Wir beschreiben Strategien und Schritt-für-Schritt-Protokolle, um serielle 3D-Patienten-abgeleitete Organoide von Knochenmetastasen-Prostatakrebs zu etablieren. Unsere optimierten Protokolle sind praktisch, um 3D-Kulturen für Experimente mit begrenztem Ausgangsmaterial direkt von Patienten oder patientenabgeleitetem Xenograft-Tumorgewebe einzurichten. Die 3D-Organoide aus diesem Protokoll können als ex vivo-Modelle verwendet werden, um grundlegende Mechanismen der Knochenmetastasen-Prostatakrebspathologie zu verstehen und die Behandlung zu testen.
Die 3D-Organoidkulturmedien in diesem Protokoll sind spezifisch für Prostatazellen. Andere Teile unserer Protokolle sind auf verschiedene Arten von Tumorgeweben und metastasierenden Stellen anwendbar. Die Doming-Technik kann sich als der schwierigste Teil dieses Prozesses erweisen.
Das Üben der Doming-Technik sorgt für eine konsistente Größe der gewölbten Mischung aus Organoiden, Medien und Matrigel und minimiert die Blasenbildung während der Probensuspension. Die visuelle Demonstration dieser Methode bietet ein besseres Verständnis für den Umgang mit dem zähflüssigen Matrigel zur erfolgreichen Kultivierung von Organoiden mit geringerer Dichte aus einer geringen Anzahl von Zellen. Beginnen Sie mit dem Wiederaufhängen des Zellpellets in der entsprechenden Menge an Kellermembran für eine 24-Well-Platteneinrichtung.
Pipette sanft nach oben und unten, um sicherzustellen, dass die Zellen resuspendiert werden, dann Pipette das entsprechende Volumen der Zellsuspension in die Mitte einer vorgewärmten Gewebekulturplatte. Invertieren Sie die Platte und legen Sie sie sofort auf den Kopf in den Zellkultur-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 15 Minuten eingestellt ist. Das entsprechende Volumen des vorgewärmten Mediums mit 10 Mikromolaren Y-27632 Dihydrochlorid in jeden Brunnen einteilen.
Um eine schwebende Kuppel von der befestigten runden Kuppel zu bilden, lösen Sie die Kuppel von der Platte mit einem Zellschaber. Schneiden Sie ein zwei mal vier Zoll großes Stück Paraffinfolie und legen Sie es auf die Divots eines leeren Spitzenhalters aus einer ein Milliliter Plastik-Pipetten-Spitzenbox. Verwenden Sie einen gehandicapten Zeigefinger, um sanft auf den Paraffinfilm zu drücken, um die Divots zu verfolgen, die darauf achten, den Film nicht zu durchbrechen.
Sprühen Sie den Paraffinfilm mit 70% Ethanol und schalten Sie die UV-Lampe in der Zellkulturhaube ein, um den vorbereiteten Film mindestens 30 Minuten lang zu sterilisieren. In der Zwischenzeit, resuspendieren Sie die vorverarbeiteten Zellen in 20 Mikroliter Kellermembran. Dann Pipette die Suspension in die Divots in der Paraffin-Folie gebildet.
Legen Sie die erstarrten Perlen und Paraffinfolie in eine Sechs-Brunnen-Platte und Pipette drei bis fünf Milliliter vorgewärmtes Medium mit 10 Mikromolar Y-27632 Dihydrochlorid in jeden Brunnen, während sanft Bürsten von der Paraffinfolie. Um die Organoide für die Histologie zu verarbeiten, entfernen Sie vorhandene Medien aus dem Brunnen, die darauf achten, die Kellermembrankuppeln nicht zu aspirieren. Fügen Sie ein gleiches Volumen der Zellrückgewinnungslösung hinzu und inkubieren Sie die Platte für 60 Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach der Inkubation die Kellermembrankuppel mit einer Pipette lösen und mit einer Pipettenspitze zerkleinern. Sammeln Sie die dissoziierte Kuppel und die Zellrückgewinnungslösung in ein 1,5-Milliliter-Rohr. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 mal g in vier Grad Celsius für fünf Minuten, dann entfernen Sie den Überstand und legen Sie es beiseite.
Speichern Sie alle Überräube bis zum letzten Schritt, wenn das Vorhandensein von Organoiden bei der gewünschten Menge an kalten PBS bestätigt wird und sanft Pipetten nach oben und unten, um das Pellet mechanisch zu vertreiben, ohne die Organoide zu stören. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand. Fixieren Sie das Pellet in einem abgestimmten Volumen von 4%PFA für 60 Minuten bei Raumtemperatur.
Wiederholen Sie nach der Fixierung den Zentrifugationsschritt und die PBS-Wäsche. Dann langsam 200 Mikroliter warme 2%Agarose hinzufügen und sofort, aber sanft das Zellpellet von der Rohrwand lösen, ohne es mit einer 25-Spur-Nadel an einer Ein-Milliliter-Spritze zu stören. Für die Agarose-Spin-Down-Methode ist es wichtig, das Zellpellet direkt nach dem Hinzufügen von Agarose mit einer 25-Spur-Nadel von der Wand des Rohres zu lösen.
Sobald die Agarose vollständig verfestigt ist, lösen Sie sie mit einer 25-Spur-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, aus dem Rohr und übertragen Sie sie in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr. Füllen Sie das Rohr mit 70% Ethanol und fahren Sie mit dem herkömmlichen Protokoll für Gewebedehydrierung und Paraffineinbettung fort. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um 3D-Organoide aus patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen von Knochenmetastasen-Prostatakrebs sowie direkt aus dem Krebsgewebe zu etablieren.
Die Organoide zeigten verschiedene Phänotypen, die sich als Zysten, Sphäroide und Organoide mit höherer Komplexität manifestierten. Eine ganze Kuppel aus Kellermembran und Organoiden ist in einem genähten Bild aus 25 hochauflösenden, 10-fachen Vergrößerungsbildern zu sehen. Zur weiteren Untersuchung des Tumorgewebes wurde eine immunfluoreszente Zytochemie an einem fünf Mikrometer dicken Paraffinabschnitt von Organoiden durchgeführt, die auf den basalen Epithelzellmarker Cytokeratin-5, den luminalen Epithelzellmarker Cytokeratin-8 und DAPI abzielten.
Dieses Protokoll kann für andere Anwendungen wie Western Blotting, Co-Culture und Flow Zytometrie optimiert werden, um Eigenschaften von 3D-Organoiden und die Auswirkungen von medikamentösen Behandlungen zu erforschen. Diese Experimente könnten Mechanismen der Arzneimittelresistenz und die Wirksamkeit neuartiger Therapeutika allein oder in Kombination mit aktuellen Therapien angehen. Die 3D-Organoide dieser Technik behalten die intersubjektische und intra-subjekt-Heterogenität bei und sind daher ein genaueres Modell der Erkrankung bei Patienten.
Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, Mechanismen der Arzneimittelresistenz, Tumorigenese, Metastasierung und Therapeutika zu erforschen, die mehr vorhersehbar für das Fortschreiten der Krankheit bei Patienten und ihre Reaktion auf die Therapie sein können.
