Prostata-Organoide sind ein spannendes In-vitro-System zur Untersuchung von Entwicklung und Krankheit. Sie meistern Herausforderungen verewigter Zelllinien und bieten eine kostengünstige Alternative zu Tiermodellen. Sie können aus menschlichen Prostatazellen, wie wir in diesem Protokoll gezeigt haben, sowie Ausmaus-Prostatazellen als krankheitsrelevantes präklinisches Modellsystem angebaut werden.
Viele Übungseinheiten haben nützliche Kulturmethoden und Endpunkte beschrieben. Aber wir hoffen, diese Details in einem Protokoll zusammenzuführen und die besonders herausfordernden Schritte für neue Benutzer aufzuzeigen. Wenn sich die Techniken verbessern, können Prostatakrebs-Organoide aus Patientenproben als präzisionsmedizinischer Ansatz zur Modellierung von Krankheiten und zur Reaktion auf Therapien angebaut werden.
Die Kulturbedingungen sind spezifisch für Prostata-Organoide, aber viele der Endpunkte wurden von anderen Gewebetypen angepasst. Ein Benutzer kann Teile dieses Protokolls an seinen Zelltyp anpassen. Beginnen Sie dieses Experiment, indem Sie Epithelzellen in Matrix-Gel-kodierten 96-Well-Platten anbauen, wie im Manuskript beschrieben.
Um Organoide nach 12 Tagen von den Platten zu sammeln, entfernen Sie Medium aus den Brunnen, ohne das Matrixgel zu stören. Dann fügen Sie sofort ca. 200 Mikroliter neutrale Protease zu jedem Brunnen bei etwa einem Ein-zu-zwei-Verhältnis von Matrix-Gel zu neutraler Protease hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Dann Pipette auf und ab, um die Mischung mechanisch zu dissoziieren, und wieder für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius brüten. Nach der Inkubation die neutrale Proteasematrix-Gelzellmischung aus wenigen Brunnen in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 300 mal g für drei bis fünf Minuten.
Entfernen Sie den Überstand, und speichern Sie das Organoidpellet für nachfolgende Analysen. Um Formen zum Einbetten zu erstellen, schneiden Sie einen kleinen Abschnitt einer 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze aus, um einen Zylinder herzustellen, der 50 Mikroliter fasst. Dann aus dem breiteren Teil der gleichen Spitze, machen eine zweite breitere Form, die um die erste Form passt.
Um einen kalten Block zu erstellen, wickeln Sie eine Eispackung mit Klebeband mit der Klebeseite nach oben. Dann die Formen senkrecht auf das Band kleben. Um die Organoide zur Verarbeitung in einen Histologie-Gel-Stecker einzubetten, waschen Sie zunächst das zuvor erhaltene Organoidpellet mit einem Milliliter Hanks Balanced Salt Solution.
Nach der Zentrifugierung bei 300 mal g für drei bis fünf Minuten, entfernen Sie den Überstand. Dann fügen Sie 30 bis 50 Mikroliter flüssiges Histologie-Gel in das Organoid-Pellet und mischen Sie sanft, indem Sie langsam nach oben und unten pfeifen, um das Pellet wieder aufzuhängen. Diese Mischung in eine Form auf dem kalten Block geben und die Probe abkühlen lassen und in einen Stecker verfestigen.
Als nächstes verwenden Sie einen Kolben, um den Stecker aus der kleinen Form in die Mitte der größeren Form zu schieben, und füllen Sie ihn, indem Sie klare 2%Agar um den Stecker herum pfeifen. Um die Oberseite der Probe zu markieren, Pipette histologic gefärbt 2%Agar auf dem Stecker. Sobald der Agar abgekühlt ist, verwenden Sie einen Kolben, um den Stecker in eine Histologiekassette zu übertragen.
Beschriften Sie die Kassette mit einem Bleistift und legen Sie sie zur nächtlichen Fixierung in 10% neutral gepuffertes Formalin. Am nächsten Tag die Kassette von 10% neutral gepuffertem Formalin auf 70% histologisches Ethanol übertragen und weiter verarbeiten und in Paraffin einbetten. Beginnen Sie mit dem Trimmen der Basis des Blocks bei einer Dicke von 10 Mikrometern.
Sobald ein Abschnitt angezeigt wird, der den Steckerbereich enthält, beenden Sie das Trimmen. Verriegeln Sie den Mikrotom-Rotor und übertragen Sie den Block zurück auf das Eis, um zu kühlen. Verschieben Sie das Blatt in einen neuen, nicht verwendeten Teil.
Und den Block zurück auf die Klemme übertragen. Entsperren Sie die Maschine und beginnen Sie mit dem Trimmen von fünf Mikrometern pro Abschnitt. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Abschnitt in das 40-Grad-Wasserbad Celsius zu übertragen und sich ausbreiten zu lassen.
Tauchen Sie eine Rutsche vertikal in das Wasser, um den Abschnitt darauf zu übertragen. Beobachten Sie dann das Dia unter einem hellen Feldmikroskop, um sicherzustellen, dass ein Organoid in dem Abschnitt vorhanden ist. Backen Sie über Nacht bei 45 bis 50 Grad Celsius, und gehen Sie dann mit Färbung, wie in der Handschrift beschrieben.
Beginnen Sie diesen Teil des Experiments mit ungenutzten Brunnen der 96-Well-Matrix-Gel-beschichteten Platte mit Organoiden. Durch Pipettieren gegen die Seite des Brunnens, den Raum zwischen Medien und Matrixgel zu verlassen, entfernen Sie sorgfältig so viele Medien wie möglich, ohne die organoide Kultur zu stören. Verwenden Sie eine getrimmte 1.000-Mikroliter Pipettenspitze, vornass mit PBS, um einen Tropfen Matrixgel zu erstellen, der die organischen Stoffe enthält.
Geben Sie den Tropfen auf die Mitte einer Kammerrutsche. Mit bloßem Auge die überschüssigen Medien und Matrixgel aus der Kammerrutsche mit einer feinspitzen Pipette aspirieren. Förderung der organoiden Haftung am Glas und Vermeidung von Probenverlust bei nachfolgenden Waschschritten.
Legen Sie die Rutsche 30 bis 45 Minuten in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator. Pipettieren Langsam, um ablösen von der Schale zu verhindern, fügen Sie 200 Mikroliter 1X PBS, um die Organoide für fünf Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln zu waschen. Entfernen Sie vorsichtig die 1X PBS und fügen Sie 200 Mikroliter 4%Paraformaldehyd hinzu.
Fix für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln. Bei PFA waschen und gehen Sie mit nachfolgenden Permeabilisations- und Färbeschritten fort, wie in diesem Protokoll beschrieben. Mount und Bild sofort.
Ungefärbte frisch geschnittene Folie zeigt deutlich menschliche primäre Prostata-Organoide, während in ungefärbten Trockenschlitten, Organoide scheinen durchscheinend und sind schwieriger unter einem hellen Feldmikroskop zu erkennen. Hämatoxylin und Eosin Färbung zeigt eine gebrochene menschliche primäre Prostata Organoid von Misshandlung, wie aggressive Pipettierung, falsche Verarbeitung Protokoll im Vergleich zu einem gut behandelten Organoid. Das menschliche primäre Prostataorganoid wurde formalinfixiert, paraffin-eingebettet, geschnitten und mit basalem Cytokeratin 5 und luminalem Cytokeratin 8, Basal p63 und luminalem Cytokeratin 8 befleckt und mit konfokalem Mikroskop abgebildet.
Ein vollmontiertes menschliches primäres Prostataorganoid wurde mit Basalzytokeratin 5 oder luminalem Cytokeratin 8 gefärbt und mit Phalloidin und DAPI gegengefärbt und mit konfokalem Mikroskop abgebildet. Ein vollmontiertes menschliches primäres Prostatazellorganoid wurde mit fluoreszierend emlogemeem Edu gefärbt und mit Hoescht konterkariert und mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Es ist wichtig, Ihre Organoide während des gesamten Verfahrens zu visualisieren.
Nachdem Sie die Abschnitte gesammelt haben, stellen Sie sicher, dass Sie die Proben auf der Folie visualisieren und sicherstellen, dass Sie Organoide während der Gesamtenmontage beobachten. Nachdem Sie die Organoide aus dem Matrixgel gesammelt haben, können Sie sie ganz mounten und kommerzielle Assays verwenden oder sich für die Durchflusszytometrie oder einzellige Sequenzierung mit Einzelzellen dissoziieren. Die 3D-Kultur bietet Forschern eine neue Möglichkeit, Gewebe in der Einstellung einer Laborschale zu untersuchen.
Es kann auf die Organogenese angewendet werden, oder um die Pathologie der Krankheit eines Patienten zu verstehen. Bei der Arbeit mit Patientenproben immer Vorsicht walten lassen und die Materialien als Potenzial für eine Exposition durch blutübertragene Krankheitserreger behandeln.
