteilhaft, gibt es mehrere Schritte während des gesamten Suspensionsverfahren, die eine sorgfältige Manipulation erfordern. Es ist entscheidend, dass die Dissektion in einer zeiteffizienten Weise erfolgen; wichtiger ist, sollten die Dissektionen nicht mehr als 5 Minuten dauern. Längere Dissektion Zeiten führen zu variablen dpERK Signal, das als geregelte Änderungen in ERK-Aktivierung werden oft falsch interpretiert und nicht als technische Ausfälle. Es ist wichtig, mit mehr als 100 zu beginnen - 150 Tiere für jede Sektion, weil in den verschiedenen Waschschritte die Gonaden leicht aus den Rohren aufgrund Pipettierfehler verloren gehen kann. Der Verlust der Gonaden reduziert werden kann entweder durch in mehreren kleinen Chargen (wie drei Chargen von 50 Tieren je) seziert, die kombiniert werden können, oder durch einen großen Stapel von 150 Sezieren Eine weitere Herausforderung besteht darin, die Gonaden in einem gut voneinander zu liegen Bildungauf der Folie, so dass der gesamte distale kann Gonade abgebildet werden. Um dies zu ermöglichen, mit der Wimper auf einem Zündholz oder einem gezogenen Pipette Raum aus den Gonaden verwenden. Allerdings sollte darauf geachtet werden, um nicht die Gonaden während dieses Prozesses zu beschädigen. Oft mit diesen Techniken dauert es mehrere Versuche, die Dissektionen sowie Anordnungen der Gonaden auf die Objektträger zu meistern. Sobald diese Technik beherrscht wurde, dient es als eine leistungsfähige Methode für vielfältige biologische Analysen und verwendet werden können, mehr als nur dpERK Ebenen zu studieren. Zum Beispiel kann dieses Verfahren verwendet werden, um aktive p38-Spiegel oder aktiven CDK Ebenen visualisieren, oder jedes Protein, für das ein Antikörper-Reagenz vorhanden ist. Zusätzlich kann das Verfahren mit einem chemischen Hemmung Bildschirm in ganzen Tieren zu Assay für neue Inhibitoren oder Aktivatoren des Weges gekoppelt sein, über das Testen auf dpERK Ebenen. Dies wird für eine in vivo Auslesung beider Reaktions und Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren beliebigen ermöglichen , die int kanneract mit der RTK-RAS-ERK-Signalwegs. Darüber hinaus kann dieses Verfahren in Antikörper-Kombinationen mit mehreren Signalausgänge verwendet werden, die alle verwendet werden und zu einer Zeit sichtbar gemacht werden kann. multiple Antikörper unter Verwendung ermöglicht Korrelation zwischen mehreren Pfaden, deren Aktivierungszustand und über die Ergebnisse alle in dem gleichen Gewebe, ein besseres Verständnis dieser Wechselwirkungen ermöglicht. Dies sind nur einige Beispiele für weitere Anwendungen dieses Verfahrens, aber dieses System kann modifiziert werden, um mehrere Forschungsinteressen zu studieren.

Die Rezeptor - Tyrosinkinase (RTK) -Ratte Sarcoma (RAS) -Extracellular Signal regulierter Kinase (ERK) -Weg leitet extrazelluläre Signale durch eine konservierte Kinase - Kaskade, die in der Phosphorylierung und Aktivierung von ERK 1-3 führt. ERK - Proteine sind Mitglieder der konservierten Prolin-Serin / Threonin - MAP (Mitogen - aktivierte Protein) Kinase - Familie, und werden direkt von MEK durch duale Phosphorylierung am Threonin (T) und Tyrosin (Y) des konservierten Motivs TEY aktiviert. Aktive ERK (bezeichnet als diphosphorylierte ERK oder dpERK) regelt dann viele zelluläre und Entwicklungsprozesse durch die Phosphorylierung einer Batterie nachgeschalteter Substrate 1-3. So abnormal ERK - Aktivität führt zu vielen Zell- und Entwicklungsstörungen 4-7. Strikte Regulierung der ERK-Aktivität ist entscheidend für die normale Entwicklung: in Säugetiersystemen zu viel ERK-Aktivität führt zu einer übermäßigen Zellproliferation führendenzu onkogene Wachstum; zu wenig Aktivität führt zum Zelltod 4,6. Zusätzlich können Änderungen in der Dauer der ERK - Aktivität auch zu deutlichen Ergebnissen führen: in PC12 - Zellen, ERK - Aktivierung für 30 min oder weniger induziert Zellproliferation, aber ERK - Aktivierung für 60 min oder mehr induziert die neuronale Differenzierung 8,9. Enge Regulierung der ERK-Aktivität ist somit eindeutig wichtig für die normale Entwicklung und Homöostase. C. elegans ist ein leistungsfähiges und genetisch formbar Modellsystem die Funktion und Regulation des RTK-RAS-ERK - Signalwegs 3,10-15 zu sezieren. Relativ zu Säugersystemen, die mehrere Gene , die für RAS und ERK enthalten, C. elegans enthält ein RAS - Gen (let-60) und einem ERK - Gen (mpk - 1), ist es ein genetisch facile System , bei dem Rendern die Funktion dieses Weges 3,10-14 zu sezieren. Die C. elegans Keimbahn ist im wesentlichen ein Rohr , das von mitotischen bestehtStammzellen an seinem distalen Ende und reifen Oozyten an seinem proximalen Ende (1) , 16. Keimzellen initiieren Meiose gerade proximal zu dem distalen mitotischen Zone und schreitet voran durch eine ausgedehnte meiotischen Prophase (Pachytän), wonach sie beginnen Oozyten in dem Schleifenbereich zu bilden, schließlich erfährt Oozytenreifung im proximalen Bereich 16. Genetische Studien von mehreren Labors, einschließlich unserer eigenen, haben gezeigt , dass die RTK-RAS-ERK Weg für die Entwicklung der Keimbahn in C. wesentlich ist elegans 12,13,15,17-19. Insbesondere fanden wir , dass ERK steuert und koordiniert mindestens neun unterschiedliche biologische Prozesse bei der Entwicklung der Keimbahn, aus der Entwicklungs Schalter hin wie germ cell apoptosis biologische Prozesse wie Oozyte Wachstum 11,18 zu Zelle. Ähnlich wie in Säugersystemen zu viel ERK - Aktivität in der C. elegans - Keimbahn - Ergebnisse bei der Herstellung von mehreren kleinen Oozyten, während eine zu little Aktivität führt zu einer großen Eizelle 11. So strenge Regulierung von dpERK ist wichtig für die normale Entwicklung der Keimbahn. Die aktive Form von ERK, wie es durch einen Antikörper , der spezifisch an dpERK visualisiert, zeigt eine stereotypisch, dynamisch, bimodalen Muster Lokalisierung: dpERK ist hoch in der Zwischen pachytänen (Zone 1, Abbildung 1), niedrig im Loop - Bereich und wieder hoch in reifen Oozyten (Zone 2, Abbildung 1). Kürzlich fanden wir , dass Ernährung wirkt über die Insulin-like Growth Factor - Rezeptor-1 (daf-2) ERK in Zone 1 12 zu aktivieren; früheren Arbeiten zeigten , dass das Spermium Signal (über die Ephrin - Rezeptor - Tyrosinkinase) ERK in Zone 2 13 aktiviert. Da die aktiven ERK fungiert als Rheostat in der Keimbahn Oozyte Wachstum zu regulieren, räumliche und zeitliche Lokalisierung sowie Amplitude von dpERK, ist der Schlüssel zum Verständnis seiner normalen Signalisierungs Ergebnis. Das hier beschriebene Verfahren unter Verwendung von Änderungen in derstereotypisch Lokalisierung von dpERK werden kann leicht überwacht und Prognosen über die Auswirkungen der Umwelt- oder genetischen Störungen auf ERK-Aktivität und damit Funktion abgeleitet. Somit ermöglicht das Testen auf dpERK ein umfassendes Verständnis seiner Rolle während der Entwicklung der Keimbahn.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td style="width:255px;">Dissolve 2 g in 100 ml to make the 2% agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Flat bottom glass watch dish</td>
			<td style="width:159px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGL4161</td>
			<td style="width:255px;">We use glass, because dissected gonads often stick to plastic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">25 gauge needles</td>
			<td style="width:159px;">BD PrecisionGlide</td>
			<td style="width:119px;">305122</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Syringes (could be 1 or 5 ml)</td>
			<td style="width:159px;">BD Syringes</td>
			<td style="width:119px;">1 ml: BD 309659</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope slides (25mm x 75mm x 1.0mm)</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-343</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Coverslips (24x50mm)</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">2935-245</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">5ml glass conical tube</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">8060-5</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">9&#34; disposable Pasteur pipette</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20D</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Clinical bench top centrifuge</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glass&#160; tubes (6x50mm)</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">14-958-A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">*M9 solution</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">3% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:159px;">Electron microscopy services</td>
			<td style="width:119px;">17500</td>
			<td style="width:255px;">Obtained as 16% solutions in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">**PBS</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1X PBST</td>
			<td style="width:159px;">1X PBS with 0.1% Tween 20&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:159px;">Electron microscopy services</td>
			<td>18510</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Normal goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:159px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">5425</td>
			<td style="width:255px;">Diluted to 30% in 1x PBST</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">MAPKYT (dpERK) antibody&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Inc.</td>
			<td style="width:119px;">M9692</td>
			<td style="width:255px;">Dilution 1:400 in 30% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Secondary antibody</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11005</td>
			<td style="width:255px;">Dilution 1:500 in 30% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td style="width:159px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">*M9 Buffer Recipe</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">**PBS (1X)</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2.2H2O, 0.10 g MgCl2.6H2O, H2O to 1 litre</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 minutes. Cool, and add 1 mL of 1M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1M MgSO4 and 25 mL of 1M KPO4.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal analysis of active erk in the c. elegans germline

Das evolutionär konservierten extrazellulären Signal RTK-RAS-ERK Weg transduzierenden ist ein wichtiger Kinase-Signalkaskade , die mehrere zelluläre und Entwicklungsprozesse in erster Linie über die Aktivierung von ERK, die terminale Kinase des Weges steuert. Enge Regulierung der ERK-Aktivität ist wichtig für die normale Entwicklung und Homöostase; übermäßig aktiv ERK führt zu einem übermäßigen Zellproliferation, während Unterfunktion der ERK verursacht Zelltod. C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellsystem , das dazu beigetragen hat , die Funktion und Regulation von RTK-RAS-ERK - Signalwegs während der Entwicklung zu charakterisieren. Insbesondere ist die RTK-RAS-ERK Weg von wesentlicher Bedeutung für C. elegans - Keimbahn - Entwicklung, die im Fokus dieser Methode ist. Antikörper , die spezifisch an das aktive, diphosphorylierte Form von ERK (dpERK), der stereotypisch Lokalisierungsmuster innerhalb der Keimbahn sichtbar gemacht werden können Verwendung. Da dieses Muster ist sowohl räumlich als auch zeitlich controlled, die Fähigkeit dpERK reproduzierbar Assay ist nützlich Regler des Weges, die dpERK Signaldauer und die Amplitude und damit die Keimbahn Entwicklung beeinflussen zu identifizieren. Hier zeigen wir , wie man erfolgreich sezieren, Fleck und Bild dpERK innerhalb des C elegans Gonaden. Dieses Verfahren kann für die räumliche Lokalisierung jeder Signal oder Strukturprotein in der C angepasst werden elegans Gonaden, sofern ein Antikörper kompatibel mit Immunofluoreszenz zur Verfügung steht.

In WT erwachsenen zwittrigen Tieren wird dpERK typischerweise Mitte pachytänen Region, Zone 1, und in den meisten reifen Eizellen von -1 bis -4 oder -5 (Zone 2) sichtbar gemacht. Störungen in diesem Aktivierungsmuster spiegeln Änderungen an der Signalweg. Weibliche Keimbahnen geben keine Spermien, und somit keine Aktivierung von ERK in Zone anzuzeigen 2, mit nur schwachen Aktivierung in Zone 1. Diese vertreten sind in Abbildung 5. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig1.jpg" /> Abbildung 1: C. elegans Keimbahn - Morphologie. Differentielle Interferenzkontrast (DIC) Bild eines erwachsenen Hermaphroditen mit einem U-förmigen gonad Arm mit der weißen Linie umrissen. Der erwachsene zwittrigen Gonaden enthält mitotischen Zellen an der distalen Spitze. Die mitotische Zellen eindringen Meiose und Fortschritt durch meiotische Prophase (pachytänen) die Entwicklung in Mature Eizellen im proximalen Gonaden. Zone 1 und Zone 2 Zeichen stereotypisch Lokalisierung von dpERK bei einem Erwachsenen hermaphroditic Gonaden. Maßstab:. 20 &amp; mgr; m <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig2.jpg" /> Abbildung 2: Demonstration der Nadelpositionen bei Dissektionen . Links: Fotografie einer Dissektion Prozess. Rechts:. Nadelpositionen mit Bezug auf den Wurm <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig3.jpg" /> Abbildung 3: Demonstration von Agarose Slide Vorbereitung. (A) Legen Sie ein Band lengthwise über 2 sauberen Mikroskop-Objektträger. Legen Sie eine frische, saubere Mikroskop-Objektträger zwischen den beiden Schlitten mit dem Band, wie dargestellt. Die drei Folien sind nebeneinander in Längsrichtung . (B) in Agarose mit dem Schlitten in der Mitte aufgeschmolzen. (C) Legen Sie eine frische Mikroskop - Objektträger senkrecht zu und auf der Oberseite, der Mitte Rutsche, die Tropfen Agarose tragen. ( D) lassen Sie die Agarose zu verfestigen. (E) entfernen Sie die obere Schlitten hinter dem erstarrten Agarose - Pad zu verlassen. Verwenden Sie die untere Folie mit dem Agarose - Pad für die Montage präpariert und gefärbt Keimbahnen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig4.jpg" /> Abbildung 4: Abbilden der Folien als Montage Montage eines Wildtyp - Keimbahn mit DAPI (t.op) und dpERK (unten) Kanal. Bilder bei 63X genommen mit den Grenzen überlappen, weiße Kästen für Panel A und B und grüne Kästen für Platte B und C. Die DAPI und dpERK Bilder für jede Platte wurden gleichzeitig in zwei verschiedenen Kanälen entnommen. Das zusammengesetzte Bild wird in 5A gezeigt. Maßstabsbalken:. 20 &amp; mgr; m <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig5.jpg" /> Abbildung 5: Dynamische Temporal / Räumliche Aktivierung von ERK. (AC) WT (N2) erwachsenen Keimbahnen (24 Stunden nach Mitte L4 Stadium der Entwicklung) Zwitter gefärbt DNA (B, DAPI, weiß) und dpERK (C, rot). Das dpERK Signal in Zone 1, der pachytänen Region und Zone 2, die reifen Eizellen markiert ist . (DF)Nebel-2 (oz40) weibliche Keimbahnen (bei 8 h Vergangenheit Mitte L4 Entwicklungsstufe) gefärbt DNA (E, DAPI) und dpERK (F). Junge weibliche Keimbahn Anzeige schwach dpERK in Zone 1, und in einer einzigen Eizelle in einer Samen unabhängige Weise. Zone 2 ist Sperma abhängig und somit fehlt in der weiblichen Keimbahn. Maßstabsbalken:. 20 &amp; mgr; m <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Räumliche und zeitliche Analyse der aktiven ERK in der Keimbahn von C. elegans | Entwicklungsbiologie | Video

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Wir präsentieren ein Immunofluoreszenz Imaging-basiertes Verfahren zur räumlichen und zeitlichen Lokalisierung von aktiven ERK im seziert C. elegans Gonaden. Das hier beschriebene Protokoll kann zur Visualisierung von beliebigen Signalisierungs- oder Strukturprotein in der C angepasst werden elegans Gonaden, sofern ein geeigneter Antikörper - Reagenz zur Verfügung steht.

Räumliche und zeitliche Analyse von Active ERK in der<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

spatial-and-temporal-analysis-of-active-erk-in-the-c-elegans-germline

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Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Meiosis

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10.1K Aufrufe.  Baylor College of Medicine.  Wir präsentieren ein Immunofluoreszenz Imaging-basiertes Verfahren zur räumlichen und zeitlichen Lokalisierung von aktiven ERK im seziert C. elegans Gonaden. Das hier beschriebene Protokoll kann zur Visualisierung von beliebigen Signalisierungs- oder Strukturprotein in der C angepasst werden elegans Gonaden, sofern ein geeigneter Antikörper - Reagenz zur Verfügung steht. 

Serie: Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Zeitliche Reihenfolge der dynamischen Ausdruck von Daten aus Detaillierte Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Vorbereitung, Entwicklung von peripheren olfaktorische Gewebe für Molekulare und immunhistochemische Analysen in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

Cell Cycle Analysis in C. Elegans Keimbahn mit Thymidin-Analog-EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...