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Eine befreit Zulassung (3002-13) Proben Forschung mit de-identifizierte Gewebe an das Department of Health gemäß durchführen und Human Services Vorschriften, 45 CFR 46,101 (b) (4) gewährt wurde. Volle Dicke Haut ist von einer geplanten Operation erhalten. In diesem Artikel ist die Gewebequelle 66-jährigen kaukasischen weiblichen Brust. 1. Herstellung von Elastomer beschichtete Deckgläser <ol><li> 0,107 g Sylgard 184 Härter mit 5,893 g Base in einem 20 Glasfläschchen ml, mischen. Die Gesamtmischung Masse beträgt 6 g mit einem Basismittel-Verhältnis von 55 bis Härtung: 1. </li><li> Nach dem Mischen mit einem Glasstab um Homogenität zu gewährleisten, legen Sie das Glasfläschchen in einer Vakuumkammer und Entgasen alle Luftblasen zu entfernen. </li><li> Ein Glasdeckglas (55 mm x 25 mm) in der Mitte eines Spin-Coater. In ~ 1 ml der Mischung auf die Mitte des Deckglas. Verwenden Sie eine 5000 ul Pipette mit dem Ende mit einer Schere abgeschnitten. Schleuderbeschichtung der Deckglas bei 2000 Umdrehungen pro Minute für 60 s. <ol><li> Wiederholen Sie diesen process 5-6 Substrate zu schaffen. </li></ol></li><li> Härten die Deckgläschen in einem Ofen 12 Stunden lang bei 60 ° C. </li><li> Verwenden Sie eine Rasierklinge, um teilweise die Elastomerfolie aus einem Opfersubstrat zu entfernen. Verwenden Sie einen unauslöschlichen Markierung, um die Oberseite des Elastomerfilms und der exponierten Glas zu markieren. </li><li> Montieren Sie die Probe auf einem inversen Mikroskop und mit einem Fernfokus als Zubehör den Unterschied in der z-Höhe zwischen den Brennebenen der beiden Marken zu erfassen. Dies entspricht dem Elastomersubstratdicke, h. </li></ol> 2. Herstellung des Stratum Corneum <ol><li> Verwenden Sie ein Wasserbad oder beheizte Rührplatte ein halbes Glas Becher mit VE-Wasser (DW) bis 60 ° C gefüllt zu erhitzen. In einem biologischen Sicherheitsschrank, tauchen die volle Dicke der menschlichen Haut im Wasser für 4 min. </li><li> Unmittelbar übertragen die Hautprobe in ein Becherglas mit DW gekühlt auf &lt;10 ° C für 4 min. Die Hälfte der Becher Füllung minimiert Verspritzen von infektiöses Material. </li><li> Entfernen Sie die Haut aus dem Becher, in einer Petrischale, und zu isolieren, sanft in die Epidermis ein Paar gebogene Nase Gewebe mit einer Pinzette. </li><li> Legen Sie die isolierten Epidermis basale Seite nach unten in einer Petrischale mit Gaze ausgekleidet. Sicherstellen, dass die basalen Schicht vollständig in Kontakt mit der Gaze ist. <ol><li> Genießen Sie die Gaze in einer 0,25% (wt / vol) Typ IX-S Schweinepankreas gelöst Trypsinlösung in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung für 6-8 h bei Raumtemperatur. Fügen Sie nur genug Trypsin in dem Behälter die Gaze zu benetzen. </li></ol></li><li> Heben Sie die Gaze mit Gewebe Pinzette und schweben sie teilweise in einem Behälter mit DW gefüllt. Ziehen Sie das SC sie von der Gaze zu trennen. </li><li> Waschen Sie das Stratum corneum 3-4 mal in DW Rest epidermale Gewebe zu entfernen, die an den SC gebunden bleibt. </li><li> Schwimmer, die isoliert SC in einer Lösung von 0,4% Glycin max (Soja) Trypsin-Inhibitor in DW. Verwenden Schüttler eine Platte in das Gewebe für 10 Minuten zu rühren. </li><li> Float SC in einer Petrischale teilweisemit DW gefüllt. Verwenden Schüttler eine Platte in das Gewebe für 10 Minuten zu rühren. </li><li> Trocknen Sie die isolierte SC Blatt auf einer ultrafeinen Kunststoffnetz für 48 Stunden bei Raumtemperatur (25 ° C, 40% relative Luftfeuchtigkeit (RH)). </li><li> Trennen Sie die SC aus dem Netz und ausgeschnitten Proben einzelnen Kreis R = 3 mm Radius eine kreisförmige Lochung mit. Markieren Sie die Mitte der äußersten Fläche mit einer kleinen Spirale Marke einen unauslöschlichen Marker. Dies liefert einen visuellen Hinweis der Oberseite der SC für die Erkennung. HINWEIS: Die unauslöschliche Spuren sollte in der Mitte der Probe aufgebracht werden, wobei die Trocknungs Verformungen kleinste sein. Dadurch wird die Wirkung der Markierung auf aufgezeichnet Trocknungsverschiebungsprofile minimieren. </li></ol> 3. Proben Behandlung und Ablagerung <ol><li> Agitieren SC Proben für 30 min in 15 ml DW, enthaltend 90 &amp; mgr; l Fluoreszenzmarker Wülste (505/515 nm, 1 &amp; mgr; m Durchmesser, Carboxylat-modifiziert). Diese Ablagerungen Perlen auf die SC Oberfläche HINWEIS: Während der Abscheidung von large Zahlen von Perlen auf dem SC vorhanden 12 geringfügig relativ langsames Trocknen an Proben ohne Perlen, wird die räumliche Auflösung der in der gleichen Ebene Deformationsfelder zu maximieren , die anschließend erhalten werden können. Die Wahl des Bead - Volumens zugegeben wird, sollte daher ad hoc erfolgen. </li><li> Entfernen SC Proben und legen Sie sie in einer Petrischale teilweise mit DW gefüllt. </li><li> Teilweise eintauchen in einem flachen Winkel von 15-30 ° ein Substrat in der DW. </li><li> Pin eine Kante des schwebenden SC Probe an der Kontaktlinie zwischen dem Substrat und Wasser-Grenzfläche. Vertikal Herausziehen des Substrats aus dem Wasser gleichmäßig laminieren die SC Probe an das Substrat, ohne Falten oder eingeschlossenen Luftblasen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.4 zu platzieren bis zu 6 SC Proben auf jedem Substrat. Lassen Sie mindestens eine 2-3 mm Abstand zwischen den Proben und vermeiden Probe Laminierung nahe an der Substratkante. Dies verhindert Trocknen einer Probe beeinflussen Trocknungs Verschiebungen in einem anderen. </li&gt; <li> Trocknen Sie die montierten SC Proben unter Laborbedingungen für 60 min. Auf diese Weise können Restwasser zwischen dem SC und dem Substrat zu verdampfen und sorgt für eine vollständige Gewebehaftung. HINWEIS: An dieser Stelle SC Proben können mit einem chemischen oder kosmetischen Formulierungen 7, 8 , indem die Substrate den Kopf in einer gewünschten Lösung für eine erforderliche Zeitdauer behandelt werden. Wiederholen Sie Schritt 3.6, sobald die Behandlungsschritt durchgeführt wird. Nach dem Trocknen kann unvollständige Adhäsion von SC-Proben auf das Substrat überprüft unter Verwendung von Durchlichtmikroskopie werden. Gefangen Blasen unter dem SC Probe oder abgelöste Kanten wird in der Probe mit gut definierten Kanten klare Kontrastvariationen bilden. </li><li> Erstellen Sie eine Feuchtigkeitskammer durch eine Petrischale platzieren teilweise mit Wasser in einem hermetisch verschlossenen Behälter gefüllt. </li><li> Ort Substrate in die Kammer für 24 h einer relativen Feuchtigkeit von 99% äquilibrieren. Legen Sie nicht die Substrate in die Petri Gericht. </li></ol> 4. Mikroskop Umweltkontrolle <ol><li> Erreichen Kontrolle der Umweltbedingungen durch ein Feuchtigkeitsregelungssystem an ein Mikroskop montierbar Perfusionskammer verbunden. Einzelheiten des Feuchtigkeitskontrollsystem sind in der deutschen et al. (2013) 7 und Liu und Deutsch (2015) 8. </li><li> Montieren Sie das Substrat, auf dem Mikroskop, legen Sie die Perfusionskammer über das Substrat und dichten Kanten der Perfusionskammer mit dem Elastomer mit Vakuumfett. </li><li> Einmal montiert, ins Gleichgewicht Innenluft auf 99% RH vor dem Experiment. Dies verhindert, dass das Verdampfen von Wasser vor dem Experiment. Sobald Bildgebung in den Abschnitten 5 oder 7 begonnen hat, reduzieren interne Luftfeuchte auf den gewünschten Wert. HINWEIS: In diesem Artikel werden SC-Proben auf 25% RH getrocknet </li></ol> 5. Imaging in Flugzeug Trocknung Verlagerungen <ol><li> Erwerben Sie Bilder von SC-Proben eines invertierten microsco mitpe mit 1X Objektivlinse. Excite fluoreszierende Kügelchen eine Lichtmaschine mit FITC-Filter (503-530 nm Emissionsbandpass). Mehrere Proben können nacheinander im gesamten Trocknungs abzubildenden eine automatisierte xy-Ebene verwendet wird. </li><li> Nehmen Sie Leuchtstoff- und Durchlichtbilder einer digitalen CCD-Kamera mit einer Auflösung von 1.392 x 1.040 Pixeln. Das Sichtfeld jedes Bildes ist 8,98 x 6,71 mm, um ein einzelnes Bild ermöglicht eine vollständige SC Probe zu erfassen. Nehmen Bilder mit einer Frequenz von 10 min für 16 Stunden. </li></ol> 6. Untergrundvorbereitung für Dickenmessung <ol><li> In einem Laborabzug platzieren 1 ml Silan (3-Aminopropyltriethoxysilan; ≥98%) in einigen kleinen Plastikkappe. Platzieren Elastomersubstrate aus dem Abschnitt 1 und der Kappe in einem verschlossenen Behälter für 5 h. Substrate dürfen nicht direkt in Kontakt mit dem Silan zu kommen. </li><li> Zugabe von 5 mg EDC (N - (3-Dimethylaminopropyl) - N -ethylcarbodiimide Hydrochlorid; ≥99%) in einem 1,5 ml - Röhrchen. In 500 &amp; mgr; l von DW an die EDC. Rühre die Lösung für 10 s mit einem Wirbelmischer. </li><li> Hinzufügen, 0,076 g Natriumtetraborat und 0,1 g Borsäure zu 20 ml DW. Mischen mit einem Magnetrührer bei 70 ° C (1 h). In Borsäure, bis der pH-Wert 7,4 ist. </li><li> 20 ml Boratpuffer in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Werden 60 &amp; mgr; l von 1 &amp; mgr; m-Kügelchen (535/575 nm Carboxylat-modifizierter) mit dem Boratpuffer. Schließlich fügen 200 ul EDC-Lösung in die Flasche. Das Röhrchen Wulst Lösung zu mischen und gießen Sie dann in einen 10 cm Durchmesser Petrischale. </li><li> Entfernen Sie die silanisierte Substrate aus dem Behälter und legen Sie sie filmseitige Elastomer nach unten in die Beadlösung. Tun Sie dies langsam Blasen von Einklemmen zu verhindern. Zwei Substrate werden in jeder Petrischale passen. </li><li> Lassen Substrate für 45 Minuten in der Beadlösung zu schweben. </li><li> Verwenden einer Pinzette, die Substrate von der Perle Lösung zu entfernen, spülen Sie dann in DW ungebundenen Perlen zu entfernen. </li><li> Luft trocknen die Substrate. Einblasen von Druckluft überdie Elastomerfolienoberfläche vermindert die Bildung von Wasserflecken. </li><li> Verschließen Sie die Substrate in einer undurchsichtigen Box zu verhindern Photobleichens der Kügelchen bis SC Probenablage. </li></ol> 7. Imaging Dicke von SC <ol><li> Kaution SC Proben auf einen Substratabschnitt unter Verwendung 3. Allerdings führen Sie Schritt 3.1, ohne auf die DW fluoreszierende Kügelchen hinzugefügt wird. Zusätzlich wenden eine 5 &amp; mgr; l Tropfen unverdünntes Fluoreszenzmarker bead-Lösung (505/515 nm, 0,1 um Durchmesser) auf der Oberfläche jeder abgelagerten SC Probe mit einer Pipette vor dem Schritt 3.6 abgeschlossen. </li><li> Stellen Messungen von SC Dicke das Mikroskop mit 40-facher Objektivlinse verwendet wird. Messen der Dicke von SC-Proben über die Zeit eine Fernfokus Zubehör unter Verwendung der Differenz in z-Höhe zwischen den beiden Perlenschicht Brennebenen auf der SC-Substrat-Grenzfläche und der Oberseite des SC angeordnet aufzuzeichnen. </li><li> Messen Sie die Dicke von 3 Regionen jeder SC Probe über einen 3 h Trocknungszeit. Die Dickevon SC - Proben erreicht innerhalb dieses Zeitrahmens 8 einen stationären Wert. </li></ol> 8. Quantifizierung und Modellierung Gewebe Deformation <ol><li> Verwenden Sie Particle Image Velocimetry 13 zu erhalten , räumlich aufgelöste in der Ebene liegende Trocknungs Verschiebungen von den fluoreszierenden Bildern bei jedem aufgezeichneten Zeitschritt. </li><li> Verwenden MATLAB azimutal gemittelte radiale und azimutale Verschiebungsprofile aus dem Verschiebungsfeld jedes radial symmetrischen SC Probe zu erhalten. Hinweis: Ein Beispiel-Datensatz (mit dem Titel &#39;d.mat&#39;) und MATLAB-Code (mit dem Titel &quot;PIV-processing.m &#39;), die 8.3 sowohl diesen Schritt und Schritt durchführt wurde, in dem ergänzende Informationen zur Verfügung gestellt. </li><li> Fit radialen Verschiebung Profile auf ein Modell 7, 8, 14, 15, 16 beschreibt Trocknen SC als schrumpf linearen elastischen circular Platte zeitveränderliche Dicke h SC, Radius, R, und der Elastizitätsmodul, SC E, geklebt auf ein verformbares elastisches Substrat mit einem Elastizitätsmodul, E. SC Angenommen hat eine gut definierte und konstante Poissonzahl, ν SC = 0,4 7 8. Erhalten Sie am besten passt ein Minimum der kleinsten Quadrate-Ansatz. HINWEIS: Das Modell für den Einbau verwendet wird, beschreibt radiale Verschiebungen in Bezug auf die modifizierte Bessel-Funktionen sind: <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq2.jpg" /> (1) mit <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq3.jpg" /> . <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq4.jpg" /> und <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq13.jpg" /> Der Begriff <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq6.jpg" /> entspricht einer Eindringtiefe gegeben durch <img alt= &quot;Gleichung&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55336 / 55336eq7.jpg&quot; /&gt;. <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq8.jpg" /> bezeichnet ein Substrat Steifigkeit Parameter; gilt, wenn die Probengrößen viel größer sind als die Substratdicke. Hierbei sind die Parameter, <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq9.jpg" /> und <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq10.jpg" /> Das Poisson-Verhältnis bezeichnen jeweils die Substratdicke. Das Poisson-Verhältnis des Siliconelastomer - Substrat 17 ist ν = 0,5 auf . </li><li> Erhalten Modellparameter a und β in jedem Zeitschritt der kleinsten Quadrate der Gleichung (1) zu der radialen Verschiebungsprofil. <ol><li> Setzen Sie dafür die Anpassungsparameter β zu SC Elastizitätsmodul, E SC zu erhalten, unter Verwendung des Ausdrucks, <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq11.jpg" /></li><li> Verwenden Sie Anpassungsparameter α die Zeit zu erhalten unterschiedlichen Kontraktions Trocknen stress, PSC, unter Verwendung des Ausdrucks, <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq12.jpg" /></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In diesem Artikel beschreiben wir eine Technik, die verwendet werden können, die dynamische Trocknungsverhalten und die mechanischen Eigenschaften des menschlichen SC zu messen. Frühere Studien haben gezeigt , dass diese Technik verwendet werden kann , um die Auswirkungen von Umgebungsbedingungen und chemischen Produkten üblicherweise in kosmetischen Reinigungsmittel und Feuchthaltemittel auf der dynamischen Trocknungsverhalten von SC 7, 8 verwendet , zu quan...

Die äußere Schicht der Epidermis oder Stratum corneum (SC) aus bindigen Korneozyt von einer Lipid - reichen Matrix umgeben Zellen 1, 2. Die Zusammensetzung und die strukturelle Integrität des SC ist von wesentlicher Bedeutung für die korrekte Barriere Funktionalität beibehalten 3, die Invasion von Mikroorganismen verhindert und widersteht sowohl mechanische Kräfte und übermäßigen Wasserverlust 4. Die Kapazität von Körperpflegeprodukten zu erhalten oder Hautbarrierefunktion verschlechtern ist von großem Interesse für die Haut im Gesundheitswesen und der Kosmetikindustrie 5. Die tägliche Anwendung von Körperpflegeprodukten ist bekannt , die mechanischen Eigenschaften des SC 6, 7, 8 zu verändern. Beispielsweise Tenside in kosmetischen Reinigungsmitteln enthalten sind, können deutliche Steigerungen der Elastizitätsmodul verursachen und einen Aufbau vonTrocknungsspannungen in SC, das Gewebe des Neigung zu erhöhen 7 zu knacken, 9. Glycerin in fast allen kosmetischen Moisturizer enthalten ist, kann SC erweichen und verringern die Bildung von Trocknungsspannungen 8, 10, 11, um die Wahrscheinlichkeit von Gewebebruch zu reduzieren. Das Verfahren in diesem Artikel beschrieben ist in der Lage , die dynamischen Trocknungsverhalten und mechanische Eigenschaften von SC Trocknung in kontrollierten Umgebungen 7, 8 zu quantifizieren. Bisher hat diese Technik wurde der Erläuterung der Auswirkung verschiedener kosmetischer Produkte auf Veränderungen in der dynamischen Trocknungsverhalten und mechanische Eigenschaften von SC Gewebe fähig zu sein demonstriert. Dies wird durch Quantifizieren Trocknungsinduzierte Schrumpfung von menschlichen SC Gewebe zu einem weichen Elastomersubstrat geklebt erreicht, passend Trocknungs Verschiebungen mit einer einfachenKontraktilität des Modells und anschließend den Elastizitätsmodul zu extrahieren und von der angepassten Profil Stress zu trocknen. Beim Testen mehrerer Proben SC erforderlich ist, bietet dieses Verfahren eine schnellere Alternative zu uniaxial tensometry nutzt deutlich weniger Gewebe und bietet mehrere physiologisch relevant Trocknung durch Verdampfung von der Probenunterseite verhindert wird.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer base</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>1064291</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer Curing Agent</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>1015311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate 0.1 &#181;m yellow green fluorescent 505/515&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F8803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate 1 &#181;m yellow green fluorescent 505/515&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F8823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate 1 &#181;m nile red fluorescent 535/575&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F8819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor type II-s</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9128</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221732</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0294</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6mm diameter hole punch</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z708860</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA 6-LCR-SB&#160;</td>
			<td>Lummencor light engine</td>
			<td>No.3526</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cfi Plan Achro Uw 1x Objective</td>
			<td>Nikon Plan UW</td>
			<td>MRL00012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Fluor 40x Oil Objective 1.3 na - 0.20mm wd</td>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>MRH01401</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-U inverted microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA53200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clara-E Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DR-328G-C02-SIL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Remote Focus Attachment E-RFA Ergo Design</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>99888</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-S-E Motorized Stage</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEC56110</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring and modeling contractile drying in human stratum corneum

Stratum corneum (SC) ist die oberflächliche Hautschicht. Dessen Kontakt mit der äußeren Umgebung bedeutet, daß diese Gewebeschicht auf beide Reinigungsmittel und täglichen Schwankungen in der Umgebungsfeuchtigkeit ausgesetzt wird; beide können den Wassergehalt des Gewebes zu verändern. Kürzungen in Wassergehalt von schweren Barrierestörung oder niedriger Luftfeuchtigkeit Umgebungen kann SC Steifigkeit verändern und einen Aufbau von Trocknungsspannungen verursachen. Unter extremen Bedingungen können diese Faktoren mechanischen Bruch des Gewebes verursachen. Wir haben eine hohe Durchsatzverfahren zur Quantifizierung von dynamischen Veränderungen in den mechanischen Eigenschaften von SC nach dem Trocknen hergestellt. Diese Technik kann verwendet werden, um Änderungen in der Trocknungsverhalten und mechanische Eigenschaften von SC mit kosmetischen Reinigungsmittel und Feuchthaltemittel-Behandlungen zu quantifizieren. Dies wird durch Messen dynamischen Variationen in ortsaufgelöste in-plane Trocknungs Verschiebungen von kreisförmigen Gewebeproben geklebt auf ein Elastomersubstrat erreicht. In-plane radiale Verschiebungen acquired während der Trocknung azimutal gemittelt und mit einem Profil versehen basierend auf einem linearen elastischen Kontraktionsmodell. Dynamische Änderungen in Trockenstress und SC Elastizitätsmodul kann dann aus den angepassten Modells Profilen entnommen werden.

1 (a) zeigt eine repräsentative Fluoreszenzbild eines SC - Probe beschichtet mit fluoreszierenden Kügelchen (Abschnitt 3). Die entsprechende Durchlichtbild der Probe in 1 gezeigt ist (b) mit einem Köcher Grundstück von räumlich aufgelösten Trocknungs Verschiebungen überlagert , dass aufgrund der Kreissymmetrie der Proben bei 25% relativer Luftfeuchtigkeit nach 16 h Trocknen bilden, können diese Verschiebungen sein azimutal gemitt...

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Measuring and Modeling Contractile Drying in Human Stratum Corneum

in der Ebene räumlich aufgelösten Trocknungs Verschiebungen von kreisförmigen Gewebeproben geklebt auf ein Elastomersubstrat Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur dynamischen Trocknungsverhalten und die mechanischen Eigenschaften des Stratum corneum Quantifizierung durch Messung. Diese Technik kann verwendet werden, um zu messen, wie verschiedene chemische Behandlungen Trocknen und Gewebe mechanischen Eigenschaften verändern.

Messung und Modellierung Kontraktile Trocknung im Bereich Human Stratum corneum

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.5K Aufrufe.  Binghamton University.  in der Ebene räumlich aufgelösten Trocknungs Verschiebungen von kreisförmigen Gewebeproben geklebt auf ein Elastomersubstrat Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur dynamischen Trocknungsverhalten und die mechanischen Eigenschaften des Stratum corneum Quantifizierung durch Messung. Diese Technik kann verwendet werden, um zu messen, wie verschiedene chemische Behandlungen Trocknen und Gewebe mechanischen Eigenschaften verändern. 

Serie: Measuring and Modeling Contractile Drying in Human Stratum Corneum

Measuring Left Ventricular Pressure in Late Embryonic and Neonatal Mice

Blood pressure increases significantly during embryonic and postnatal development in vertebrate animals. In the mouse, blood flow is first detectable around embryonic day (E) 8.51. Systolic left ventricular (LV) pressure is 2 mmHg at E9.5 and 11 mmHg at E14.52. At these mid-embryonic stages, the LV is clearly visible through the chest wall for invasive pressure measurements because the ribs and skin are not fully developed. Between E14.5 and birth (approximately E21) imaging methods must be used to view the LV. After birth, mean arterial pressure increases from 30 - 70 mmHg from postnatal day (P) 2 - 353. Beyond P20, arterial pressure can be measured with solid-state catheters (i.e. Millar or Scisense). Before P20, these catheters are too big for developing mouse arteries and arterial pressure must be measured with custom pulled plastic catheters attached to fluid-filled pressure transducers3 or glass micropipettes attached to servo null pressure transducers4.
Our recent work has shown that the greatest increase in blood pressure occurs during the late embryonic to early postnatal period in mice5-7. This large increase in blood pressure may influence smooth muscle cell (SMC) phenotype in developing arteries and trigger important mechanotransduction events. In human disease, where the mechanical properties of developing arteries are compromised by defects in extracellular matrix proteins (i.e. Marfan's Syndrome8 and Supravalvular Aortic Stenosis9) the rapid changes in blood pressure during this period may contribute to disease phenotype and severity through alterations in mechanotransduction signals. Therefore, it is important to be able to measure blood pressure changes during late embryonic and neonatal periods in mouse models of human disease.
We describe a method for measuring LV pressure in late embryonic (E18) and early postnatal (P1 - 20) mice. A needle attached to a fluid-filled pressure transducer is inserted into the LV under ultrasound guidance. Care is taken to maintain normal cardiac function during the experimental protocol, especially for the embryonic mice. Representative data are presented and limitations of the protocol are discussed.

Measuring left ventricular pressure (LV) in embryonic and neonatal mice is described. Pressure is measured by inserting a needle connected to a fluid-filled transducer into the LV under ultrasound guidance. Care must be taken to maintain normal cardiac function during the experimental protocol.

Die Messung linksventrikulärer Druck in der späten embryonalen und neugeborenen Mäusen

Blood pressure increases significantly during embryonic and postnatal development in vertebrate animals. In the mouse, blood flow is first detectable ...

Forschung

Biotechnik

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen<em&gt; In-vitro-</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Herstellung, Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten von 3D-Tissue-Engineering Menschen Ösophagus-Schleimhaut-Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

Methoden zur Selbst Integration von Megamolecular Biopolymere auf der Trocknungsluft-LC-Schnittstelle

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Microhoneycomb Monoliths Prepared by the Unidirectional Freeze-drying of Cellulose Nanofiber Based Sols: Method and Extensions

Monolithic honeycomb structures have been attractive to multidisciplinary fields due to their high strength-to-weight ratio. Particularly, microhoneycomb monoliths (MHMs) with micrometer-scale channels are expected as efficient platforms for reactions and separations because of their large surface areas. Up to now, MHMs have been prepared by a unidirectional freeze-drying (UDF) method only from very limited precursors. Herein, we report a protocol from which a series of MHMs consisting of different components can be obtained. Recently, we found that cellulose nanofibers function as a distinct structure-directing agent towards the formation of MHMs through the UDF process. By mixing the cellulose nanofibers with water soluble substances which do not yield MHMs, a variety of composite MHMs can be prepared. This significantly enriches the chemical constitution of MHMs towards versatile applications.

Here, we present a general protocol to prepare a variety of microhoneycomb monoliths (MHMs) in which fluid can pass through with an extremely low pressure drop. MHMs obtained are expected to be used as filters, catalyst supports, flow-type electrodes, sensors and scaffolds for biomaterials.

Microhoneycomb Monolithen vorbereitet durch die unidirektionale Gefriertrocknung von Zellulose Nanofaser basierte Sols: Methode und Erweiterungen

Monolithic honeycomb structures have been attractive to multidisciplinary fields due to their high strength-to-weight ratio. Particularly, microhoneycomb ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Elektrische und magnetische Feldgeräte zur Stimulation biologischer Gewebe

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...