We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy &amp; Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).

윤리 정책 : 승인 된 IACUC 프로토콜에 따라 Zebrafish의 배아를 생성 하였다. 이 실험은 조지 타운 대학 동물 관리 및 사용위원회의 권고 사항을 준수하여 수행 하였다. 1. 주입을 위해 배아를 구성 및 증권 솔루션 만들기 <ol><li> 암 세포 혈관 침공을 평가하기 위해 필요한 제브라 피쉬 애벌레를 생성합니다. <ol><li> mitfa b692; ednrb1의 B140 물고기 (grcfp kdrl) ZN1의 Tg와의 교차 결합 쌍대 또는 그룹을 설정합니다. 참고 : 우리는 Tg가 생성 (kdrl : grcfp) ZN1을, mitfa b692, ednrb1의 B140의 제브라 피쉬를, Tg는 (kdrl : grcfp) 교차에 의해 색소 세포가 부족 라인, mitfa으로, 내피 세포에서 산호의 형광 단백질 녹색 암초를 표현 ZN1 (25), b692하며 Zebrafish의 국제 자원 센터에서 개발 ednrb1 B140. </li><li> 공동llect 계란, 깨끗하고, 미 수정 또는 변형 배아 다음날 (22)를 제거합니다. </li><li> 제브라 피쉬 배아가 2 일 때 발생하는 암 세포 주입을위한 준비가 될 때까지 28.5 ° C에서 배아를 품어 후 수정 (2 DPF). </li></ol></li><li> 분사 판을 확인합니다. <ol><li> 각 플레이트에 대한 DH 2 O에서 1.5 % 아가로 오스 25 ml의 용융. </li><li> 100mm X 15mm 페트리 접시에 아가로 오스 12 ml에 붓고하고 강화 할 수 있습니다. </li><li> 다시 용융 접시에 남아있는 아가로 오스를 부어 다음. </li><li> 이 아가로 30도 각도로 상기 플레이트의 중심에 위치하도록 즉시 절단 유리 형 (x 세로 7.5 cm 길이 3mm X 7.2 cm)에 위치. 참고 :이 가파른 60도 벽과 30 ° 경 사진 진입로를 생성합니다. </li><li> 대신에, 유리 몰드 테이프 아가 경화하자. </li><li> 조심스럽게 유리 몰드를 제거하고 아가로 오스가 찢어지지 않도록주의하십시오. 참고 : 금형은 4 ° C에서 DH 2 O에 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 물고기 물 (0.3 g / L의 바다 소금)와 분사 판을 평형. <ol><li> 두 번 증류수로 씻어 접시. </li><li> 10 분 동안 진탕 기에서 플레이트 대신에 생선을 물 10ml를 첨가하여 판 평형. </li><li> 판에게 물고기 물과 두 번째 평형. </li></ol></li><li> 물고기 물 (22)을 포함하는 요리로 전송하여 주입 그룹으로 2 일 후 수정 (DPF) 배아를 분할합니다. </li><li> 주사 후 활용할 수있는 각 그룹에 대한 복구 요리를 준비합니다. 복구 요리 10 ml의 물고기 물, 플러스 페니실린 (25 μg의 / ㎖) 및 스트렙토 마이신 (/ ㎖ 50 μg의)가 포함되어 있는지 확인합니다. </li><li> 물고기 물 플러스 페니실린과 스트렙토 마이신 50ml로 버퍼 tricaine의 재고 (4 ㎎ / ㎖, 10 mM 트리스, pH가 7) 4 ml를 추가하여 2 배 tricaine 솔루션을 준비합니다. </li><li> imagin 라이브 배아를 고정하는 장착 마취 매체를 생성하기 위해 2 배 tricaine 용액 10ml에 15 mg의 저 융점 아가로 오스를 녹여지. 참고 : 설치 매체는 1.5 % 아가로 오스로 구성되어 있습니다. </li><li> 미세 주사 바늘을 빼냅니다. <ol><li> 수직 피펫 풀러에 유리 모세관 튜브를 놓습니다. 20 MAMP 전류와 2 코일 발열체를 이용하여 긴 테이퍼 피펫 당겨. </li></ol></li></ol> 친 유성 형광 염료 2. 라벨링 암 세포 <ol><li> 그들의 추천 배양 조건에서 암 세포를 유지한다. 참고 :이 라인은 DMEM에서 + 10 % FBS를 유지했다 : BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 및 SK-BR-3. 이 라인은 RPMI + 10 % FBS 유지했다 : 1806 HCC와 T-47D를. 모든 세포주를 배양 중에 37 O C의 5 % CO 2로 유지 하였다. </li><li> 암 세포의 접착 성 배양 해리하여 단일 세포 현탁액을 생성한다. <ol><li> PBS 먼저 세포를 세척 한 후 0.05 % 트립신 EDTA 용액으로 처리한다. 참고 : 트립신 노출 시간이 세포주에 따라 달라집니다. </li><li> 그 자체로 트립신 용액을 중화럼 함유 세포 분리 후 세포 배양 매체. </li></ol></li><li> 200 XG에서 5 분 동안 트립신 중화 세포 현탁액을 원심 분리 후, 세포 계수를위한 신선한 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 자동 계수기를 사용하여 세포 현탁액을 카운트하고 세포 배양액 200 μL에 100 만 세포를 준비한다. <ol><li> 제브라 피쉬 배아에 주입하기 전에 트리 판 블루 염색 배제와 세포 생존을 확인합니다. 참고 : 만 가능한 세포 인구가 true 혈관 침공을 반영하지 않습니다 죽은 세포의 주입, 제브라 피쉬 배아에 주입한다. </li></ol></li><li> 100 희석 잘 혼합 한 후 20 분 동안 37 ℃에서 혼합물을 배양한다 : 1에 대한 암 세포 현탁액 레드 지용성 염료의 2 μL를 추가한다. 참고 : 염료 및 표시 시간의 농도는 각각의 세포주에 최적화 될 필요가있다. </li><li> 인큐베이션 후, 관 신선한 미디어 1ml를 추가 한 후, 5 분의 원심 분리200 × g으로. </li><li> 암 세포에서 잔류 형광 염료를 씻어. <ol><li> 대기음 세포 펠렛으로부터 상등액을 200 x g에서 5 분 동안 신선한 배지 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁하고 원심 분리. </li><li> 200 X g에서 5 분 동안 다시 다음 원심 분리기, 뜨는을 대기음 신선한 매체의 1 ML에있는 세포 펠렛을 재현 탁하고 : 세척 단계를 두 번 반복합니다. </li><li> 200 X g에서 5 분 동안 다시 다음 원심 분리기, 뜨는을 대기음 신선한 매체의 1 ML에있는 세포 펠렛을 재현 탁하고 : 세척 단계 세 번째를 반복합니다. </li></ol></li><li> 상등액을 흡인하고, 신선한 매체 500 μL에 100 만 표시된 암 세포를 함유하는 세포 펠렛을 재현 탁. 주 : 0.5 mM의 EDTA 세포 응집을 방지하기 위해 배지에 첨가 할 수있다. </li></ol> Zebrafish의 태아의 사전 심장 부비동에 3 주입 암 세포 <ol><li> 가압 공기 원에 미세 주입 분배 시스템을 부착하고 일을 켭니다전자 마이크로 인젝션 분배 시스템 전원 장치. <ol><li> 발 페달을 누름으로써 시험 압력. 공기의 짧은 펄스가 니들 홀더로부터 방출한다. </li></ol></li><li> 2 번 tricaine 용액 회 분사 플레이트 평형. <ol><li> 각 평형 단계, 10 분 동안 진탕 분사 플레이트와 장소에 2 배 tricaine 용액 20 ㎖를 추가한다. </li></ol></li><li> 2 번 tricaine 용액을 함유하는 작은 접시에 배아의 그룹을 전송하는 플라스틱 피펫을 사용한다. </li><li> 겔 로딩 피펫 팁을 사용하여 암세포 마이크로 인젝션 주사 바늘 백필. <ol><li> 세포가 끝 근처에 정착되도록 아래로 향하게 뾰족한 끝이 전극 저장 항아리에 바늘을 놓습니다. </li></ol></li><li> 전송 (20) - 플라스틱 피펫에 2 배 tricaine 많이 배아를 수집하여 분사 판 (30) 마취 된 배아. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 배아는 피펫의 팁에 정착하도록 허용합니다. </li><li> 신사LY는 통의 길이를 따라 배아를 확산, 사출 판의 저점으로 배아를 추방. </li><li> 홈통의 가파른 벽에 직면 위를 향하도록 머리와 배와 배아를 맞 춥니 다. 주 : Tricaine 용액 배아 만 통에 상주하여, 트로프 길이 평탄 아가 표면 모두를 커버한다. 배아는 이제 주입을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 마이크로 인젝션 분배 시스템을 이용하여 제브라 피쉬 배아 precardiac 부비동로 - (5- NL 2) 100 암세포 - (50)를 주입한다. <ol><li> 미세 조작기의 바늘 홀더에 바늘을 연결합니다. </li><li> 왼쪽으로 60도 벽과 입체경 아래 사출 접시를 놓고 25 배 배율로 가기 배아에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 확장 할 때, 바늘이 배아를 관통 할, 수 있도록 미세 조작기를 놓습니다. </li><li> 그것은 거의 배아를 터치 할 때까지 눈으로 바늘을 확장합니다. </li><li> 현미경으로 보면, t 그래서 바늘을 맞 춥니 다모자는 더 확장시 배아가 손상 될 수 있 습니 다. </li><li> 피어스 단지에서 팁을 배치 난황 통해 배아 아니라에서, 전 심장 동. </li><li> 풋 페달 누름으로써 세포를 주입한다. 분사의 힘은 심장 공동으로 세포를 배출한다. 바늘을 철회. </li><li> 오른손을 사용하여 확장하고 주사 바늘을 후퇴. 왼쪽 손으로, 다음 배아의 위치를 ​​미세 조정합니다. </li><li> 다른 판을 주입하기 위해 설정하는 동안 전극 저장 항아리에 바늘을 돌려줍니다. </li></ol></li><li> 전체 플레이트가 주입되면 복구 접시에 배아를 전송합니다. <ol><li> 구유 중 남은 배아를 세척하고, 플라스틱 피펫을 수집, 하단에있는 배아를 풀에 주입 판을 기울입니다. </li><li> 배아는 피펫의 바닥에 정착하도록 허용합니다. </li><li> tricaine의 최소 볼륨에서 복구 접시에 배아를 전송합니다. </li></ol></li><li> Incuba1 시간 동안 28 ° C에서 테 복구 요리. <ol><li> 죽은 태아, 먼지 분리 가능한 제브라 피쉬 배아. </li></ol></li><li> 96 시간 - 일반적으로 24 득점을위한 준비가 될 때까지 33 ° C에서 접시를 품어. 주 :이 온도는 37 ° C, 암 세포에 대한 적합한 온도 및 28.5 ° C, 제브라 이상적인 온도 사이의 절충으로서 결정된다. </li></ol> 4. 점수 혈관 외로 유출 <ol><li> 배아의 배치는 tricaine 솔루션을 접시에 배치하여 득점 할 수 마취. </li><li> tricaine 한 방울의 우울증 현미경 슬라이드에 마취 애벌레를 놓습니다. <ol><li> 꼬리 영역의 최적의 이미징을위한 측면 동양 애벌레. </li></ol></li><li> 성공적 분명히 손상 세포를 분별하는 꼬리 영역을 상하 중심으로 혈관에서 침입 한 암 세포의 수를 계산. 참고 :이 t에 관련된 두 명 이상이하는 것이 가장 좋습니다물고기를 득점 개인이 실험 조건에 블라인드 그의 과정은 평가된다. <ol><li> 10 배 대물 렌즈와 복합 형광 현미경에 애벌레 점수. 어떤 어려운 통화의 20 배 목표를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 슬라이드 및 후속 형광 이미징 상 5. 설치 태아 <ol><li> 1.5 % 아가로 오스 / tricaine 솔루션을 용융 및 37 ° C에 가져다. </li><li> 배아를 마취하는 tricaine 용액에 배치하여 촬상한다. </li><li> 촬상면에 tricaine 용액의 드롭 배아를 옮긴다. 선택적으로 유리 바닥 접시 또는 현미경 슬라이드를 사용합니다. </li><li> 촬상면의 배아를 유지하면서 과량 tricaine 용액을 제거하기 위해 유리 피펫을 사용한다. </li><li> 배아을 통해 용융 아가로 오스 솔루션의 한 방울을 오버레이. </li><li> 신속, 아가로 오스는 중합 전에, 속눈썹 브러시처럼 섬세한 도구를 사용하여 특별한주의를주고, 이미징 측면 배아 방향을배아 있도록 촬상면 함께 평탄화된다. </li><li> tricaine 솔루션에서 지금 중합 아가로 오스 드롭 잠수함. </li><li> 현미경 이미징 라이브 제브라 피쉬 배아를 대상. </li></ol> 6. 수정 : Zebrafish의 태아의 노 른 골목 속으로 주입 암 세포 <ol><li> 이전에이 프로토콜의 부 (3)에 설명 된대로 미세 주입 분배 시스템 및 사출 접시를 준비합니다. </li><li> 이전에이 프로토콜의 부 (2)에 설명 된대로 형광 염료를 대조되는 두 개의 세포 집단 레이블. </li><li> 난황에 2 × 10 ^ 7 세포 / ml의 10에서 nl - 5 주입. 각 세포 집단에서 - (200 암세포 100) 동일한 세포 수를 주입하는 주입 부피를 일정하게 유지 참고 : 하나는이 분석을 위해 형광 혈관이 결여 투명 제브라 피쉬의 배아를 사용할 수 있습니다. 혈관에 입자의 수동 항목 또는 형광 구슬 (&lt;10 μm의) 주입에 의해 제어 될 수 있으며, 변경기본적으로, intravsate하지 않는 세포주. </li><li> 이전에 (3)이 프로토콜의 다음 성공적인 주사에 대한 화면 섹션의 설명에 따라 주입 된 배아를 복구 할 수 있습니다. <ol><li> 화면 성공적으로 새로운 요리에 주입 된 실행 가능한 배아를 전송하는 입체경을 사용합니다. 참고 : 모든 배아는 노른자에있는 세포의 일관 크기의 질량이 있어야합니다. 모든 세포는 노른자의 외부에 위치하는 경우 태아는 질량 크기가 다른 경우 폐기 또는됩니다. </li><li> 암 세포가 명확하게 난황에서 볼 수 있습니다 경우 새 접시에 가능한 배아를 전송합니다. </li></ol></li><li> 48 시간 - 일반적으로 24 득점을위한 준비가 될 때까지 33 ° C에서 접시를 품어. 주 :이 온도는 37 ° C, 암 세포에 대한 적합한 온도 및 28.5 ° C, 제브라 이상적인 온도 사이의 절충으로서 결정된다. </li><li> intravasation 점을, (4)이 프로토콜의 대신 (c)의 수를 계산 섹션에 설명 된 지침을 따르십시오성공적으로 꼬리 영역의 혈관에 침입 한 ancer 세포. </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+promotion+of+metastasis.">Immune cell promotion of metastasis.</a> Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+signaling+between+human+CXCR4+and+zebrafish+ligands+by+the+small+molecule+IT1t+impairs+the+formation+of+triple-negative+breast+cancer+early+metastases+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Berens, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratin-associated+protein+5-5+controls+cytoskeletal+function+and+cancer+cell+vascular+invasion.">Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion.</a> Oncogene. , (2016).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

이 기술은 효과적으로 암세포 (도 1 참조)의 혈관 침입 능력을 시험하기 위해 제브라 모델을 이용한다. (- 3,도 2, 표 1 참조) 여기에서는, 다른 연구자들은 다음 자신의 연구를 구축 할 수가있는 기준을 제공하기 위해 유방암 세포주의 패널 기술을 적용 하였다. MDA-MB-231 세포가 쉽게 제브라 피쉬 배아의 꼬리 영역에 침입 관찰은 혈관 침윤을 억제 할...

전이성 암 사망률과 암세포의 확산을 가능하게 한 것을 발견 할 많은 유지기구의 주요 원인이다. 성공적으로 전이하는 암 세포에 대한 위해서는, 먼저 순환 시스템으로 (intravasate)를 입력, 기본 종양 주위의 기질을 통해 침입한다, 순환에서 통과, 출구 (extravasate)에서 살아 남기, 그리고 마지막으로 가능한 식민지를 구축 먼 장기 사이트 2에서. Intravasation 및 혈관 외 유출 따라서 전이성 폭포에서 중요한 단계이며, 아직 모든 암 세포는 파괴와 내피 접합 (3)를 통해 마이그레이션에 본질적으로 숙달되지 않습니다. 사실, 암세포의 혈관 침입을 둘러싸고 처리가 상기 내인성 및 외인성 인자 4 다양한 영향을받을 수있는 유일한 선택 압력의 시리즈가있다. 이러한 이유로, 고급 단계 암의 공격적인 행동을 조사 기법은 종종 V에 초점전이성 확산을 예측하는 수단으로서 기능 침습 ascular. 다양한 모델 시스템은 시험 관내에서 암세포의 침윤, 혈관의 조사를 용이하게하기 위해 존재한다. 대부분의 시험 관내 분석에서 사용하는 암 세포 (6)에 의한 손상 내피 단층 실시간 중단을 모니터링하는 내피 장벽 5 또는 전지 셀 기판 임피던스 감지 (ECIS) 기술을 통해 암 세포의 이동을 평가하기 위해 하나 트랜스 웰 시스템을 포함한다. 이러한 분석은 일반적으로 그렇지 내피 벽 암세포 부착에 영향을 줄 것 인 유체 역학 및 간질 인자 부족하다. 이 문제는 다소 기질 세포를 지원하여 내피 세포의 3 차원 배양에서 발생 관류 혈관 네트워크가 회피되고, 이러한 3D 미세 유체 시스템은 지금 체외에서 현재 옵션 7,8의 선두를 나타냅니다. 그럼에도 불구하고,이 방법은 기능성 순환계의 견고한 미세 생략따라서 단지 생체 내 모델에 대한 부분을 대신한다. 가장 널리 혈관 침범 생체 내 모델에서 사용은 상대적으로 짧은 시간 척도 발생 및 전이 능력 9 일반적 나타내는 때문에 실험 전이 분석은 일반적으로 수행되는 마우스이다. 이러한 분석은 순환에 암 세포를 직접 주입을 수반하기 때문에 전이 기관, 즉 혈관 외 유출 및 암 세포 집락의 말기 모델. 실험 전이 분석은 암세포 주사 부위에 따라 다를 상기 기관은 궁극적으로 분석 하였다. 제 분석 유형에있어서, 암세포가 폐에 마우스와 암세포 시드의 꼬리 정맥에 주입은 10, 11을 모니터링한다. 두 번째 분석은 뼈쪽으로 미세 12-14 전이성 시드를 직접 심장 내 주사를 수행 할뿐만 아니라 뇌 (15) 포함한다. 제 분석에서, 암 C학습 학생은 경동맥 내로 넷째 전달 경로 (17, 18)은 뇌에 암 세포를 전달하는 반면, 간 (16)의 정착을 허용하기 위해 비장에 주입된다. 관계없이 암 세포 전달 방법의 장기 집락은 허용 실험적 포인트이며, 일반적으로, 발광, 조직학, 또는 PCR 계 기술을 통해 결정된다. 쥐 호스트 내에서 실험 전이 분석을 수행의 생리적 인 장점에도 불구하고,이 실험은 아직 완료하고 분석 개월 주를 필요로한다. 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 모델은 최근 암의 진행 (19, 20)을 연구하는 새로운 시스템으로 부상하고 마우스 21-24에 비해 훨씬 짧은 시간 척도를 통해 기능 순환 시스템 내에서 암세포 혈관 침윤의 평가를 할 수있다. 이 방법은 내피 세포가 녹색 암초 산호 FLUO 태그 한 투명 제브라 피쉬의 변형을 이용하여kdrl 촉진제, 혈관 내피 성장 인자 (25)에 대한 수용체 제브라 구동 rescent 단백질 리포터. 상기 분석에서, 암 세포는 적색 형광 마커로 표지되며,이 일된 태아의 precardiac 부비동 주입. 외부에서 48 시간 내지 96 사이에 주입 한 후, 혈관에서 배아의 꼬리 영역으로 침범 암 세포는 형광 현미경을 효율적으로 획득 할 수있다. 여기서 우리는 혈관 침입 능력 뚜렷한 차이를 보여주기 위해 일반적으로 사용되는 인간 유방암 세포주의 패널 기술을 적용한다. 더욱이, 우리는 암세포 집단이 차분 형광 염료로 표지 된 형광 혈관 부족 제브라 피쉬 배아 내로 주입 될 수있는 배아 난황낭로 주사 부위를 변경하는 이종 세포 상호 작용의 연구를 허용 함을 입증. 이 후자의 분석에서, 노른자를 침공 한 암 세포는 vasculatur에 intravasated전자는 주사 후 48 시간에 꼬리 영역 (24)에 득점있다. 이에 모델의 효율성 및 편의에 제브라 점점 빠르게 생리 학적 환경 하에서 암세포의 혈관 침입 능력을 시험하기 위해 사용된다.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Dishes</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4&quot; Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-60</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Low Melting</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Molecular Grade</td><td>Bioline</td><td>BIO-41026</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4&quot;</td><td>A-M Systems, Inc</td><td>627000</td><td></td></tr><tr><td>David Kopf 700C Vertical Pipette Puller</td><td>Hofstra Group</td><td>3600</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Storage Jar, 1.0 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222)</td><td>Fluka</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Eyelash Brush</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Transfer Pipettes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Pipet Tips</td><td>Fisher Brand</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Dishes (12.0 mm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>Glass Depression Slide</td><td>VWR</td><td>470005-634</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt, Sea Salt</td><td>Pentair</td><td>IS50</td><td></td></tr><tr><td>Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS20622B</td><td></td></tr><tr><td>SP8 Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E600</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-G Potassium</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP914-100</td><td></td></tr><tr><td>Petri Plates, 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Brand</td><td>&amp;nbsp;FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer II</td><td>General Valve Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish&amp;nbsp;</td><td>Georgetown Zebrafish Shared Resources</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

testing the vascular invasive ability of cancer cells in zebrafish (danio rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

여기서 우리는 제브라 피쉬 배아 모델에서 일반적으로 사용되는 유방암 세포주 (도 1)의 혈관 침입 능력을 시험 하였다. 엄격한 기준은 암 세포가 분명히 extravasated 않았다면 포지티브 이벤트 만 계산 된 서로 다른 세포주에 대한 채점 넘쳐에서 세포 파편을 처치에서 발생할 수있는 거짓 양성을 제한하기 위해 주로 수행이 존재을 사용 하였다. <p class="jove_con...

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Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

이 방법은 효율적으로 암세포의 혈관 침입 능력을 시험하기 위해 제브라 피쉬 배아를 이용한다. 형광 암세포 개발 배아 precardiac 부비동 또는 난황 낭에 주입된다. 암 세포 혈관 침윤 및 혈관 외 유출은 24-96 시간 후 꼬리 영역의 형광 현미경을 통해 평가된다.

Zebrafish의에서 암 세포의 혈관 침습 능력을 (테스트<em&gt; 다니오 레 리오</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

11.9K 조회수.  Georgetown University.  이 방법은 효율적으로 암세포의 혈관 침입 능력을 시험하기 위해 제브라 피쉬 배아를 이용한다. 형광 암세포 개발 배아 precardiac 부비동 또는 난황 낭에 주입된다. 암 세포 혈관 침윤 및 혈관 외 유출은 24-96 시간 후 꼬리 영역의 형광 현미경을 통해 평가된다. 

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Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

종양의 병인에 후보 협동 유전자의 기능 게놈 분석을위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

연구

발생학

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

배아 Zebrafish의 인간 유방암 세포의 침략 행동

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

암 연구학

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A zebrafish xenograft is created by implanting mammalian tumor cells into the perivitelline space of two days-post-fertilization zebrafish embryos, followed by measuring the extent of the angiogenic response observed at an experimental endpoint up to two days post-implantation. The key advantage to this method is the ability to accurately quantitate the zebrafish host angiogenic response to the graft. This enables detailed examination of the molecular mechanisms as well as the host vs tumor contribution to the angiogenic response. The xenografted embryos can be subjected to a variety of treatments, such as incubation with potential anti-angiogenesis drugs, in order to investigate strategies to inhibit tumor angiogenesis. The angiogenic response can also be live-imaged in order to examine more dynamic cellular processes. The relatively undemanding experimental technique, cheap maintenance costs of zebrafish and short experimental timeline make this model especially useful for the development of strategies to manipulate tumor angiogenesis.

The aim of this method is to generate an in vivo model of tumor angiogenesis by xenografting mammalian tumor cells into a zebrafish embryo that has fluorescently-labelled blood vessels. By imaging the xenograft and associated vessels, a quantitative measurement of the angiogenic response can be obtained.

제브라피시 종양 이종이식에서 숙주 혈관조형성 반응의 생체 내 이미징 및 정량화

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal models are required for bridging the nanotechnology to its biomedical application. The mouse represents the traditional animal model for preclinical testing; however, mice are relatively expensive to keep and have long experimental cycles due to the limited progeny from each mother. The zebrafish has emerged as a powerful model system for developmental and biomedical research, including cancer research. In particular, due to its optical transparency and rapid development, zebrafish embryos are well suited for real-time in vivo monitoring of the behavior of cancer cells and their interactions with their microenvironment. This method was developed to sequentially introduce human cancer cells and functionalized nanoparticles in transparent Casper zebrafish embryos and monitor in vivo recognition and targeting of the cancer cells by nanoparticles in real time. This optimized protocol shows that fluorescently labeled nanoparticles, which are functionalized with folate groups, can specifically recognize and target metastatic human cervical epithelial cancer cells labeled with a different fluorochrome. The recognition and targeting process can occur as early as 30 min postinjection of the nanoparticles tested. The whole experiment only requires the breeding of a few pairs of adult fish and takes less than 4 days to complete. Moreover, zebrafish embryos lack a functional adaptive immune system, allowing the engraftment of a wide range of human cancer cells. Hence, the utility of the protocol described here enables the testing of nanoparticles on various types of human cancer cells, facilitating the selection of optimal nanoparticles in each specific cancer context for future testing in mammals and the clinic.

Described here is a method for utilizing zebrafish embryos to study the ability of functionalized nanoparticles to target human cancer cells in vivo. This method allows for the evaluation and selection of optimal nanoparticles for future testing in large animals and in clinical trials.

제브라피시에 기능성 형광 실리카 나노입자를 가진 제노이식 인간 암세포의 생체 내 표적화

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

제브라피시 애벌레 제노이식 및 종양 행동 분석의 생성

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

신경 모세포종 전이의 제브라피시 모델

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

효율적인 In Vivo 종양 연구를 위한 유충 제브라피시 활용

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

저자 스포트라이트: 제브라피시에서 종양 이종장기이식을 사용한 암 치료의 발전

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

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