本研究では、T32（CA 9686から18）と、TL1（TL1TR001431）ポスドクの訓練助成賞（LT）、DOD PC140268（CA）、W81XWH-13-1-0327（CA）TR000102-04（CA）と同様でサポートされていましたU01 PAR-12から095（クマー）とP30 CA051008-21（ウェイナー）。サンプルの固定、切片と染色はロンバルディ総合がんセンター組織学および組織共有リソースで行いました。私たちは便利な議論のためのリチャード・シュレーゲルに感謝します。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立がん研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

3D細胞培養インサートシステムの1.設立<ol><li> 6ウェルプレート（ 図1A）にダウン逆方向（フィルタ側まで）で2ポリカーボネート細胞培養インサートを配置します。 </li><li>インサートの底面側に水中0.1％ゼラチンの薄い層を適用し、無菌性を維持するために、生物学的安全キャビネットの中で（10〜20分間）乾燥させます。 </li><li>手順を繰り返し1.2インサートに0.1％ゼラチンの3アプリケーションの合計2回以上。 注：ゼラチンコーティングは、チャンバ間の拡散を制限するのに役立ちます。 </li><li>培養フラスコを洗浄するためのPBS 5 mLを加え、標準的な培養条件から主CRCを収集します。 <ol><li> 37℃で5分間、0.25％トリプシン-EDTA（T-75のためのT-25及び2mLのために1 ml）を用いて細胞をトリプシン処理。細胞を穏やかに取り除くのを助けるために、フラスコの側面をタップします。その後トリプシン反応を停止し、完全DMEMを5ml加えることにより細胞を収集するために進みます。 </li><li>集めます<html> 15 mLチューブ内の細胞。 4℃、188×gでチューブを遠心し、自動細胞カウンターまたは血球計数器を使用してカウントされます。 </li><li>メディア（CM）を条件付け250μL60万CRCを再懸濁し、適切に配向（フィルタ側を下に）カルチャーインサート（ 図1B）に追加します。これは、内部チャンバと呼ばれています。 注：CMは、照射J2細胞によって条件付けF-メディアであると以前に7、8、9、11を説明したように10μmのY-27632が含まれています。 </li></ol></li><li> 6ウェルプレートの外側室にCMの2ミリリットルを適用し、（少なくとも18時間）、37℃で一晩インキュベートします。 </li><li>慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットを用いて内部チャンバにCMを削除して、ゆっくりと完全になるまで1 mLのピペットで内室に分化培地（DM）を追加します。細胞層を乱さないように注意してください。 </li></ol>3Dの文化のル &quot;&gt; 2。メンテナンス<ol><li>毎日文化を確認してください。 図2に示すように、健康な細胞が出現します。 </li><li>外側チャンバ内のCM毎日または細胞の代謝に応じて一日おきに変更します。 </li><li>内部チャンバのメディアは、色（黄色）を変更する場合は、慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットで内部フィルター室にメディアを削除します。 </li><li>吸引先端を有する外側6ウェルプレート室でメディアを吸引除去します。 </li><li> 1 mLのピペットを使用して、ゆっくりと完全になるまで、内側室に新鮮なDMを適用します。こすりまたはその他の細胞層を落とさないように注意してください。 </li><li>新鮮なCM 2mLで外側室でメディアを交換してください。 </li><li> 2週間の文化を維持し、目的の生体分子の分離のための処理に進みます。 注：6ウェルプレートの各行は、6インサート（ 図1B）の合計は、DNのための十分な細胞を取得するために、実験ごとに処理する必要があります分析のために、RNAまたはタンパク質。 </li><li>外側チャンバ内を吸引メディアとは、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）ですすいでください。 </li><li>慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットで内側チャンバからメディアを取り出し、500μLのPBSを追加します。スクレイピングまたはそうでなければ、膜上の細胞を乱すことは避けてください。 </li><li>吸引除去し、PBS外側チャンバから、慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットで内部チャンバーからPBSを削除します。 PBSを除去した後、以下に詳述する適切なアプリケーションに直接進みます。膜を乾燥させないでください。アプリケーションを開始する準備ができるまで、文化はPBSで簡単に維持することができます。 </li></ol> 3.ペレットバンキング用フィルターの処理<ol><li>各内部チャンバ100μL、0.25％トリプシン-EDTAを加え、37℃で5分間インキュベートします。 </li><li> （puncを避ける上下にピペッティングとしながら、200μLピペットで膜表面上の細胞をこすり/簡単に言えば、慎重に攪拌）膜をチューリング。 37℃で1分間インキュベートします。 </li><li>フィルターを洗浄するために静かに上下最初の内室とピペットにCMの250μLを追加します。 </li><li>転送は、同じメディア条件が含まれており、上下にピペッティングを繰り返し、隣接するフィルタ室に細胞を再懸濁しました。 </li><li>単一条件の挿入ごとに、この手順を繰り返します。収集し、1.5 mL遠心チューブに細胞を移します。 </li><li>残りの細胞を収集するために、CMの追加の100-200μLで各内側チャンバを洗い流します。ステップ3.5で1.5 mLの遠心分離管に追加します。 </li><li> 5分間、4℃で微量で423×gで細胞をスピン。 </li><li>上清を吸引除去し、1000年μLPBSで一度細胞ペレットを洗浄します。 </li><li> 5分間、4℃で微量で423×gで再びスピン。 </li><li>吸引し、PBS、後で使用するために-80℃で凍結。 </li></ol> 4. RNAまたはDNAの単離のためのフィルタの処理<ol&gt; <li>内室にグアニジンチオシアネート - フェノール - クロロホルムまたは類似の抽出試薬の200μLを加え、簡単に上下にピペッティングすることにより、膜表面上の細胞を攪拌。 </li><li> 外室の乾燥を用いて室温で5分間抽出試薬でインキュベートします。 <ol><li>フィルタは、挿入から解離することができるように、上下に抽出溶液をピペットで解離し、フィルター膜を洗浄してください。 6ウェルプレートを傾けると、残留液体を吸引することにより、可能な限り抽出試薬をできるだけ多く収集します。 </li></ol></li><li>精製およびDNA、RNAまたはタンパク質の回収のための製造業者のプロトコルに従ってください。 </li></ol> 5.タンパク質単離のためのフィルタの処理<ol><li>氷上で6ウェルプレートにフィルタインサートを置きます。内側チャンバーに、10μLの1mMフッ化ナトリウム（NaF）、1mMのバナジン酸ナトリウム（NAV）、100mMのdithiothreを補充したタンパク質の溶解緩衝液を追加ITOL（DTT）および抗プロテアーゼカクテルの100μL。 </li><li> /攪拌上下にピペッティングしながら20μLピペットで膜表面上の細胞をこすり取ります。溶解緩衝液中に気泡を発生させることは避けてください。 </li><li> 10分間氷上でフィルターインサートで6ウェルプレートをインキュベートします。 </li><li>掻き繰り返し、次いで溶解緩衝液で膜表面をすすぎます。 </li><li> 6インサートからの溶解物を収集し、氷上で1.5 mL遠心管に移します。 </li><li>溶解緩衝液の追加の10μLと第一の膜をすすぎ、次のフィルタに転送します。 </li><li>すべての挿入を繰り返しステップ5.6、任意の残留溶解緩衝液を収集し、1.5 mLのチューブ（ステップ5.5）に追加します。 </li><li>さらに5分間氷上でサンプルをインキュベートします。 </li><li> 4℃で15分間、最高速度（テーブルトップ遠心分離機で16873×gで）でスピン。 </li><li>新鮮な1.5 mLのチューブにピペット溶解液上清。 </li><li>タンパク質濃度やSTOの分析に進みます-80℃での溶解物の再。 </li></ol> 6. H＆Eの処理及び免疫染色<ol><li>内側と外側のチャンバーに500μL、10％NBF（中性緩衝ホルマリン）の1 mLを加え、4℃で一晩インキュベートしましょう。 </li><li>外側室からNBFを吸引し、1 mLのヒドロキシエチルアガロース（HEA）1.5 mL遠心に処理ゲルを追加します。ゆっくりと低消費電力を使用して電子レンジでアガロースを融解し、アガロースが溶けるまで、10から20秒のパルスを繰り返しました。 </li><li>使用する準備ができるまでの凝固を防ぐために、37℃の温浴中でHEAを保管してください。 </li><li>内側チャンバからNBFを外し、内部チャンバに溶融HEAの25μLを適用し、アガロースは、2-5分間固化することができます。 </li><li>ウェット2発泡組織学パッドを10％NBF中と包埋カセットに一つのパッドを配置する（ 図3Dを参照）。 </li><li>インサートの底面側からフィルタを獲得するために（非常に鋭い、微尖った刃を持っている）＃11ブレードメスを使用しますチャンバーは、部分的にプラスチック製のインサート室からそれを解放します。 </li><li>ペトリ皿にNBFの少量（100〜200μL）を配置し、NBF（ 図3A）で部分的に外れフィルタを浸します。 </li><li> ＃10ブレードメスで、静かに完全に挿入バレル（ 図3B）からフィルタを取り除くために、インサートチャンバーの内側から、フィルタの中央押し付けます。まだバレルに取り付けられているフィルタの任意の部分がある場合には、メスを用いてそれを切断します。 </li><li> ＃10ブレードメス（ 図3C）で半分にHEAコーティングされたフィルタをカットします。 </li><li>ステップ6.4（ 図3D）で作製した組織学カセットにフォームパッドの上にフィルタの各半分を置きます。 </li><li>フィルタを挟んで、カセットに2つ目の10％NBF浸したスポンジを追加します。 </li><li>スナップNBFカセット、場所を密封し、一晩インキュベートします。 </li><li>切片や染色などのためにパラフィンブロックへのプロセスフィルター以前12記載。 </li></ol>

<ol>
	<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis.">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li><li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development.">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li><li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+stem+cells.">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li><li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells.">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li><li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells.">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li><li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogs+of+the+Novel+Phytohormone,+Strigolactone,+Trigger+Apoptosis+and+Synergy+with+PARP1+Inhibitors+by+Inducing+DNA+Damage+and+Inhibiting+DNA+Repair.">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer.">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor(s)+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells.">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868 (2015).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

初代細胞株は癌研究のための重要かつ急速に発展プラットフォームです。カルチャーインサートベースの3D培養系は、2週間の期間内に原発性前立腺のCRCの分化をサポートしています。 CRCフィルタ法は、前立腺の研究のための新しい媒体スループット法を表します。既存のマウスPDXモデルは時間がかかり、非常に高価であり、PDXサンプルの多くは、研究者によって開始実験とその有用性を制限...

個人にパーソナライズされた癌治療の同定および使用は、癌研究における第一の目標です。最近、新しいアプローチが開発されており、潜在的に識別し、パーソナライズされた治療法をテストし、両方の方法を提供し、初代細胞培養の確立でより容易にするために可能にします。例えば、Rスポンジンベース前立腺オルガノイドアプローチ1は、セルの条件付き再プログラミング（CRC）法が、商業外マトリクス（ 例えば 、マトリゲル）中の正常および転移性前立腺癌細胞の三次元（3D）培養を可能にしますジョージタウン2、3で開発は、より標準的な2D培養条件を利用します。具体的には、Rhoキナーゼ阻害剤（Y-27632）、照射J2マウス線維芽細胞フィーダー細胞の組み合わせは、ケラチノサイトのCRC 2の不定培養をもたらします。 CRC方法であります極めて堅牢、初代細胞株が正常に確立し、前立腺癌および他の多くの正常および悪性上皮組織3から無期限に維持したまま。重要なことは、私たちのCRC技術は、以前の薬物治療の数を失敗していた患者における再発性呼吸器乳頭腫症のための病因の基礎の迅速な同定を可能にしました。また、正常および腫瘍由来のCRCを使用して、FDAの成功同定は、薬物、ボリノスタットは、初期の組織生検の2週間以内に行われた承認されました。患者は、その病気4の成功した治療の結果、ボリノスタット上に置きました。 正常な前立腺は管腔、基底と希少な神経内分泌細胞5から構成されています。管腔細胞が腺の円柱上皮層を形成し、アンドロゲン受容体（AR）、ならびにサイトケラチン8と18とプロのような他の管腔マーカーを発現します状態特異的抗原（PSA）6。逆に、基底細胞が管腔層の下に局在し、サイトケラチン5およびP63が、AR 5を低レベルで発現しています。私たちは、7、8、9、その他10が正常に前臨床メカニズムの薬剤感受性調査で前立腺CRCを使用しています。標準2D組織培養条件下で増殖させた場合しかし、これらの細胞は、完全に10シグナリング ARに係合することができません。免疫不全マウスの腎被膜下に置かれたとき重要なのは、CRCは許容する環境に置かれたとき、前立腺CRCがその系譜コミットメントを維持していることを示す正常前立腺腺のアーキテクチャと機能を取り戻しました。ここで説明したフィルタインサート基づく細胞培養系の開発が急速に（2週間）のために証明さbと前立腺のCRCのインビトロ分化を可能にします増加したARとAR標的遺伝子の発現と同様には、P63のレベルを減少させたY。 使用されるフィルタインサートは、哺乳動物細胞の培養を支持することができるポリカーボネート膜（孔径0.4μm）を含みます。システムは、開発され、正常および悪性前立腺のCRC、6ウェル培養皿とフィルタインサートを利用します。 J2セル11によって調整細胞培養培地を上部チャンバーに下部チャンバと前立腺分化培地中に置かれます。本明細書に記載の技術は、個別化医療の目標と一致して2週間の時間枠内に前立腺管腔細胞分化をサポートしています。文化の総合的、分子遺伝学および細胞プロファイリングを可能にする方法論を開発することも不可欠でした。フィルター表面から放出された細胞からのDNA、RNAおよびタンパク質を単離するための手法が開発され、正確な反復サンプル処理のための合理化されています。フィナLLY、埋め込みを有効にするフィルタを削除切片とH＆E、免疫組織化学および免疫蛍光染色のために必要な方法論は、完全に記載されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Corning Costar Snapwell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 Well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin 0.1% in water</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saftey Scapel 10 Blade</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpel 11 Blade</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Vanadate</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>13721-39-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Nutrient Mix Media</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11765054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-270-333-M025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PHG0315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12585-014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15710-064</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP264550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Adherent Dressing</td>
			<td>Telfa</td>
			<td>KDL2132Z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SIAL0167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>CG-M492</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid filter insert-based 3d culture system for primary prostate cell differentiation

条件付きで再プログラムされた細胞（CRCが）初代培養細胞と患者由来細胞株の大規模な「生きたバイオバンク」を開発する能力のための持続可能な方法を提供します。上皮細胞の多くのタイプのために、様々な3次元（3D）培養アプローチは、改善された分化状態をサポートすることが記載されています。 CRCが、それらが分離されている、そこから組織への系統コミットメントを保持するが、それらは通常の2次元（2D）培養条件下で増殖させた場合起源の組織に関連分化マーカーの多くを発現しません。前立腺癌の研究のための患者由来のCRCのアプリケーションを強化するために、3D培養形式は、正常および腫瘍由来の前立腺上皮細胞の両方の急速な（2週間合計）管腔細胞分化を可能にするように定義されています。ここで、フィルタインサートベースのフォーマットは、正常および悪性の前立腺のCRCの両方の培養および分化のために記載されています。デ免疫組織化学および免疫蛍光染色のための細胞の収集および処理に必要な手順の尾説明が提供されます。総称して、プライマリCRCラインと組み合わせて説明した3D培養フォーマットは、生物試料ベースの前立腺研究のためのスループットモデルシステムを高するための重要な中長期を提供します。

細胞培養インサートに基づくシステムは、管腔細胞分化をサポートしている前立腺のCRCの3D培養物を作製するための比較的単純かつ迅速な方法です。システムの概略フィルタインサートの下面にゼラチンコーティングの適用を強調し（ 図1A）が示されています。インサートはゼラチンのみの適用のために覆されています。 図1Bにフィルタが培?...

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A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

原発性前立腺細胞の分化のための迅速なフィルターを挿入ベースの3D培養システム

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

a-rapid-filter-insert-based-3d-culture-system-for-primary-prostate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.5K ビュー.  Lombardi Comprehensive Cancer Center. Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

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A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a viable treatment strategy and biopsy is not routinely performed, the availability of patient samples for research is limited. Consequently, efforts to study this disease have been challenged by a paucity of faithful disease models. To address this need, we describe here a protocol for the rapid processing of post-mortem autopsy tissue samples in order to generate durable patient-derived cell culture models that can be used in in vitro assays or in vivo orthotopic xenograft experiments. These models can be used to screen for potential drug targets and to study fundamental pathobiological processes within DIPG. This protocol can further be extended to analyze and isolate tumor and microenvironmental cells using Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS), which enables subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA at the bulk cell or single cell level. Finally, this protocol can also be adapted to generate patient-derived cultures for other central nervous system tumors.

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

This protocol describes a method for the rapid processing of post-mortem diffuse intrinsic pontine glioma samples for the establishment of patient-derived cell culture models or direct characterization of tumor and microenvironmental cells.

びまん性内因橋膠腫の迅速な死後の細胞培養のためのプロトコル（DIPG）

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

がん研究

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more than 50 histological subtypes of these rare solid tumors have been identified. Thus, due to their extraordinary diversity and low incidence, our understanding of the biology of these tumors is still limited. Patient-derived cultures represent the ideal platform to study STS pathophysiology and pharmacology. We thus developed a human preclinical model of STS starting from tumor specimens harvested from patients undergoing surgical resection. Patient-derived STS cell cultures were obtained from the surgical specimens by collagenase digestion and isolated by filtration. Cells were counted, seeded, and left for 14 days in standard monolayer cultures and then processed by downstream analysis. Before performing molecular or pharmaceutical analyses, the establishment of STS primary cultures was confirmed through the evaluation of cytomorphologic features and, when available, immunohistochemical markers. This method represents a useful tool 1) to study the natural history of these poorly explored malignancies and 2) to test the effects of different drugs in an effort to learn more about their mechanisms of action.

The following protocol focuses on the establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma (STS). This model could help us to better understand the molecular background and pharmacological profile of these rare malignancies and could represent a starting point for further research aimed at improving STS management.

患者由来の軟部肉腫の主な文化の確立

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) for prostate cancer are hampered by tumor heterogeneity and its complex microevolution dynamics. Traditional prostate cancer mouse models include, amongst others, germline and conditional knockouts, transgenic expression of oncogenes, and xenograft models. Generation of de novo mutations in these models is complex, time-consuming, and costly. In addition, most of traditional models target the majority of the prostate epithelium, whereas human prostate cancer is well known to evolve as an isolated event in only a small subset of cells. Valuable models need to simulate not only prostate cancer initiation, but also progression to advanced disease.
Here we describe a method to target a few cells in the prostate epithelium by transducing cells by viral particles. The delivery of an engineered virus to the murine prostate allows alteration of gene expression in the prostate epithelia. Virus type and quantity will hereby define the number of targeted cells for gene alteration by transducing a few cells for cancer initiation and many cells for gene therapy. Through surgery-based injection in the anterior lobe, distal from the urinary track, the tumor in this model can expand without impairing the urinary function of the animal. Furthermore, by targeting only a subset of prostate epithelial cells the technique enables clonal expansion of the tumor, and therefore mimics human tumor initiation, progression, as well as invasion through the basal membrane.
This novel technique provides a powerful prostate cancer model with improved physiological relevance. Animal suffering is limited, and since no additional breeding is required, overall animal count is reduced. At the same time, analysis of new candidate genes and pathways is accelerated, which in turn is more cost efficient.

This protocol describes a newly established method for virus delivery to the murine prostate. Using either CRISPR/Cas9 technology, gene overexpression, or Cre recombinase delivery, the technique allows orthotopic alteration of gene expression and implements a novel mouse model for prostate cancer.

ウイルスの遺伝子改変マウスの前立腺に CRISPR ガイドの配信

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. While 75% of bladder cancers are non-invasive and unlikely to metastasize, about 25% progress to an invasive growth pattern. Up to half of the patients with invasive cancers will develop lethal metastatic relapse. Thus, understanding the mechanism of invasive progression in bladder cancer is crucial to predict patient outcomes and prevent lethal metastases. In this article, we present a three-dimensional cancer invasion model which allows incorporation of tumor cells and stromal components to mimic in vivo conditions occurring in the bladder tumor microenvironment. This model provides the opportunity to observe the invasive process in real time using time-lapse imaging, interrogate the molecular pathways involved using confocal immunofluorescent imaging and screen compounds with the potential to block invasion. While this protocol focuses on bladder cancer, it is likely that similar methods could be used to examine invasion and motility in other tumor types as well.

The processes governing bladder cancer invasion represent opportunities for biomarker and therapeutic development. Here we present a bladder cancer invasion model which incorporates 3-D culture of tumor spheroids, time-lapse imaging and confocal microscopy. This technique is useful for defining the features of the invasive process and for screening therapeutic agents.

侵略を勉強し、膀胱癌の治療を評価するための 3次元細胞培養システム

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

培養 3 D 回転楕円体モデルでのマウス前立腺の葉の解剖組織学的特性及び

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation defects and cancer. Vital to the understanding and amelioration of these diseases are experiments in primary fibroblast and melanocyte cultures. Nevertheless, current protocols for melanocyte isolation require that the epidermal and dermal layers of the skin are trypsinized and manually disassociated. This process is time consuming, technically challenging and contributes to inconsistent yields. Furthermore, methods to simultaneously generate pure fibroblast cultures from the same tissue sample are not readily available. Here, we describe an improved protocol for isolating melanocytes and fibroblasts from the skin of mice on postnatal days 0-4. In this protocol, whole skin is mechanically homogenized using a tissue chopper and then briefly digested with collagenase and trypsin. Cell populations are then isolated through selective plating followed by G418 treatment. This procedure results in consistent melanocyte and fibroblast yields from a single mouse in less than 90 min. This protocol is also easily scalable, allowing researchers to process large cohorts of animals without a significant increase in hands-on time. We show through flow cytometric assessments that cultures established using this protocol are highly enriched for melanocytes or fibroblasts.

This protocol outlines a rapid method to simultaneously generate melanocyte and fibroblast cultures from the skin of 0-4 day old mice. These primary cultures can be maintained and manipulated in vitro to study a variety of physiologically relevant processes, including skin cell biology, pigmentation, wound healing and melanoma.

原発性マウスメラノサイトと線維芽細胞培養の急速な生成

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

がん関連線維芽細胞分化とインビトロ研究における侵入のためのより生理学的システムとしての3Dスフェロイドモデル

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

オルガノイド培養を用いたマウス前立腺上皮細胞の分化能力の評価

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...