Das Office of Science and Engineering Laboratories der FDA entwickelt regulatorische wissenschaftliche Instrumente, um Entwickler von Medizinprodukten und FDA-Prüfer zu unterstützen. Unser oberstes Ziel ist es, den Zugang von Patienten zu innovativen, sicheren und wirksamen Medizinprodukten durch die besten verfügbaren wissenschaftlichen Erkenntnisse zu beschleunigen. In diesem Protokoll wenden wir modernste induzierte pluripotente Stammzelltechnologie auf die Bewertung von Medizinprodukten an, die zur Behandlung lebensbedrohlicher Herzerkrankungen eingesetzt werden.
Dieses einfache Tool ermöglicht die reproduzierbare Auswertung von kardialen elektrophysiologischen Geräten in der Schale unter Verwendung von Standard-Laborgeräten. Es kann auch mit patientenspezifischen Zellen verwendet werden, die von Spendern mit verschiedenen Herzerkrankungen stammen. Zu Beginn werden die aufgetauten humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mindestens zwei Tage vor dem Aussäen der Kardiomyozyten auf das flexible Hydrogelsubstrat auf 0,1%ig gelatinebeschichtete sterile Sechs-Well-Platten aufgetragen.
Kultivieren Sie die humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten zwei bis vier Tage lang in Standard-Kardiomyozytenmedium bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, damit sie sich von der Kryokonservierung erholen können. Erfrischen Sie das verbrauchte Medium alle 48 Stunden mit 100% Kardiomyozytenmedium. Überprüfen Sie den Status der von menschlichen iPSC abgeleiteten Kardiomyozyten vor der Dissoziation, indem Sie die Gesundheit der Zellen bewerten, um die Lebensfähigkeit und das stabile Schlagen sicherzustellen.
Waschen Sie die Kardiomyozyten mit vier Millilitern DPBS pro Vertiefung ohne Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid. Geben Sie einen Milliliter Dissoziationsreagenz bei Raumtemperatur in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes geben Sie 10 Milliliter Kardiomyozytenmedium in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Dissoziieren Sie die Kardiomyozyten mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette von den Sechs-Well-Platten und geben Sie die Zellsuspension in das konische Röhrchen. Spülen Sie die Vertiefungen mit einem Milliliter frischem Kardiomyozytenmedium, um alle verbleibenden Kardiomyozyten zu sammeln, und geben Sie sie in das konische Röhrchen. Bringen Sie dann das Endvolumen des konischen Röhrchens mit dem Medium auf 15 Milliliter.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 200 G und entfernen Sie den Überstand bis zur Ein-Milliliter-Marke. Resuspendieren Sie die Zellen im Kardiomyozytenmedium auf ein Endvolumen von fünf Millilitern und zählen Sie die Kardiomyozyten mit einem manuellen oder automatisierten Zellzähler. Anschließend wird die Kardiomyozyten-Zellsuspension etwa 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, während die flexiblen Hydrogelsubstrate hergestellt werden.
Bereiten Sie eine 20-Mikroliter-Pipette mit einem Mikroliter, Pipettenspitzen, eine sterile 48-Well-Glasbodenplatte und einen Stoppuhr-Timer in der Gewebekulturhaube vor. Mischen Sie die extrazelluläre Matrix oder das ECM-basierte Hydrogelsubstrat, indem Sie vorsichtig auf das Röhrchen klopfen und es sofort wieder auf Eis legen. Starten Sie den Stoppuhr-Timer unmittelbar vor dem Beschichten des ersten Hydrogelsubstrats und markieren Sie dies als Zeit Null.
Pipettieren Sie einen Mikroliter des Hydrogelsubstrats etwa dreimal auf und ab, um die Pipettenspitze zu kühlen. Tragen Sie dann etwa einen Mikroliter des unverdünnten Hydrogelsubstrats horizontal auf den Boden jeder Vertiefung in der 48-Well-Platte auf und halten Sie die Pipette in einem Winkel von 45 Grad. Plattieren Sie alle Hydrogelsubstrate in jeder Vertiefung in der gleichen Ausrichtung, um das Substrat bei der Durchführung der Experimente bei 40-facher Vergrößerung zu identifizieren.
Setzen Sie den Deckel auf die 48-Well-Platte und lassen Sie die Hydrogelsubstrate acht bis 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Gewebekulturhaube inkubieren, bevor Sie die Zellen hinzufügen. Nach der Inkubation werden die Kardiomyozyten sofort mit etwa 30.000 lebensfähigen Kardiomyozyten pro Vertiefung in einem geringen mittleren Volumen von etwa 200 Mikrolitern Kardiomyozytenmedium tropfenweise direkt auf die Hydrogelsubstrate gesprüht. Lassen Sie die Kardiomyozyten nach dem Schließen des Deckels 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur in der Haube ungestört inkubieren, damit die Zellen am Hydrogelsubstrat haften können.
Geben Sie vorsichtig 100 Mikroliter frisches Kardiomyozytenmedium in jede Vertiefung. Legen Sie den geschlossenen Deckel für zwei bis vier Tage auf einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Schalten Sie das Mikroskop und die Umgebungskontrollkammer ein, um sich auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zu äquilibrieren.
Entfernen Sie das Kardiomyozytenmedium von der 48-Well-Platte und spülen Sie jede Vertiefung zweimal vorsichtig mit 600 Mikrolitern des kardialen Kontraktilitätsmodulations- oder CCM-Assaymediums aus. Fügen Sie dann 300 Mikroliter CCM-Assaymedium pro Well hinzu und legen Sie die 48-Well-Platte auf das Mikroskop in der Umgebungskontrollkammer. Führen Sie die Elektroden ein und balancieren Sie die Zellen fünf Minuten lang.
Um die Kontraktionsvideos mit videobasierter Mikroskopie aufzunehmen, öffnen Sie die Videoaufzeichnungssoftware und stellen Sie eine Bildrate von 100 Bildern pro Sekunde ein. Wählen Sie dann einen Bereich von Interesse oder ROI in der Nähe der Mitte des hiPSC-CM-Monolayers aus. Dann stimulieren Sie die Zellen mit einem kommerziellen Impulsgenerator, um die 2D-Kardiomyozyten-Monoschichten elektrisch zu bewegen.
Platzieren Sie den Kardiomyozyten auf dem 1,5-fachen Schwellenwert bei einem Hertz mit Ausgangspulsparametern. Zum Beispiel monophasische Rechteckwellen-Stimulationsimpulse mit einer Stimuluspulsdauer von zwei Millisekunden von fünf Volt. Nehmen Sie das Baseline-Pacing-Only-Kontraktionsvideo vor dem CCM für mindestens fünf Schläge auf.
Stimulieren Sie dann die Kardiomyozyten-Monoschicht mit einem experimentellen elektrischen Signal von 30 Millisekunden Verzögerung, zwei symmetrischen biphasischen Impulsen mit einer Phasendauer von 5,14 Millisekunden mit einer Gesamtdauer von 20,56 Millisekunden, einer Phasenamplitude von 10 Volt und einem Interphasenintervall von Null. Nehmen Sie das CCM-induzierte Kontraktionsvideo für mindestens fünf Schläge auf. Schalten Sie das CCM-Signal aus, stimulieren Sie mit einem Basisimpuls und nehmen Sie ein Kontraktionsvideo der Erholungsphase nach dem CCM für mindestens fünf Schläge auf.
Verwenden Sie eine Standard-Kontraktionssoftware, um die Kontraktionsvideos automatisch zu analysieren und die wichtigsten kontraktilen Eigenschaften wie Kontraktionsamplitude, Kontraktionssteigung, Relaxationssteigung, Zeit bis zum Höhepunkt, Zeit bis zum Ausgangswert 90% und Kontraktionsdauer 50% zu quantifizieren. Die Anwendung der Standard-CCM-Stimulationsparameter führte zu verbesserten kontraktilen Eigenschaften in vitro. Die Auswirkungen der Modulation der extrazellulären Calciumkonzentrationen auf die kontraktilen Eigenschaften des Menschen mit und ohne CCM-Stimulation wurden untersucht.
Die erwartete Calciumabhängigkeit der Kontraktion zu Studienbeginn wurde beobachtet, ebenso wie ein CCM-induzierter Anstieg der Calciumsensitivität auf der Ebene der Kardiomyozytenmonoschicht. Darüber hinaus ergab die pharmakologische Untersuchung des beta-androgenen Signalwegs, dass die CCM-induzierten inotropen Effekte teilweise durch beta-adrenerge Signalwege vermittelt wurden. Darüber hinaus kann dieses Werkzeug auf patientenspezifische Krankheitskardiomyozyten ausgeweitet werden, einschließlich derjenigen der dilatativen Kardiomyopathie, um die Wirkung von CCM im Kontext von Krankheitszuständen zu verstehen.
Hier konzentrieren wir uns in erster Linie auf die Bewertung der kontraktilen Eigenschaften des Menschen. Mit diesem Tool könnte man jedoch auch andere Kopplungswerte für die kardiale Erregung bewerten, einschließlich Aktionspotentiale und Kalziumhandhabung. Dies ist das erste regulatorische wissenschaftliche Instrument, das induzierte pluripotente Stammzellen durch Technologie mit der Bewertung von Herzgeräten kombiniert.
Diese alternative Methode ebnet den Weg für die Bewertung von Medizinprodukten in einer Schale und hat das Potenzial, den Bedarf an Tier- und Humantests zu reduzieren.
