Diese Forschung wurde von T32 (CA 9686-18) und TL1 (TL1TR001431) Postdoc-Stipendium Auszeichnungen (LT), DOD PC140268 (CA) unterstützt, W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) sowie U01 PAR-12-095 (Kumar) und P30 CA051008-21 (Weiner). Beispiel Fixierung, Schneiden und Färben wurde in der Lombardi Comprehensive Cancer Center Histologie und Tissue Shared Resource ausgeführt. Wir danken Richard Schlegel für hilfreiche Diskussionen. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position des National Cancer Institute oder dem National Institutes of Health vertreten.

1. Aufbau des 3D-Zellkultur Insert System <ol><li> Platzieren 2 Polycarbonat Zellkultureinsätze in einer umgekehrten Ausrichtung (Filterseite nach oben) nach unten in einer 6 - Well - Platte (1A). </li><li> Tragen Sie eine dünne Schicht von 0,1% Gelatine in Wasser auf die Unterseite des Einsatzes und erlauben (10-20 min) in einem biologischen Sicherheitsschrank trocknen Sterilität aufrecht zu erhalten. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2 zwei weitere Male für insgesamt 3-Anwendungen von 0,1% Gelatine auf die Einsätze. HINWEIS: Die Gelatinebeschichtung Grenze Diffusion zwischen den Kammern helfen. </li><li> Um die primäre CRCs von Standardkulturbedingungen sammeln, 5 ml PBS, die Kulturflasche zu waschen. <ol><li> Trypsinize die Zellen unter Verwendung von (1 ml für eine T-25 und 2 ml für eine T-75) 0,25% Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C. Klopfen Sie leicht auf die Seite des Kolbens in Verdrängen der Zellen zu unterstützen. Dann gehen die Trypsin Reaktion zu stoppen und die Zellen zu sammeln, indem 5 ml komplettem DMEM. </li><li> Sammeln<html> die Zellen in ein 15 ml Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4 ° C und 188 xg und zählen eine automatisierte Zellzähler oder eine Zählkammer. </li><li> Re-suspend 600.000 CRCs in 250 &amp; mgr; l konditioniertes Medium (CM) und zu der richtig ausgerichtet (Filterseite nach unten) Kultureinsatz (Abbildung 1B). Dies wird bezeichnet als die innere Kammer. Anmerkung: CM ist F-Medien durch bestrahlte J2 - Zellen konditioniert und enthält 10 &amp; mgr; m Y-27632 , wie vorstehend beschrieben , 7, 8, 9, 11. </li></ol></li><li> Bewerben 2 ml CM in die äußere Kammer des 6-Well-Platte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C (für mindestens 18 h). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die CM auf der inneren Kammer mit einer 1 ml oder 200 &amp; mgr; l-Pipette und langsam Differenzierungsmedium (DM) in die innere Kammer mit einer 1-ml-Pipette bis zur vollständigen hinzuzufügen. Seien Sie vorsichtig, um nicht die Zellschicht stören. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Wartung von 3D-Kulturen <ol><li> Überprüfen Sie jeden Tag die Kulturen. Gesunde Zellen erscheinen , wie in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Ändern des CM in der äußeren Kammer jeden Tag oder jeden zweiten Tag in Abhängigkeit vom Stoffwechsel der Zellen. </li><li> Wenn die Medien der inneren Kammer ändert sich die Farbe (gelb), sorgfältig die Medien auf der inneren Filterkammer zu entfernen mit einem 1 ml oder 200 &amp; mgr; l-Pipette. </li><li> Saugen Sie das Medium in der Kammeraußen 6-Well-Platte mit einem saugenden Spitze. </li><li> Unter Verwendung einer 1 ml Pipette gelten langsam frisch DM in die innere Kammer bis zur vollständigen. Achten Sie darauf, nicht zu kratzen oder auf andere Weise die Zellschicht entfernen. </li><li> Ersetzen Sie die Medien in die äußere Kammer mit 2 ml frischem CM. </li><li> Pflegen die Kulturen für 2 Wochen und dann die Verarbeitung für die gewünschte Isolations bimolekularen fortzufahren. HINWEIS: Jede Zeile in der 6 - Well - Platte, insgesamt sechs Einsätze (Abbildung 1B), sollte pro Experiment verarbeitet werden , um genügend Zellen für die DN zu erwerbenA, RNA oder Protein, für die Analyse. </li><li> Aspirat Medien in der äußeren Kammer und Spülen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Sorgfältig Medien aus der inneren Kammer mit einer 1 ml Pipette oder 200 &amp; mgr; l zu entfernen und 500 &amp; mgr; l PBS hinzu. Vermeiden Abkratzen oder anderweitig stören die Zellen auf der Membran. </li><li> Aspirat PBS von der äußeren Kammer und vorsichtig PBS aus der inneren Kammer mit einer 1 ml oder 200 &amp; mgr; l-Pipette entfernen. Sobald die PBS entfernt wurde, gehen direkt an die entsprechende Anwendung weiter unten beschrieben. Nicht in die Membran austrocknen. Die Kultur kann kurz in der PBS gehalten werden, bis die Anwendung bereit ist, zu beginnen. </li></ol> 3. Die Verarbeitung der Filter für die Pellet-Banking <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l 0,25% Trypsin-EDTA zu jeder Innenkammer und Inkubieren bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Kurz und vorsichtig rühren / kratzen die Zellen auf der Membranoberfläche mit einer 200 &amp; mgr; l Pipette beim Pipettieren nach oben und unten (vermeiden puncTuring die Membran). Inkubieren für 1 min bei 37 ° C. </li><li> Fügen Sie 250 ul von CM zu der ersten inneren Kammer und Pipette nach oben und unten vorsichtig den Filter zu spülen. </li><li> Transfer-Zellen zu der benachbarten Filterkammer resuspendiert, die dieselben Medienbedingungen enthält und wiederholen Auf- und Abpipettieren. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der Einsätze aus einem einzigen Zustand. Sammeln und zu transferieren Zellen in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Spülen jede innere Kammer mit einer zusätzlichen 100-200 uL CM alle verbleibenden Zellen zu sammeln. In den 1,5 ml Zentrifugenröhrchen in Schritt 3.5. </li><li> Dreh die Zellen bei 423 · g in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min. </li><li> Den Überstand aspirieren und waschen einmal das Zellpellet mit 1000 ul PBS. </li><li> Spin wieder bei 423 xg in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min. </li><li> Absaugen PBS und Einfrieren bei -80 ° C für die spätere Verwendung. </li></ol> 4. Die Verarbeitung der Filter für die RNA oder DNA-Isolierung <ol&gt; <li> Mit 200 &amp; mgr; l Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform oder ähnlichen Extraktionsreagens zu der inneren Kammer und kurz auf die Zellen auf der Membranoberfläche agitieren durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Inkubieren in dem Extraktionsreagenz für 5 min bei Raumtemperatur mit der äußeren Kammer trocken. <ol><li> Da der Filter aus dem Einsatz distanzieren kann, waschen Sie die distanzierte Filtermembran durch Auf- und Abpipettieren der Extraktionslösung. Sammeln Sie so viel des Extraktionsreagenz wie möglich durch die 6-Well-Platte Kippen und Restflüssigkeit abgesaugt. </li></ol></li><li> Folge dem Protokoll des Herstellers zur Reinigung und Rückgewinnung von DNA, RNA oder Protein. </li></ol> 5. Die Verarbeitung der Filter für die Proteinisolierung <ol><li> Setzen Sie den Filtereinsatz in der 6-Well-Platte auf Eis. Zu der inneren Kammer, mit 10 ul Puffer Protein Lyse, supplementiert mit 1 mM Natriumfluorid (NaF), 1 mM Natriumvanadat (NaV), 100 mM dithiothreITOL (DTT) und 100 &amp; mgr; l anti-Protease-Cocktail. </li><li> Rühre / kratzen die Zellen auf der Membranoberfläche mit einer Pipette 20 ul beim Pipettieren nach oben und unten. Vermeiden Blasen in dem Lysepuffer erzeugen. </li><li> Inkubieren Sie die 6-Well-Platte mit Filtereinsätzen auf Eis für 10 min. </li><li> Wiederholen Sie kratzen und dann spülen Sie die Membranoberfläche mit dem Lysepuffer. </li><li> Sammeln Sie die Lysate aus den 6-Einsätze und Transfer in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis. </li><li> Spülen der ersten Membran mit zusätzlichen 10 &amp; mgr; l Lysepuffer und Transfer zum nächsten Filter. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.6 für alle Einsätze, restliche Lyse-Pufferlösung zu sammeln und zu der 1,5 ml-Röhrchen (Schritt 5.5). </li><li> Inkubieren Sie die Probe auf Eis für weitere 5 min. </li><li> Spin bei maximaler Geschwindigkeit (16.873 xg in einer Tischzentrifuge) für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Pipette Lysatüberstand in ein frisches 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> Fahren Sie mit der Analyse der Proteinkonzentration oder store Lysate bei -80 ° C. </li></ol> 6. Verarbeitung für H &amp; E und Immuno-Färbung <ol><li> Fügen 500 ul und 1 ml 10% NBF (neutral gepuffertes Formalin) zu der inneren und der äußeren Kammer und ließ über Nacht bei 4 ° C inkubieren. </li><li> Absaugen NBF von der äußeren Kammer und 1 mL hydroxyethyl Agarose (HEA) Verarbeiten Gel auf eine 1,5-ml-Zentrifuge. Langsam schmelzen die Agarose in einem Mikrowellen niedriger Leistung mit und 10-20 s Impulse wiederholt, bis die Agarose geschmolzen ist. </li><li> Halten Sie die HEA in einem 37 ° C warmen Bad Erstarrung zu verhindern, bis sofort einsatzbereit. </li><li> Entfernen Sie die NBF aus der inneren Kammer und anzuwenden 25 ul geschmolzenes HEA in die innere Kammer und damit die Agarose für 2-5 min verfestigt. </li><li> Wet 2 Schaum Histologie Pads in 10% NBF und legen Sie ein Pad in einer Einbettungskassette (siehe 3D). </li><li> Verwenden Sie ein # 11 Klinge Skalpell (was eine sehr scharfe hat, fein spitzer Klinge), um den Filter von der Unterseite des Einsatzes zu punktenKammer, indem Sie sie teilweise aus der Kunststoffeinsatz Kammer. </li><li> Legen Sie eine kleine Menge (100-200 ul) NBF in einer Petrischale und tauchen Sie den teilweise verdrängt Filter in der NBF (3A). </li><li> Mit einem # 10 Skalpellklinge, drücken leicht gegen die Mitte des Filters, von der Innenseite des Einsatzkammer, um vollständig den Filter aus dem Einsatz barrel (3B) entfernen. Wenn es irgendein Teil des Filters ist, die noch an der Trommel angebracht ist, trennen sie mit dem Skalpell. </li><li> Schneiden Sie die HEA-beschichteten Filter in der Hälfte mit dem # 10 Klinge Skalpell (3C). </li><li> Platzieren Sie jede Hälfte des Filters auf das Schaumstoffpolster in der Kassette Histologie vorbereitet in Schritt 6.4 (3D). </li><li> In den zweiten 10% NBF getränkten Schwamm in die Kassette, zwischen denen die Filter. </li><li> Snap-Siegel der Kassette, in NBF und über Nacht inkubiert. </li><li> Prozessfilter in Paraffinblöcke für das Schneiden und Färben alszuvor beschrieben 12. </li></ol>

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	<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis.">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li><li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development.">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li><li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+stem+cells.">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li><li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells.">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li><li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells.">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li><li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogs+of+the+Novel+Phytohormone,+Strigolactone,+Trigger+Apoptosis+and+Synergy+with+PARP1+Inhibitors+by+Inducing+DNA+Damage+and+Inhibiting+DNA+Repair.">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer.">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor(s)+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells.">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868 (2015).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Primäre Zelllinien sind ein wichtiges und sich schnell entwickelnde Plattform für die Krebsforschung. Die Kultureinsatz-basierte 3D-Kultursystem unterstützt die Differenzierung von primären Prostata CRCs innerhalb einer zweiwöchigen Frist. Der CRC-Filter-Methode stellt eine neue, mittlere Durchsatzverfahren für Prostata-Forschung. Bestehende Maus PDX-Modelle sind zeitaufwendig und extrem teuer, und viele der PDX Proben nicht in Kultur gezüchtet werden, Forschern initiierte Experimente und ihre Nützlichkeit begre...

Die Identifizierung und Nutzung von Krebstherapien, die auf Einzelpersonen personalisiert sind ein vorrangiges Ziel in der Krebsforschung. Kürzlich wurden neue Konzepte entwickelt, die in die Einrichtung von primären Zellkulturen für größere Leichtigkeit ermöglichen, möglicherweise Weisen sowohl die Identifizierung und Prüfung personalisierten Therapien bieten. Zum Beispiel kann der R-spondin Basis Prostata organoiden Ansatz 1 für dreidimensionale (3D) Kultivierung von normalen und metastatischen Prostatakrebszellen in einer kommerziellen extrazellulären Matrix (beispielsweise Matrigel), während die Bedingter Reprogrammierung von Zellen (CRC) Verfahren an der Georgetown 2 entwickelt, nutzt 3 weitere Standard - 2D - Kulturbedingungen. Insbesondere führen die Kombination aus einem Rho - Kinase - Inhibitor (Y-27632) und bestrahlten J2 Maus - Fibroblasten - Feeder - Zellen auf unbestimmte Zeit Kultivierung von Keratinozyten CRCs 2. Die CRC-Methodik istextrem robust, mit primären Zelllinien erfolgreich etabliert und auf unbestimmte Zeit aus der Prostata und viele andere normalen und malignen epithelialen Geweben 3 gehalten. Wichtig ist, dass unsere CRC-Technologie für die schnelle Identifizierung der ursächlichen Basis für rezidivierende Atemwegs Papillomatose bei einem Patienten erlaubt, die eine Reihe von früheren medikamentösen Behandlungen versagt hatte. Darüber hinaus mit normalen und tumorabgeleiteten CRCs genehmigte die erfolgreiche Identifizierung eines FDA Droge, Vorinostat, wurde innerhalb von zwei Wochen nach der anfänglichen Gewebebiopsie gemacht. Der Patient wurde auf vorinostat platziert, in der erfolgreichen Behandlung ihrer Erkrankung 4 führt. Die normale Prostata wird von Luminal, basal umfasste und den seltenen neuroendokrinen Zellen 5. Luminalen Zellen bilden die säulen Epithelschicht der Drüse und drücken den Androgen-Rezeptor (AR), sowie andere luminalen Marker wie Zytokeratine 8 und 18 und Prostate-spezifischen Antigens (PSA) 6. Im Gegensatz dazu sind die basale Zellen unterhalb der luminalen Schicht lokalisiert und Zytokeratin 5 und p63 exprimieren, aber geringe Mengen des AR 5. Wir haben 7, 8, 9 und andere 10 haben erfolgreich Prostata CRCs in präklinischen mechanistischen Arzneimittelempfindlichkeit Untersuchungen verwendet. Wenn jedoch unter Standard - 2D - Gewebekulturbedingungen gezüchtet, versagen diese Zellen vollständig AR Signalisierung 10 zu beteiligen. Wichtig ist gesetzt, wenn sie unter die Nierenkapsel von immungeschwächten Mäusen, gewann die CRCs normalen Prostatadrüsen Architektur und Funktion anzeigt, dass Prostata CRCs ihre Abstammung Engagement beibehalten, wenn sie in einer permissiven Umgebung platziert. Die Entwicklung des Filtereinsatzes basierenden Zellkultur hier beschriebene System ermöglicht eine schnelle (2 Wochen) in vitro Differenzierung von Prostata CRCs als belegt by die erhöhte Expression des AR und AR Zielgene sowie verringerte Mengen an p63. Die Filtereinsätze verwendet werden, enthalten Polycarbonatmembranen (Porengröße 0,4 &amp; mgr; m), die die Kultivierung von Säugetierzellen zu unterstützen. Das System, wie entwickelt, macht Gebrauch von normalen und malignen Prostata CRCs, 6-Well-Kulturschalen und die Filtereinsätze. Zellkulturmedien bedingt durch J2 - Zellen 11 ist in der unteren Kammer und der Prostata Differenzierungsmedien in der oberen Kammer angeordnet. Die hierin beschriebenen Techniken Prostata luminalen Zelldifferenzierung innerhalb einer 2-wöchigen Zeitraum, im Einklang mit den Zielen der personalisierten Medizin zu unterstützen. Es war auch zwingend notwendig, die Methoden zu entwickeln, die für die umfassende molekulare, genetische und zelluläre Profilierung der Kulturen ermöglichen. Ansätze zur Isolierung von DNA, RNA und Protein aus Zellen von der Filteroberfläche gelöst wurden für eine genaue Wiederholungsprobenverarbeitung entwickelt und rationalisiert. Finally, Einbettung zu ermöglichen, die Methode zum Entfernen des Filters erforderlich ist, Schneiden und für H &amp; E, immunhistochemischen und Immunfluoreszenzfärbung wird vollständig beschrieben.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Corning Costar Snapwell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 Well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin 0.1% in water</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saftey Scapel 10 Blade</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpel 11 Blade</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Vanadate</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>13721-39-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Nutrient Mix Media</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11765054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-270-333-M025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PHG0315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12585-014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15710-064</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP264550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Adherent Dressing</td>
			<td>Telfa</td>
			<td>KDL2132Z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SIAL0167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>CG-M492</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid filter insert-based 3d culture system for primary prostate cell differentiation

Bedingtes umprogrammiert Zellen (CRCs) eine nachhaltige Methode zur primären Zellkultur und die Fähigkeit, umfangreiche &quot;living Biobanken&quot; von Patienten abgeleiteten Zelllinien zu entwickeln. Für viele Typen von Epithelzellen, verschiedene dreidimensionale (3D) Kultur Ansätze beschrieben worden, die eine verbesserte differenzierten Zustand unterstützen. Während CRCs ihre Abstammung Engagement für das Gewebe zu halten, aus dem sie isoliert sind, versagen sie viele der Differenzierungsmarker mit dem Ursprungsgewebe assoziiert auszudrücken, wenn sie unter normalen zweidimensionalen (2D) Kulturbedingungen gezüchtet. Um die Anwendung von Patienten stamm CRCs für Prostatakrebs Forschung verbessern, ein 3D-Kultur-Format definiert wurde, die eine schnelle (2 Wochen insgesamt) luminalen Zelldifferenzierung in normalen und Tumor-abgeleitete Prostata-Epithelzellen ermöglicht. Hierbei wird ein Filtereinsatz basierten Format wird sowohl für die Kultivierung und Differenzierung von normalen und malignen Prostata CRCs beschrieben. A dedetaillierte Beschreibung der Zellenerfassung und -verarbeitung für immunhistochemischen und Immunfluoreszenzanfärbung erforderlichen Verfahren für vorgesehen sind. Zusammengefasst das 3D-Kultur-Format beschrieben, mit den primären CRC-Linien kombiniert wird, liefert einen wichtigen mittel- Durchsatz Modellsystem für High- Bioprobe-basierte Prostata Forschung.

Der Zellkultureinsatz basiertes System ist ein relativ einfaches und schnelles Verfahren für die 3D-Kulturen von Prostata-CRCs produzieren, die luminale Zelldifferenzierung unterstützt. Eine schematische Darstellung des Systems gezeigt (Abbildung 1A) , die Anwendung der Gelatinebeschichtung an der unteren Oberfläche des Filtereinsatzes hervorhebt. Die Einsätze sind nur für die Anwendung der Gelatine umgeworfen. In 1B sind die Filter in der geeignete...

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A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Ein Rapid-Filtereinsatz-basierte 3D-Kultursystem für die primäre Prostata Zelldifferenzierung

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

a-rapid-filter-insert-based-3d-culture-system-for-primary-prostate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Serie: A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a viable treatment strategy and biopsy is not routinely performed, the availability of patient samples for research is limited. Consequently, efforts to study this disease have been challenged by a paucity of faithful disease models. To address this need, we describe here a protocol for the rapid processing of post-mortem autopsy tissue samples in order to generate durable patient-derived cell culture models that can be used in in vitro assays or in vivo orthotopic xenograft experiments. These models can be used to screen for potential drug targets and to study fundamental pathobiological processes within DIPG. This protocol can further be extended to analyze and isolate tumor and microenvironmental cells using Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS), which enables subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA at the bulk cell or single cell level. Finally, this protocol can also be adapted to generate patient-derived cultures for other central nervous system tumors.

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

This protocol describes a method for the rapid processing of post-mortem diffuse intrinsic pontine glioma samples for the establishment of patient-derived cell culture models or direct characterization of tumor and microenvironmental cells.

Ein Protokoll für schnelle Post-mortem-Zellkultur von Diffuse Intrinsic Ponsgliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Forschung

Krebsforschung

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more than 50 histological subtypes of these rare solid tumors have been identified. Thus, due to their extraordinary diversity and low incidence, our understanding of the biology of these tumors is still limited. Patient-derived cultures represent the ideal platform to study STS pathophysiology and pharmacology. We thus developed a human preclinical model of STS starting from tumor specimens harvested from patients undergoing surgical resection. Patient-derived STS cell cultures were obtained from the surgical specimens by collagenase digestion and isolated by filtration. Cells were counted, seeded, and left for 14 days in standard monolayer cultures and then processed by downstream analysis. Before performing molecular or pharmaceutical analyses, the establishment of STS primary cultures was confirmed through the evaluation of cytomorphologic features and, when available, immunohistochemical markers. This method represents a useful tool 1) to study the natural history of these poorly explored malignancies and 2) to test the effects of different drugs in an effort to learn more about their mechanisms of action.

The following protocol focuses on the establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma (STS). This model could help us to better understand the molecular background and pharmacological profile of these rare malignancies and could represent a starting point for further research aimed at improving STS management.

Einrichtung einer primären Kultur des Patienten abgeleitet Weichteilsarkomen

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) for prostate cancer are hampered by tumor heterogeneity and its complex microevolution dynamics. Traditional prostate cancer mouse models include, amongst others, germline and conditional knockouts, transgenic expression of oncogenes, and xenograft models. Generation of de novo mutations in these models is complex, time-consuming, and costly. In addition, most of traditional models target the majority of the prostate epithelium, whereas human prostate cancer is well known to evolve as an isolated event in only a small subset of cells. Valuable models need to simulate not only prostate cancer initiation, but also progression to advanced disease.
Here we describe a method to target a few cells in the prostate epithelium by transducing cells by viral particles. The delivery of an engineered virus to the murine prostate allows alteration of gene expression in the prostate epithelia. Virus type and quantity will hereby define the number of targeted cells for gene alteration by transducing a few cells for cancer initiation and many cells for gene therapy. Through surgery-based injection in the anterior lobe, distal from the urinary track, the tumor in this model can expand without impairing the urinary function of the animal. Furthermore, by targeting only a subset of prostate epithelial cells the technique enables clonal expansion of the tumor, and therefore mimics human tumor initiation, progression, as well as invasion through the basal membrane.
This novel technique provides a powerful prostate cancer model with improved physiological relevance. Animal suffering is limited, and since no additional breeding is required, overall animal count is reduced. At the same time, analysis of new candidate genes and pathways is accelerated, which in turn is more cost efficient.

This protocol describes a newly established method for virus delivery to the murine prostate. Using either CRISPR/Cas9 technology, gene overexpression, or Cre recombinase delivery, the technique allows orthotopic alteration of gene expression and implements a novel mouse model for prostate cancer.

Virus-Lieferung von CRISPR führt zu der murinen Prostata für gen-Änderung

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. While 75% of bladder cancers are non-invasive and unlikely to metastasize, about 25% progress to an invasive growth pattern. Up to half of the patients with invasive cancers will develop lethal metastatic relapse. Thus, understanding the mechanism of invasive progression in bladder cancer is crucial to predict patient outcomes and prevent lethal metastases. In this article, we present a three-dimensional cancer invasion model which allows incorporation of tumor cells and stromal components to mimic in vivo conditions occurring in the bladder tumor microenvironment. This model provides the opportunity to observe the invasive process in real time using time-lapse imaging, interrogate the molecular pathways involved using confocal immunofluorescent imaging and screen compounds with the potential to block invasion. While this protocol focuses on bladder cancer, it is likely that similar methods could be used to examine invasion and motility in other tumor types as well.

The processes governing bladder cancer invasion represent opportunities for biomarker and therapeutic development. Here we present a bladder cancer invasion model which incorporates 3-D culture of tumor spheroids, time-lapse imaging and confocal microscopy. This technique is useful for defining the features of the invasive process and for screening therapeutic agents.

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

Identifikation, histologische Charakterisierung und Dissektion der Maus Prostata Lappen für In-vitro-3D Sphäroid Kultur Modelle

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation defects and cancer. Vital to the understanding and amelioration of these diseases are experiments in primary fibroblast and melanocyte cultures. Nevertheless, current protocols for melanocyte isolation require that the epidermal and dermal layers of the skin are trypsinized and manually disassociated. This process is time consuming, technically challenging and contributes to inconsistent yields. Furthermore, methods to simultaneously generate pure fibroblast cultures from the same tissue sample are not readily available. Here, we describe an improved protocol for isolating melanocytes and fibroblasts from the skin of mice on postnatal days 0-4. In this protocol, whole skin is mechanically homogenized using a tissue chopper and then briefly digested with collagenase and trypsin. Cell populations are then isolated through selective plating followed by G418 treatment. This procedure results in consistent melanocyte and fibroblast yields from a single mouse in less than 90 min. This protocol is also easily scalable, allowing researchers to process large cohorts of animals without a significant increase in hands-on time. We show through flow cytometric assessments that cultures established using this protocol are highly enriched for melanocytes or fibroblasts.

This protocol outlines a rapid method to simultaneously generate melanocyte and fibroblast cultures from the skin of 0-4 day old mice. These primary cultures can be maintained and manipulated in vitro to study a variety of physiologically relevant processes, including skin cell biology, pigmentation, wound healing and melanoma.

Schnelle Generierung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

Bewertung der Differenzierungskapazität von Mausprostataepithelzellen mithilfe der organoiden Kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...