We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy &amp; Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).

Ethik-Statement: Zebrabärbling-Embryonen erzeugt wurden nach einer genehmigten IACUC Protokoll. Diese Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Georgetown University Animal Care und Use Committee durchgeführt. 1. Organisieren Embryonen für Injection und erstellen Stammlösungen <ol><li> Generieren erforderlichen Zebrabärblingembryonen zur Krebszelle Gefäßinvasion beurteilen. <ol><li> Richten Sie paarweise oder Gruppe in Cross Paarung mit Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 Fisch. HINWEIS: Wir erzeugten Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 Zebrabärbling, durch Tg Kreuzung (kdrl: grcfp) zn1 25, die in Endothelzellen grün Riffkoralle fluoreszierende Protein exprimieren, mit einer Linie , die Pigmentzellen fehlt, mitfa b692; ednrb1 b140 am Zebrabärbling international Resource - Center entwickelt. </li><li> Collect Eier, sauber und entfernen unfertilized oder deformierte Embryonen am nächsten Tag 22. </li><li> Inkubieren Embryonen bei 28,5 ° C, bis sie bereit zur Injektion mit Krebszellen, zu kommen, wenn die Genaktivität 2-Tage nach der Befruchtung (2 dpf) sind. </li></ol></li><li> Machen Injektion Platten. <ol><li> Melt 25 ml 1,5% Agarose in dH 2 O für jede Platte. </li><li> Gießen Sie 12 ml der Agarose in eine 100 mm x 15 mm Petrischale und lassen Sie es aushärten. </li><li> Re-Schmelze dann gießen Sie die verbleibenden Agarose in der Platte. </li><li> Position unmittelbar einen Schnitt Glasform (3 mm x 7,2 cm breit x 7,5 cm lang), so dass es in einem 30 Grad Winkel zur Agarose und positioniert in der Mitte der Platte ist. Hinweis: das wird eine steile 60 ° Wand und eine 30 ° geneigte Rampe erstellen. </li><li> Kleben Sie die Glasform an Ort und Stelle und lassen Sie die Agarose hart werden. </li><li> Sie vorsichtig die Glasform entfernen und darauf achten, nicht die Agarose zu reißen. HINWEIS: Formen können in dH 2 O bei 4 ° C gelagert werden. </li></ol></li><li> Äquilibrieren Injektionsplatte mit Fischwasser (0,3 g / l Meersalz). <ol><li> Rinse Platte zweimal mit destilliertem Wasser. </li><li> Äquilibrieren Platte durch Zugabe von 10 ml Fischwasser an der Platte und auf Schüttler für 10 min. </li><li> Äquilibrieren Platte ein zweites Mal mit Fischwasser. </li></ol></li><li> Split 2-Tage nach der Befruchtung (dpf) Embryonen in Injektionsgruppen , indem sie in Gerichte zu übertragen Fischwasser enthält 22. </li><li> Bereiten Sie Erholung Gerichte für jede Gruppe nach der Injektion zu verwenden. Stellen Sie sicher, dass die Erholung Schale enthält 10 ml Fischwasser plus Penicillin (25 ug / ml) und Streptomycin (50 ug / ml). </li><li> Bereiten 2x Tricaine Lösung durch Zugabe von 4 ml der gepufferten Tricaine Lager (4 mg / ml, 10 mM Tris, pH 7) und 50 ml Fisch Wasser plus Penicillin und Streptomycin. </li><li> Man löst 15 mg mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in 10 ml 2x Tricaine Lösung eine Montage Anästhetikum Medium zu erzeugen, die Live-Embryonen für die imagin immobilisieren wirdG. HINWEIS: Montagemedium besteht aus 1,5% Agarose. </li><li> Ziehen Mikroinjektionsnadeln. <ol><li> Legen Sie Glaskapillarröhren in einer vertikalen Pipette Puller. Ziehen Sie lange verjüngte Pipetten mit 20 mA Strom und eine 2-Spule Heizelement. </li></ol></li></ol> 2. Markierung Krebszellen mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoff <ol><li> Pflegen Krebszellen in ihrer empfohlenen Kulturbedingungen. ANMERKUNG: Diese Linien wurden in DMEM gehalten + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 und SK-BR-3. Diese Linien wurden in RPMI + 10% FBS: HCC 1806 und T-47D. Alle Zelllinien wurden bei 37 o C und 5% CO 2 während der Inkubation gehalten. </li><li> Generieren Sie eine Einzelzellsuspension durch eine haftende Kultur von Krebszellen distanziert. <ol><li> Waschen Sie die Zellen zuerst mit PBS und dann mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung zu behandeln. HINWEIS: Trypsin Belichtungszeit auf der Zelllinie ab. </li><li> Neutralisieren Sie die Trypsin-Lösung mit sichRum-haltigen Zellkulturmedien, nachdem die Zellen zu lösen. </li></ol></li><li> Zentrifugieren Sie die Trypsin-neutralisierten Zellsuspension für 5 Minuten bei 200 · g, dann Zellpellet in frischem Kulturmedien für die Zellzählung. </li><li> Zählen der Zellsuspension unter Verwendung eines automatischen Zählers und bereiten 1 Million Zellen in 200 ul Zellkulturmedien. <ol><li> Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit Trypanblau-Ausschluss vor der Injektion in Zebrafischembryonen. ANMERKUNG: Nur tragfähige sollten die Zellpopulationen in Zebrafischembryonen, als Injektion von toten Zellen reflektieren nicht wahr Gefäßinvasion injiziert werden. </li></ol></li><li> In 2 ul roten lipophilen Farbstoffs an die Krebszellsuspension für eine 1: 100 Verdünnung, gut mischen und brüten dann die Mischung bei 37 ° C für 20 min. HINWEIS: Die Konzentration des Farbstoffes und Kennzeichnungszeit benötigen für jede Zelllinie optimiert werden. </li><li> Nach der Inkubation mit 1 ml frischem Medium mit dem Rohr und dann 5 min zentrifugieren200 x g. </li><li> Waschen Restfluoreszenzfarbstoff aus den Krebszellen entfernt. <ol><li> Aspirat der Überstand vom Zellpellet, das Pellet in 1 ml frischem Kulturmedium und Zentrifuge für 5 Minuten bei 200 x g. </li><li> Wiederholen der Waschschritt ein zweites Mal: ​​absaugen Überstand, Zellpellet in 1 ml frischem Medium und dann wieder Zentrifuge für 5 Minuten bei 200 x g. </li><li> Wiederholen Sie den Waschschritt dritten Mal: ​​den Überstand aspirieren, Zellpellet in 1 ml frischem Medium und dann wieder Zentrifuge für 5 Minuten bei 200 x g. </li></ol></li><li> Den Überstand aspirieren und Zellpellet enthält 1 Million markierten Krebszellen in 500 &amp; mgr; l frisches Medium. HINWEIS: 0,5 mM EDTA können in den Medien zugesetzt werden, um Zell Verklumpung zu verhindern. </li></ol> 3. Injecting Krebszellen in die Pre-Herz-Sinus von Zebrafischembryonen <ol><li> Bringen Mikroinjektionsabgabesystem mit einer Druckluftquelle und schalten Sie the Mikroinjektionsquelle Abgabesystem Leistung. <ol><li> Prüfdruck durch das Fußpedal drücken. Ein kurzer Impuls der Luft sollte aus dem Nadelhalter emittieren. </li></ol></li><li> Äquilibrieren der Injektions Platten zweimal mit 2x Tricaine Lösung. <ol><li> Für jeden Equilibrierungsschritt, fügen Sie 20 ml 2x Tricaine Lösung für die Einspritzplatte und auf Schüttler für 10 min. </li></ol></li><li> Verwenden Sie Plastikpipette eine Gruppe von Embryonen in eine kleine Schüssel zu übertragen, die 2x Tricaine Lösung enthält. </li><li> Verfüllen die Mikroinjektion Injektionsnadel mit Krebszellen unter Verwendung eines Gel-Ladepipettenspitze. <ol><li> Legen Sie die Nadel in einem Elektrodenvorratsglas mit dem spitzen Ende nach unten, so Zellen in der Nähe der Spitze absetzen. </li></ol></li><li> Transfer 20 - 30 narkotisierten Embryonen mit einer Injektionsplatte durch die Embryonen mit viel 2x Tricaine in einer Plastikpipette zu sammeln. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Lassen Embryonen in der Spitze der Pipette zu begleichen. </li><li> Gently Embryonen in den Trog der Injektionsplatte zu vertreiben, um die Embryonen entlang der Länge der Rinne zu verbreiten. </li><li> Richten Embryonen mit Köpfen nach oben und Bäuche der steilen Wand des Troges gegenüber. HINWEIS: Tricaine Lösung sollte sowohl die Troglänge und die flache Agarose Oberfläche bedecken, mit Embryonen nur in der Mulde befinden. Die Embryonen sind jetzt bereit für die Injektion. </li></ol></li><li> Injizieren von 50 bis 100 Krebszellen (2 bis 5 nl) in den precardiac Sinus der Genaktivität das Mikroinjektionsabgabesystem. <ol><li> Bringen Sie die Nadel in den Nadelhalter eines Mikromanipulators. </li><li> Positionieren Sie die Injektionsplatte unter dem Stereoskop mit der 60-Grad-Wand auf der linken Seite und konzentrieren sich auf die Top-Embryo bei 25x Vergrößerung. </li><li> Positionieren Sie den Mikromanipulator, so dass, wenn verlängert, wird die Nadel auf den Embryo durchdringen. </li><li> Ziehen Sie die Nadel durch das Auge, bis es fast ist der Embryo zu berühren. </li><li> Ein Blick unter dem Mikroskop, richten die Nadel so tHut wird es den Embryo auf weitere Verlängerung durchdringen. </li><li> Pierce der Embryo durch den Dottersack Plazieren der Spitze nur an, aber nicht in die vorgeHerzHöhle. </li><li> Injizieren Sie die Zellen durch das Fußpedal drücken. Die Kraft des Injektions ausstößt, die Zellen in das Herzhöhle. Ziehen Sie die Nadel. </li><li> Mit der rechten Hand, zu erweitern und die Injektionsnadel zurückzuziehen. Mit der linken Hand, Feineinstellungen nächsten Embryo zu positionieren. </li><li> Bringen Sie die Nadel in das Gefäß Elektrode Lagerung beim Einrichten auf eine andere Platte zu injizieren. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Embryonen in die Recovery-Schale einmal die gesamte Platte eingespritzt wird. <ol><li> Kippen Sie die Einspritzplatte, die Embryonen am Boden zu bündeln, Waschen alle verbleibenden Embryonen aus dem Trog, und sie mit der Plastikpipette zu sammeln. </li><li> Lassen Sie die Embryonen in den Boden der Pipette zu begleichen. </li><li> Transfer der Embryonen auf das Rückgewinnungsschale in einem minimalen Volumen von Tricaine. </li></ol></li><li> Incubate Erholung Schale bei 28 ° C für 1 Stunde. <ol><li> Separate tragfähige Genaktivität von toten Embryonen und andere Verunreinigungen. </li></ol></li><li> Inkubieren Schale bei 33 ° C, bis sie bereit für die Wertung, in der Regel 24 bis 96 Stunden. ANMERKUNG: Diese Temperatur als Kompromiß zwischen 37 ° C die ideale Temperatur für Krebszellen bestimmt wird, und 28,5 ° C, die ideale Temperatur für Zebrabärbling. </li></ol> 4. Wertung Extravasation <ol><li> Anesthetize die Charge von Embryonen, indem sie in eine Schüssel mit Tricaine Lösung erzielt werden. </li><li> Legen Sie eine narkotisiert Larven auf eine Depression Mikroskopie Folie in einem Tropfen Tricaine. <ol><li> Orient Larven seitlich für eine optimale Abbildung der Schwanzregion. </li></ol></li><li> Zähle die Anzahl der Krebszellen, die aus dem Gefäßsystem erfolgreich eingedrungen sind von oben und unten durch den Heckbereich konzentriert klar intakten Zellen erkennen. HINWEIS: Es ist am besten mindestens zwei Personen in t beteiligt zu haben,seinen Prozess, in dem die einzelnen Fische Scoring auf der experimentellen Bedingung ist blind geprüft. <ol><li> Score Larven auf einer Verbindung Fluoreszenzmikroskop mit dem 10x-Objektiv. Verwenden Sie das 20x-Objektiv für alle schwierig Anrufe. </li></ol></li></ol> 5. Montage Embryonen auf Folien und anschließende Fluorescence Imaging <ol><li> Schmelze 1,5% Agarose / Tricaine Lösung und bringen auf 37 ° C. </li><li> Anesthetize den Embryo, indem Sie es in Tricaine Lösung abgebildet werden. </li><li> Transfer des Embryos in einem Tropfen Tricaine Lösung auf die Abbildungsfläche. verwenden Sie wahlweise eine Glasbodenschale oder Mikroskop-Objektträger. </li><li> Verwenden einer Glaspipette das überschüssige Tricaine Lösung, Halten der Embryo auf der Abbildungsfläche zu entfernen. </li><li> Overlay ein Tropfen geschmolzenen Agarose-Lösung über den Embryo. </li><li> Schnell, bevor die Agarose polymerisieren, verwenden Sie ein empfindliches Werkzeug, wie ein Wimpernbürste, um den Embryo seitlich zur Bildgebung zu orientieren, besonders vorsichtig zu gebenden Embryo zu gewährleisten ist entlang der Abbildungsfläche abgeflacht. </li><li> Tauchen Sie die jetzt polymerisiert Agarose Tropfen unter Tricaine Lösung. </li><li> Thema der Live-Zebrafischembryo auf mikroskopische Bildgebung. </li></ol> 6. Änderung: Die Einspeisung von Krebszellen in den Dottersack von Zebrafischembryonen <ol><li> Herstellung der Mikroinjektionsabgabesystem und die Einspritzplatten, wie zuvor in Abschnitt (3) dieses Protokolls. </li><li> Etikett zwei Zellpopulationen mit kontrasFluoreszenzFarbstoffen, wie vorstehend in Abschnitt (2) dieses Protokolls. </li><li> Injizieren von 5 bis 10 nl von 2 x 10 ^ 7 Zellen / ml in den Dottersack. Halten Sie das Injektionsvolumen konstant gleiche Zellzahlen zu injizieren (100-200 Krebszellen) aus jeder Zellpopulation HINWEIS: Eine transparente Genaktivität verwenden können fluoreszierende Gefäße für diesen Test fehlt. Passive Eindringen von Partikeln in das Gefäßsystem kann für Perlen durch Injizieren fluoreszierendes gesteuert werden (&lt;10 um) oder verändernnativ, eine Zelllinie, die nicht intravsate. </li><li> Recover die injizierten Embryonen, wie zuvor in Abschnitt (3) dieses Protokolls und dann Screening für eine erfolgreiche Injektionen. <ol><li> Verwenden Sie ein Stereoskop zu screenen und tragfähige Embryonen übertragen, die erfolgreich auf eine neue Schale injiziert wurden. HINWEIS: Alle Embryonen eine gleich bleibend bemessen Masse von Zellen in dem Eigelb entfernt haben sollte. Die Embryonen werden verworfen, wenn die Masse Größe unterscheidet, oder wenn alle Zellen außerhalb des Eigelbs befinden. </li><li> Übertragen Sie die tragfähige Embryonen auf ein neues Gericht, wenn Krebszellen in den Dottersack deutlich zu erkennen. </li></ol></li><li> Inkubieren Schale bei 33 ° C, bis sie bereit für die Wertung, in der Regel 24 bis 48 Stunden. ANMERKUNG: Diese Temperatur als Kompromiß zwischen 37 ° C die ideale Temperatur für Krebszellen bestimmt wird, und 28,5 ° C, die ideale Temperatur für Zebrabärbling. </li><li> Um zu punkten intravasation, befolgen Sie die im Abschnitt Richtlinien (4) dieses Protokoll, sondern die Anzahl der c zählenancer Zellen, die in das Gefäßsystem des kaudalen Region erfolgreich eingedrungen sind. </li></ol>

<ol><li>Cummings, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+progression+of+breast+cancer%3A+insights+from+50+years+of+autopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Path%22%5BJournal%5D)">Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies.</a> Am J Path. 232, 23-31 (2014).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+endothelial+barrier+during+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Crossing the endothelial barrier during metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).</li>
<li>Rahim, S., Üren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+electrical+impedance+based+technique+to+measure+invasion+of+endothelial+cell+monolayer+by+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li>
<li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li>
<li>Mohanty, S., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis assay.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> J Vis Exp. (64), e4260(2012).</li>
<li>Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+experimental+metastasis+to+bone+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow.</a> Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+organ-specific+metastatic+potential+of+individual+breast+cancer+cells+and+primary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors.</a> J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).</li>
<li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).</li>
<li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> J Vis Exp. (91), e51677(2014).</li>
<li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).</li>
<li>Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+the+blood-brain+barrier+in+experimental+metastatic+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors.</a> J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).</li>
<li>Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+cancer+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a cancer model system.</a> Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).</li>
<li>Feitsma, H., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a cancer model.</a> Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).</li>
<li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+of+the+day%3A+zebrafish+as+a+human+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).</li>
<li>Stoletov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+extravasation+dynamics+of+metastatic+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells.</a> J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).</li>
<li>Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-initiated+extravasation+of+cancer+cells+visualized+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish.</a> PeerJ. , (2014).</li>
<li>Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+human+cancer+cell+metastasis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish.</a> BMC Cancer. 13 (453), (2013).</li>
<li>Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+angiogenesis+drugs+in+a+live+fluorescent+zebrafish+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscl+Throm+Vas%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay.</a> Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).</li>
<li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).</li>
<li>Novoa, B., Figueras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+model+for+the+study+of+inflammation+and+the+innate+immune+response+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).</li>
<li>Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+promotion+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell promotion of metastasis.</a> Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li>
<li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+signaling+between+human+CXCR4+and+zebrafish+ligands+by+the+small+molecule+IT1t+impairs+the+formation+of+triple-negative+breast+cancer+early+metastases+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).</li>
<li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Berens, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin-associated+protein+5-5+controls+cytoskeletal+function+and+cancer+cell+vascular+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion.</a> Oncogene. , Epub ahead of print (2016).</li>
</ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Diese Technik nutzt die Zebrabärbling Modell zur effizienten Steuerung des Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen zu testen (siehe Abbildung 1). Hier verwendeten wir die Technik zu einer Gruppe von Brustkrebszelllinien , um eine Basislinie zu schaffen , auf die andere Forscher können dann ihre eigenen Studien bauen (siehe Tabelle 1; Figuren 2 - 3). Die Beobachtung, dass MDA-MB-231-Zellen leicht in die Schwanzregion Genaktivität fallen würde diese Zelllinie idea...

Metastatische Erkrankung ist eine Hauptursache der Krebssterblichkeit und viele Mechanismen, die Krebszelle ermöglichen Verbreitung bleiben bis 1 entdeckt werden. Um für eine Krebszelle, um erfolgreich zu metastasieren, muss er zunächst durch das Stroma eindringen, die eine primäre Tumor umgibt, geben Sie (intravasate) in das Kreislaufsystem, überleben auf der Durchreise, Ausfahrt (extravasate) aus dem Kreislauf und schließlich eine tragfähige Kolonie gründen am entfernten Organstelle 2. Intravasation und Extravasation sind somit entscheidende Schritte in der metastatischen Kaskade, doch jeder Krebszelle ist nicht von Natur geschickt darin zu stören und die Migration durch endotheliale Kreuzungen 3. In der Tat gibt es eine Reihe von einzigartigen Selektionsdruck , die Krebszellen vaskuläre Invasion und der Prozess umgeben kann weiterhin durch eine Vielzahl von endogenen und exogenen Faktoren 4 beeinflusst werden. Aus diesen Gründen Techniken, die das aggressive Verhalten von fortgeschrittenen Stadium Krebs Sonde konzentrieren sich häufig auf vascular invasive Fähigkeit als Mittel Metastasierung zu prognostizieren. Verschiedene Modellsysteme existieren , um die Untersuchung von Krebszellen Gefäßinvasion in vitro zu erleichtern. Die am häufigsten verwendete in vitro Assays beinhalten entweder Transwell - Systemen Krebszellmigration durch eine endotheliale Schranke 5 oder Elektro Zell-Substrat - Impedance Sensing (ECIS) Technologie zur Überwachung des Echtzeit - Unterbrechung einer intakten endothelialen Monoschicht durch Krebszellen 6 zu bewerten. Diese Tests fehlt typischerweise die Fluiddynamik und Stroma-Faktoren, die sonst Krebszellbindung an eine Endothelwand auswirken würde. Dieses Problem wird etwas von perfundierbaren Gefäßnetze umgangen , die aus dem 3D - Kultur von Endothel entstehen mit Stromazellen zu unterstützen und diese 3D - Mikrofluidik - Systeme nun die Spitze der aktuellen In - vitro - Optionen 7,8 darstellen. Dennoch auslassen diese Ansätze die robuste Mikro eines funktionellen Kreislaufsystemund daher nur teilweise Ersatz für die in vivo - Modellen. Die am häufigsten in - vivo - Modell von Gefäßinvasion verwendet wird , ist die Maus, bei der experimentellen Metastasierung Assays häufig durchgeführt werden , weil sie auf relativ kurze Zeiträume und sind in der Regel bezeichnend für Metastasierungsfähigkeit 9 auftreten. Diese Tests umfassen die direkte Injektion von Krebszellen in den Verkehr und damit die Endstadien der Metastasierung zu modellieren, nämlich Extravasation und Krebszellbesiedelung von Organen. Die experimentellen Metastasierung Assays unterscheiden sich an der Stelle der Krebszellinjektion basiert und die Organe schließlich analysiert. Im ersten Assay - Typ, Krebszellen in die Schwanzvene von Mäusen und Krebszellaussaat in der Lunge injiziert werden , wird 10,11 überwacht. Der zweite Test beinhaltet die Durchführung intrakardiale Injektionen metastatic seeding in Richtung auf die Knochenmikro 12-14, sondern auch das Gehirn 15 zu lenken. In dem dritten Test, Krebs cells werden in die Milz injiziert , um Besiedlung der Leber 16 zu ermöglichen , während die vierte Lieferroute in die Arteria carotis Krebszellen zum Gehirn 17,18 trägt. Unabhängig von der Krebszelle Liefermethode, Organ Kolonisation ist die akzeptierte experimentellen Endpunkt und wird in der Regel über Lumineszenz, Histologie bestimmt, oder PCR-basierte Techniken. Trotz der physiologischen Vorteile von innerhalb eines murinen Wirt experimentellen Metastasierung Assays Durchführung dieser Experimente erfordern noch Wochen bis Monate abzuschließen und zu analysieren. Der Zebrafisch (Danio rerio) -Modell hat sich kürzlich als neuer Systemkrebsprogression 19,20, zu untersuchen und ermöglicht die Beurteilung von Krebszellen vaskuläre Invasion innerhalb eines Funktionskreislauf über einen viel kürzeren Zeitskala als bei Mäusen im Vergleich 21-24. Das Verfahren nutzt einen transparenten Zebrabärbling-Stamm, der seine Endothel mit einem grünen Riffkoralle Fluo markiertrescent Protein Reporter durch die kdrl Promotor, der Zebrabärbling Rezeptor für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor 25 angetrieben. In dem Test werden die Krebszellen mit einem roten fluoreszierenden Marker markiert und in den precardiac Sinus von 2 Tage alten Embryonen injiziert. Irgendwo zwischen 48 bis 96 Stunden nach der Injektion von Krebszellen, die aus dem Gefäßsystem und in die Schwanzvene Region von Embryonen eingedrungen sind effizient auf einem Fluoreszenzmikroskop erzielt. Hier wir die Technik zu einer Gruppe von üblicherweise verwendeten humanen Brustkrebszelllinien gelten für stark Unterschiede in ihrer Gefäß invasive Fähigkeit demonstrieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass für den Embryo yolk sac die Injektionsstelle zu ändern für die Untersuchung der heterogenen Zell-Interaktionen ermöglicht, als Krebszellpopulationen differentiell mit Fluoreszenzfarbstoffen und injiziert in Zebrabärbling-Embryonen fehlt Fluoreszenz Vaskulatur markiert werden. In diesem letzteren Test, Krebszellen, die das Eigelb eingedrungen sind und intravasated in die vasculature werden im kaudalen Bereich von 24 bis 48 Stunden nach der Injektion erzielt. Aufgrund der Effektivität und Komfort dieses Modells sind Zebrabärbling zunehmend die Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen unter einer physiologischen Umgebung, um schnell zu testen eingesetzt.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Dishes</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4&quot; Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-60</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Low Melting</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Molecular Grade</td><td>Bioline</td><td>BIO-41026</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4&quot;</td><td>A-M Systems, Inc</td><td>627000</td><td></td></tr><tr><td>David Kopf 700C Vertical Pipette Puller</td><td>Hofstra Group</td><td>3600</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Storage Jar, 1.0 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222)</td><td>Fluka</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Eyelash Brush</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Transfer Pipettes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Pipet Tips</td><td>Fisher Brand</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Dishes (12.0 mm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>Glass Depression Slide</td><td>VWR</td><td>470005-634</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt, Sea Salt</td><td>Pentair</td><td>IS50</td><td></td></tr><tr><td>Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS20622B</td><td></td></tr><tr><td>SP8 Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E600</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-G Potassium</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP914-100</td><td></td></tr><tr><td>Petri Plates, 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Brand</td><td>&amp;nbsp;FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer II</td><td>General Valve Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish&amp;nbsp;</td><td>Georgetown Zebrafish Shared Resources</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

testing the vascular invasive ability of cancer cells in zebrafish (danio rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Hier testeten wir die vaskuläre invasive Fähigkeit von häufig verwendeten Brustkrebszelllinien in einem Zebrafischembryo - Modell (Abbildung 1). Rigorose Kriterien wurden in Scoring-Extravasation für diese verschiedenen Zelllinien eingesetzt werden, wo positive Ereignisse nur dann, wenn die Krebszellen gezählt wurden deutlich extravasierten hatte, dieses Wesen hauptsächlich getan keine Falsch-Positiven zu begrenzen, die von Scoring Zelltrümmer entstehen könnten. ...

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Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

Dieses Verfahren nutzt Zebrabärblingembryonen effizient die Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen zu testen. Fluoreszierende Krebszellen werden in den precardiac Sinus oder Dottersack von sich entwickelnden Embryonen injiziert. Krebszelle Gefäßinvasion und Extravasation wird über Fluoreszenzmikroskopie des Heckbereich 24 bis 96 Stunden später bewertet.

Testen des Vascular Invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrabärbling (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

testing-vascular-invasive-ability-cancer-cells-zebrafish-danio

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

12.0K Aufrufe.  Georgetown University.  Dieses Verfahren nutzt Zebrabärblingembryonen effizient die Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen zu testen. Fluoreszierende Krebszellen werden in den precardiac Sinus oder Dottersack von sich entwickelnden Embryonen injiziert. Krebszelle Gefäßinvasion und Extravasation wird über Fluoreszenzmikroskopie des Heckbereich 24 bis 96 Stunden später bewertet. 

Serie: Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Mosaic Zebrafisch Transgenese für Funktionelle Genomanalyse Candidate Cooperative Gene in Tumor Pathogenese

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Krebsforschung

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

Transplantation von Zebrafisch-pädiatrischen Hirntumoren in immune-kompetente Wirte für die Langzeitstudie von Tumorzellverhalten und Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A zebrafish xenograft is created by implanting mammalian tumor cells into the perivitelline space of two days-post-fertilization zebrafish embryos, followed by measuring the extent of the angiogenic response observed at an experimental endpoint up to two days post-implantation. The key advantage to this method is the ability to accurately quantitate the zebrafish host angiogenic response to the graft. This enables detailed examination of the molecular mechanisms as well as the host vs tumor contribution to the angiogenic response. The xenografted embryos can be subjected to a variety of treatments, such as incubation with potential anti-angiogenesis drugs, in order to investigate strategies to inhibit tumor angiogenesis. The angiogenic response can also be live-imaged in order to examine more dynamic cellular processes. The relatively undemanding experimental technique, cheap maintenance costs of zebrafish and short experimental timeline make this model especially useful for the development of strategies to manipulate tumor angiogenesis.

The aim of this method is to generate an in vivo model of tumor angiogenesis by xenografting mammalian tumor cells into a zebrafish embryo that has fluorescently-labelled blood vessels. By imaging the xenograft and associated vessels, a quantitative measurement of the angiogenic response can be obtained.

In Vivo Bildgebung und Quantifizierung der Angiogenreaktion des Wirts bei Zebrafischtumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Medizin

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal models are required for bridging the nanotechnology to its biomedical application. The mouse represents the traditional animal model for preclinical testing; however, mice are relatively expensive to keep and have long experimental cycles due to the limited progeny from each mother. The zebrafish has emerged as a powerful model system for developmental and biomedical research, including cancer research. In particular, due to its optical transparency and rapid development, zebrafish embryos are well suited for real-time in vivo monitoring of the behavior of cancer cells and their interactions with their microenvironment. This method was developed to sequentially introduce human cancer cells and functionalized nanoparticles in transparent Casper zebrafish embryos and monitor in vivo recognition and targeting of the cancer cells by nanoparticles in real time. This optimized protocol shows that fluorescently labeled nanoparticles, which are functionalized with folate groups, can specifically recognize and target metastatic human cervical epithelial cancer cells labeled with a different fluorochrome. The recognition and targeting process can occur as early as 30 min postinjection of the nanoparticles tested. The whole experiment only requires the breeding of a few pairs of adult fish and takes less than 4 days to complete. Moreover, zebrafish embryos lack a functional adaptive immune system, allowing the engraftment of a wide range of human cancer cells. Hence, the utility of the protocol described here enables the testing of nanoparticles on various types of human cancer cells, facilitating the selection of optimal nanoparticles in each specific cancer context for future testing in mammals and the clinic.

Described here is a method for utilizing zebrafish embryos to study the ability of functionalized nanoparticles to target human cancer cells in vivo. This method allows for the evaluation and selection of optimal nanoparticles for future testing in large animals and in clinical trials.

In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Verwendung von Zebrafischlarven für effiziente In-vivo-Tumorstudien

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung von Krebstherapeutika mit Tumor-Xenotransplantation im Zebrafisch

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Testen des Vascular Invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrabärbling (

Zusammenfassung

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Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen