This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.

Beschriften Sie die Behälter für die Muskelspeicher mit entsprechenden Kennungen für die Tier-und Muskel geerntet werden. Pre-kühlen die Säcke / Behälter und Instrumente, um Einfrieren / Auftauen des Gewebes zu verhindern, wenn es zugegeben wird. 1. Studiendesign Überlegungen für Muskelgewebe Sammlung <ol><li> Für kleine Tier (Maus-) Modelle der Muskelerkrankung, verwenden Sie eine ganze Muskel für die Studie, da kleine Tiermodelle erfordern oft Auswertung eines gesamten Muskel, um eine ausreichende myofiber Probenahme für die pathologischen Studien. Für Großtier (Hund) Modelle Muskelerkrankung, Muskelabschnitte verwenden, die mindestens 0,3 x 0,3 cm oder mehr in ihre Querrichtung (Querschnitts-) Aspekt sind. HINWEIS: Core-Biopsien kann auch verwendet werden, kann aber nicht optimal für die primäre Charakterisierungsstudien durch Probenahme Themen sein. </li><li> Für Studien, die die Sarkomer kann die Messung von ultra Sarkomerlänge eine kritische Endpunkt umfassen und kann require spezialisiert Handhabung. Dies ist normalerweise nur bei Erkrankungen relevant, wenn Elemente der Show Sarkomer unangebracht Längen, wie in einigen Ursachen der Nemalin Myopathie. Manche Labors lieber Muskel in seinem nicht vertraglich oder gestreckten Zustand zu beheben, anstatt diese Messungen auf nicht gespannt oder nicht gedehnte Muskeln. <ol><li> Wenn Sarkomerlänge wird nicht gemessen werden kann, beheben das Muskelgewebe ohne Vorstrecken der Muskel, indem Sie es direkt in die gewünschte EM Fixiermittel (siehe Reagenzien). </li><li> Wenn Sarkomer Längen gemessen werden, können verschiedene Techniken vor, dehnen die Muskeln (siehe Diskussion) verwendet werden: <ol><li> Verwenden Sie eine Spannvorrichtung, um den Muskel zu seiner Ruhe Spannung zu halten, während es noch in der Tier, auszuschneiden die Muskeln um die Außenseite der Klemme, und legen Sie sie direkt in die gewünschte EM Fixiermittel (siehe Reagenzien). </li><li> Strecken und Pin den Muskel zu einer Oberfläche (zB ein Stück Kork) bei einer Länge entsprach derjenigen <em&gt; in vivo, nachdem es von dem Tier entnommen. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Unterteilung des isolierten Skelettmuskel in Fragmente, die für die entsprechende Wunsch Studien sind (Abbildung 1) <ol><li> Für gefrorene Muskel Histologie: <ol><li> Fügen Sie so viel von einem bestimmten Muskel wie möglich Sampling Bias zu minimieren (siehe Schritt 1.1), aber Proben sollten 1,5 cm Vereisung zu vermeiden Artefakte &lt;. </li><li> Behandeln alle Muskeln aus der gleichen Studie ähnlich artifactual Unterschiede in der Fasergröße aufgrund der Unterschiede in der Handhabung zu verhindern. </li></ol></li><li> Für die Elektronenmikroskopie (EM): <ol><li> Schnitt ein ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm Streifen aus Muskel aus der Probe, die mit der Längsachse der Probe parallel zur Längsachse des ursprünglichen Muskel. Hinweis: Das Fixiermittel wird nicht ausreichend durchdringen dickeren Gewebestücken, so dass die Aufrechterhaltung der Probendicke von 2 mm oder weniger ist wesentlich, um entsprechende Ergebnisse. Zusätzlichals Orientierung wie kleine Fragmente von Muskel ist oft schwierig ist, ist es ratsam, ein Fragment von Gewebe, das die tatsächliche Ausrichtung des Muskels (dh die längste Aspekt der fixierten Probe die Längsorientierung der Muskel / Muskelfasern) zu verwenden nachahmt Handling zu minimieren und Verwirrung während EM-Verarbeitung. </li></ol></li><li> Für die Zellkultur: <ol><li> Die gewünschte Zellausbeute kann die Menge der Muskelzellkultur-Einrichtung erforderlich beeinflussen. Einzelne Muskeln (oder Teile von Muskeln) von kleinen Tieren unzureichend Zellzahlen zu Zellkulturen herzustellen bereitzustellen, so dass, wenn notwendig, Pool Gewebe aus mehreren Muskeln. </li></ol></li></ol> 3. Gewebefixierung und-verarbeitung für Elektronenmikroskopie (EM) <ol><li> Legen Sie ein Fragment des Muskel nicht mehr als 2 mm in seiner dünnsten Dimension direkt in die gewünschte EM Fixiermittel (siehe Reagenzien). </li><li> Setzen Sie den Muskel im EM Fixierungspuffer (siehe Reagenzien) nach 2-48 h fixatiauf. Längerer Fixation (für Wochen oder Monate) kann zum Verlust von ultra Detail auf EM-Studien führen. </li><li> An einer EM-Core Facility für die Verarbeitung. </li></ol> 4. Muscle Einfrieren für histologische, biochemische und molekularbiologische Untersuchungen <ol><li> Entfernen Sie übermäßige Feuchtigkeit in der Probe durch gründliches Abtupfen der Probe mit einem Papiertuch, bis das Gewebe ist etwas verwachsen das Handtuch. Übermäßige Feuchtigkeit erhebliche Einfrieren Artefakte in den Muskel zu produzieren. HINWEIS: Gewebe kann weiter durch Rollen in Babypuder getrocknet werden. Dieser Schritt ist in der Regel nicht notwendig, für die Muskeln, wenn sie nicht in einer übermäßig feuchten Umgebung gewesen. </li><li> Zeigen Oktober (oder eine ähnliche Klebstoff, wie Tragant) im Boden eines flachen cryomold oder Kork, mit nur genug Oktober, um eine Grundlage für die orientierten Muskel (2C) zu liefern. Beschriften Sie den Korken oder cryomold vor dem Einfrieren kann nützlich sein für die Probenverfolgung. </li><li> CAREFUlly legen den Muskel in die Form in der gewünschten Orientierung, mit der Mehrheit der Muskel von OAT vorsteht, so dass geschnittene Muskel ist nicht in Kontakt mit OCT (Fig. 2C). </li><li> Hinzufügen Isopentan zu einem Metallbecher, bis sie eine Tiefe von etwa 3-4 cm erreicht. </li><li> Setzen Sie auf Wärmeschutzhandschuhe und entfernen Sie den Deckel des Dewar. </li><li> Platzieren oder Halten des Metallbecher in Kontakt mit dem flüssigen Stickstoff, so daß der Pegel von flüssigem Stickstoff an der Außenseite des Bechers über dem Niveau des Isopentan auf der Innenseite der Schale ist. Strategien, um diese Behälter anzuordnen sind in Abbildung 2 dargestellt. <ol><li> Lassen Sie keine flüssigen Stickstoff, um die Metallschale geben, wie es erzeugt einen sprudelnden Schaum, der schwerfällig, um mit zu arbeiten (und ist auch nicht ausreichend kalt für Einfrieren). </li></ol></li><li> Beachten Sie die Isopentan zu bestimmen, wenn es die geeignete Temperatur erreicht hat. Bei der geeigneten Temperatur (optimal zwischen -140 bis -149 ° C), so dassDeckel weiße Kieselsteine ​​von Isopentan gefroren wird gebildet (nach einigen Minuten, und nachdem die anfängliche Schleier oben Isopentan verschwunden ist) auf der Unterseite der Schale, oder die Lösung wird in der Regel verdickt, um die Konsistenz von Melasse. Einfrieren vor dieser Etappe wird Einfrieren atifacts ergeben. <ol><li> Wenn das Isopentan ganz friert, es taut und Chill-Gefriertemperaturen wieder, bevor die anschließende Verwendung. </li></ol></li><li> Mit vorgekühlten Pinzette, senken Sie die Probe und Kork / Form in die Isopentan für ca. 10-20 Sekunden. </li><li> Legen Sie die gefrorene Probe in einen vorgekühlten Behälter. </li><li> Halten Sie Probe und Behälter auf Trockeneis zu allen Zeiten bis zum Transfer zu einem -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol> 5. Wenn Freezing Artefakt ist bereits Gegenwart in gefrorenem Gewebe, ist es möglich, den Grad der Verbesserung Freezing Artefakt mit dem folgenden &quot;auftauen und wieder einfrieren&quot; Verfahren <ol><li> Nehmen Sie Blöcke aus dem Tiefkühlfach, ein zu einer ZeitUnd halten sie auf Trockeneis. Der Zeitpunkt dieses Protokoll ist kritisch. Nur auftauen und wieder einfrieren einen Block zu einem Zeitpunkt. </li><li> Bewegen Probe von Trockeneis auf RT. </li><li> Wenn die Probe in OCT eingebettet ist, entfernen Sie die umliegenden Oktober so vollständig wie möglich mit einem Skalpell. </li><li> Die Probe wird bei Raumtemperatur bis zu dem Punkt, wo es vollständig aufgetaut ist auftauen, aber nicht bis zu dem Punkt, wo es austrocknet. <ol><li> Sanft prod der Probe mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass die Probe vollständig vor der in die nächste Stufe aufgetaut. </li></ol></li><li> Frieren Sie das Muskel wie in Schritten von 4,1 bis 4,10 angegeben. </li></ol> 6. Vorbereitung der Muskel für Skinned Single Fiber Functional Testing <ol><li> Das Speicherverfahren für die Muskel hängt, wenn der Muskel / Faser wird für die Experimente verwendet. <ol><li> Für den Einsatz innerhalb von wenigen Wochen, legen Sie den Muskel in einer Lösung von 50% glycerol/50% entspannenden Lösung (siehe Reagenzien), und bei -20 ° C </li><li> Für den Einsatz achterner ein paar Wochen, legen Sie den Muskel in einer Lösung von 75% glycerol/25% entspannenden Lösung (siehe Reagenzien) und bei -80 ° C </li><li> Alternativ lassen Muskel trocken, Stift Kork, und speichern auf Silica-Granulat bei -80 ° C Diese dehydriert Muskeln kann über Jahre verwendet werden. </li></ol></li></ol> 7. Vorbereitung von Fresh Muscle für den Versand der Zellkultur bis Aussen Laboratories Protokolle für die Etablierung von Zellkulturen wurden an anderer Stelle 4-7 gut beschrieben worden. <ol><li> Füllen Sie eine 50 ml konischen Röhrchen mit sterilen sterile komplette Wachstumsmedien. </li><li> Fügen Sie die Muskeln an der Röhre mit einer sterilen Pinzette, das Gewebe in Medien Notlaufeigenschaften. <ol><li> Füllen des Rests des Rohrs mit Medien Trocknung während des Transports zu verhindern. </li></ol></li><li> In Eisbeutel auf die Styropor-Box und legen Sie die konischen Rohr in der Nähe mehrere Eisbeutel. <ol><li> Bitte beachten Sie, dass nur Eisbeutel (und nicht Trockeneis) verwendet werdenum Schäden durch Gefrieren der Flüssigkeit und Gewebe zu verhindern. </li></ol></li><li> Schiffs Pakete O / N, aber Gewebe können 2 Tage unter diesen Bedingungen dauern. </li></ol>

<ol>
	<li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, 407-442 (2007).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+replacement+therapy+rescues+weakness+and+improves+muscle+pathology+in+mice+with+X-linked+myotubular+myopathy.">Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy.</a> Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).</li><li>Talmadge, R. J., Roy, R. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+tropomyosin+3+(TPM3)+are+common+and+associated+with+type+1+myofiber+hypotrophy+in+congenital+fiber+type+disproportion.">Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion.</a> Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Skelettmuskel ist ein strukturell und funktional einzigartige Gewebe und spezialisierte Herstellungsverfahren erforderlich, um die optimale Beurteilung der strukturellen und funktionellen Parameter erlaubt sind. Während eine Vielzahl von Geweben werden üblicherweise für pathologische Untersuchungen in klinischen und Forschungskontexten gefroren Gefrierverfahren für Nicht-Muskelgewebe gewöhnlich die Gesamteintauchen des Gewebes in OCT vor dem Einfrieren. Wie in Fig. 3 gezeigt ist, ist ein solches Protokoll für die pathologische Bewertung der Skelettmuskel nicht geeignet und ist ähnlich genug ist, um das hier beschriebene Protokoll, dass dies eine häufig auftretende Fehler vorhanden. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein einfaches Protokoll für den richtigen Umgang mit Muskel bieten, um Fragen wie diese zu vermeiden. Beratung ist auch auf die richtige Handhabung der Muskel für Off-Site-physiologischen und zellulären Studien in dem Bemühen, den Erwerb von qualitativ hochwertigen Daten, die von außerhalb der Kern Labors, erleichtern zusammengestellt where Vor-Ort-Studien sind nicht bevorzugt oder möglich ist. Wie in diesem Protokoll angegeben, Elemente, die für die pathologische Studien in der richtigen Verarbeitung von Muskel unbedingt erforderlich sind, umfassen eine Minimierung der Wassergehalt des Gewebes, die Verringerung der Temperatur, bei der der Muskel eingefroren, und die Erhöhung der Geschwindigkeit, mit der Gefrierpunkt erreicht wird. Mäßiger Feuchtigkeit im Gewebe oder übermäßige Langsamkeit des Gefrierprozesses (durch unzureichende Temperaturen oder durch fehlende direkte Kontakt zwischen der Vereisungsmittel und dem Gewebe, hergestellt als mit flüssigem Stickstoff angetroffen wird) wird dem Einfrieren Artefakte, die pathologische Analyse beeinträchtigen können. Wie Oktober eine zusätzliche Quelle der Feuchtigkeit der Gewebe, viele Labors verwenden andere Klebstoffe wie Tragant als Einbettungssubstrat. Selbst in Fällen, wo das Gefrieren angemessen durchgeführt wird, sollte darauf geachtet werden, um anschließend zufällig Auftauen Proben durch Kontakt mit RT Behälter oder Instrumente zu vermeiden.So eine erfolgreiche Gefrierprozess erfordert ein gewisses Maß an Planung, die eine Pre-chilling aller Instrumente und Behälter verwendet werden umfasst. Beim Einfrieren Artefakte auftreten, besteht die für die Wiederherstellung des Gewebes, das für die meisten pathologischen Bewertungen hier beschriebenen Verfahren. Allerdings bedeutet dies Frost / Tau-Zyklus nicht bieten perfekte Histologie und hat das Potenzial, andere molekulare oder enzymatische Untersuchungen des Gewebes (zusätzlich zu der Zeit benötigt, um wieder einfrieren das Gewebe) beeinträchtigen, so mit geeigneten Anfangs Einfrieren Praktiken vorziehen, . In Fällen, in denen das Einfrieren Artefakte auf vorgefrorene Gewebe angetroffen wird jedoch die hier beschriebene Technik kann sehr nützlich sein. Fixierung und Verarbeitung von Gewebe für die EM können bestimmte technische Herausforderungen, die Planung vor der Gewebesammlung erfordern bieten. Der häufigste Fehler beim Sammeln von Proben für die EM ist die Verwendung von Gewebefragmente, die zu dick sind für Glutaraldehyde zu durchdringen. Wie Glutaraldehyd dringt nur etwa 0,1 cm in das Muskelgewebe aus einer gegebenen Oberfläche, sollte darauf geachtet werden, dass eine Dimension der EM Proben nicht dicker als 0,2 cm. Zusätzlich, wie EM ist ein ausgezeichnetes Mittel zur direkten Auswertung des kontraktilen Apparates, einige Forscher haben Strategien entwickelt, um vorspannen oder Vorstreckung der Muskel vor der Fixierung, um die Messung der kontraktilen Elemente bei einem physiologisch relevanten Spannung zu ermöglichen. Es gibt kein Standardprotokoll für die Vorspannung, sondern zwei Strategien werden kurz in diesem Protokoll beschrieben. Es ist zu beachten, dass vor Spannen der Muskel kann zu unvorhersehbaren Ergebnissen führen, wenn sie nicht in einer ganz bestimmten Art und Weise getan, und es kann von Vorteil sein, die Muskeln im schlaffen Zustand zu fixieren, um Artefakt Veränderungen in Sarkomerlänge durch einen Nicht-Standard zu verhindern versucht werden Vorspannverfahren 8,9. Für Muskeln, in denen diese spezifischen Messungen sind nicht erforderlich (einschließlich der meisten biopsies für klinische Zwecke durchgeführt), Anstrengungen zur Vorspannung des Muskels in der Regel nicht aus, und die Hauptwirkung auf Muskel-Morphologie ist eine nicht-gleichförmigen Abstand von Sarkomeren in den Muskel. Dieses Papier stellt die erste in einer Reihe auf SOPs für die Durchführung von Prüfungen im Bereich angeborene Muskelerkrankungen bereitzustellen, und es steht für die Bemühungen von mehr als 20 Experten in der angeborenen Muskelerkrankung Feld, die routinemäßig zelluläre, molekulare, funktionelle, physiologische durchzuführen, und pathologische Forschung. Eine Reihe von SOPs veröffentlicht wird im kommenden Jahr zur Verfügung gestellt werden, und die notwendigen Protokolle und geeignete Formate für jede Veröffentlichung wurden mit einer angeborenen Muskelerkrankung Consortium Werkstatt im April 2013 in Washington DC erörtert Das Ziel dieser Bemühungen ist es, SOP bieten ein Fahrplan für die notwendige Prüfung und Analyse der Proben im Bereich angeborene Muskelerkrankung zu 1) zu standardisieren, die Praktiken und Endpunkte in unserem Bereich als m verwendetuch wie möglich, und 2) bieten Unterricht auf Standard-Verfahren für neue Forscher in unserem Bereich. Wir glauben, dass diese Ressourcen den Markteintritt neuer Ermittler in unsere untersuchten Bereich zu erleichtern und verbessern so den Umfang der Forschung, die durchgeführt werden können. Zusätzlich wird eine Vereinheitlichung der Praxis als äußerst hilfreich, um Daten über Studien zu vergleichen und identifizieren Endpunkte bei der Planung und Durchführung von präklinischen und klinischen Studien. Auch wenn der Schwerpunkt dieses Artikels wird in den entsprechenden Einfrieren und Vorbereitung von Gewebe für eine Vielzahl von Studien verwandt, unsere gemeinsame Gruppe diskutierte auch über die nützliche Endpunkte für den pathologischen Analyse von Muskel-Proben. Derzeit gibt es keine offizielle Konsens über die Vorgehensweise bei der Durchführung von pathologischen Analyse zu nehmen, und eine Vielzahl von verschiedenen Studien werden durchgeführt, um neue Erkenntnisse zu früheren Publikationen für die jeweiligen Krankheiten beziehen. So, dachten wir, dass es sinnvoll zu sein,einige allgemeine Richtlinien für die Planung von pathologischen Endpunkten in Muskel Pathologie Charakterisierung vorschlagen. Vor der Quantifizierung der Pathologie in einer Studie, sollten erhebliche Gedanken in 1 die Methode der Fasergrößenmessung gestellt werden), 2) die Möglichkeit, Fasertyp-spezifischen Anomalien oder Behandlungseffekte, 3) die Möglichkeit, Anomalien oder Effekte, die eingeschränkt werden die einzelnen Muskeln und 4) eine Strategie zur Quantifizierung pathologische Befunde, die charakteristisch für die Krankheit untersucht werden. Fiber ist eine notwendige Größe Endpunkt für die meisten Studien, und leider gibt es umfangreiche Variation, wie es quantifiziert wird. Viele Studien berichten diese Ergebnisse mit Hilfe automatisierter Verfahren zur Quantifizierung von proprietären Imaging-Software zur Verfügung gestellt, aber viele dieser Programme nehmen Abkürzungen (wie unter der Annahme, dass die Fasern Kreise oder Ellipsen), die diese automatisierten Messungen ungenau wiedergeben können. Es ist notwendig zu verstehen, wie diese automatisierte Programme machen ihre Messungen bevor mit Vertrauen in den Messungen, und wir ermutigen die Ermittler, diese Details in Papier Methoden umfassen. Zusätzlich ist die spezifische Messung verwendet, um Fasergröße bezeichnen äußerst variabel, und einige Daten sind gegenüber anderen bevorzugt 10,11. Eine häufig verwendete Messung der Fasergröße ist der Faserquerschnittsfläche (CSA), vor allem, weil die Ermittler Durchführung physiologische Studien zu standardisieren ihre Ergebnisse CSA Messungen mit ihren Instrumenten erhalten. Leider, während CSA Messungen genau widerspiegeln Fasergröße in perfekter Querschnitten, sind sie weitgehend abhängig von der Faserorientierung (in dem Maße, längs oder schräg geschnittene Fasern künstlich hoch CSA Messungen) und sind somit nicht ideal für Messungen Fasergröße. Eine bevorzugte Messung der Fasergröße, die weniger abhängig von der Faserquerschnittsfläche ist die minimale Feret-Durchmesser (MinFeret Durchmesser), die die Messung von the-Moll Durchmesser in der Muskelzelle 12. Die Messung ist nur wenig abhängig von Faserorientierung und ist in der Regel die klinische Goldstandard für Lichtmessung, und Ermittler sind aufgefordert, auf die Verwendung dieser Technik zu bewegen. Diese Messungen können häufig unter Verwendung der gleichen Software, die CSA Messungen 13 erzeugt werden, und sind auch einfach manuell zu messen. In Bezug auf die Bewertung der pathologischen Daten nach Fasertyp, bestimmte Muskel, und im Rahmen der pathologischen Befunde von der jeweiligen Krankheit bezogen, das sind weniger kontroversen Themen, die gerade bei der Planung einer Studie berücksichtigt werden sollten. Fasertyp kann unter Verwendung immunhistochemischer oder ATPase-Färbung ausgewertet werden, aber es ist sinnvoll zu berücksichtigen, dass bestimmte Muskeln und Tierarten haben spezielle Mischungen dieser Fasertypen (also erfordern unterschiedliche Erwartungen und Teststrategien). Muskel-spezifischen pathologischen Beteiligung oder die Wirksamkeit der Behandlungauftreten können, und die Gesamtmuskelmasse im Vergleich zu Kontrollen verwendet werden, um den Grad der Heterogenität der Krankheit vor der Entscheidung über die Muskeln, um krankhaft bewerten zu identifizieren. Schließlich ist es bekannt, dass viele Muskelkrankheiten mit spezifischen pathologischen Veränderungen (wie Nemalin Stangen Nemalin Myopathie) 14,15 verbunden ist, und so ist es auch nützlich, um zu prüfen, ob diese Abweichungen werden in einem Fasertyp-oder Muskel gefunden spezifische Verteilung bei der Durchführung der Analyse 16,17. Insgesamt, während wir eine unflexible Reihe von Standards für die Bewertung der Muskel nicht vor, so glauben wir, dass diese Fragen vor der Durchführung von pathologischen Untersuchungen in jeder Skelettmuskelerkrankung angesehen werden.

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation. 
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models. 
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1111">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device</td>
			<td style="width:107px;">Custom Biogenic Systems</td>
			<td style="width:115px;">Lab-5 Series</td>
			<td>Any other liquid nitrogen dewar could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Cold-conductive container</td>
			<td style="width:107px;">Fisher</td>
			<td style="width:115px;">02-583A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Nalgene</td>
			<td style="width:115px;">4150-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer</td>
			<td style="width:107px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:115px;">1228Y01</td>
			<td>Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For single fiber functional testing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">08-757-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sylgard coating</td>
			<td style="width:107px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:115px;">&#160;3-6636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Dissection stereomicroscope</td>
			<td style="width:107px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:115px;">693101</td>
			<td>Any other dissection microscope could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile laminar flow hood</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:115px;">51022485</td>
			<td>Any other cell culture hood could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Materials</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Plastic bags/containers</td>
			<td style="width:107px;">Nasco</td>
			<td style="width:115px;">B01009WA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Thermal safety gloves</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">G4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Face shield</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">S47640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Long forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">&#160;12-460-807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Marker</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td style="width:115px;">125328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Sterile 50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">C1060-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">PES filter unit, 500 mL, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">F5227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">644320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Ice packs</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">NC9909223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Insulated Styrofoam box</td>
			<td style="width:107px;">Polar Tech</td>
			<td style="width:115px;">207F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Packing tape</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td align="right" style="width:115px;">795570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Reagents</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Tissue Freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Airgas</td>
			<td style="width:115px;">NI NF160LT350</td>
			<td>Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Isopentane (2-methylbutane)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M32631-4L</td>
			<td>Store Isopentane&#160; in a flammable materials cabinet.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:523px;">EM fixative (choose one)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;">The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">16537-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Karnovsky&#39;s fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">15732-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For functional studies (if desired)&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Relaxing solution, containing (in mmol/L)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 40 BES</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">B9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10 EGTA</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 6.56 MgCl2</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5.88 Na-ATP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1.0 DTT</td>
			<td style="width:107px;">RPI</td>
			<td style="width:115px;">D11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 46.35 K-propionate</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15 creatine phosphate, pH 7.0</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.4 leupeptin</td>
			<td style="width:107px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:115px;">10895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.1 PMSF</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Skinning solution, containing&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Relaxing solution (See Above)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.5% Triton X-100</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indicating silica granules</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Flat pieces of cork (1 x 1 inch)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">63305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture (if desired)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Growth Medium, containing (for 500 mL)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 &#181;m PES filter unit.&#160; Store at 4&#176;C and use within 1 month.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 395 mL of high glucose Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 mL of fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">F6178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Storage requriements</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease

Skelettmuskel ist ein einzigartiges Gewebe aufgrund seiner Struktur und Funktion, die spezifische Protokolle zur Gewebesammlung erfordert, um optimale Ergebnisse funktional, zellulären, molekularen und pathologische Auswertungen erhalten. Aufgrund der Feinheit des pathologischen Anomalien in einigen angeborenen Muskelerkrankungen und der Möglichkeit zur Befestigung mit der Anerkennung dieser Funktionen stören gesehen, pathologische Auswertung der gefrorenen Muskel vorzuziehen, feste Muskeln bei der Auswertung der Skelettmuskulatur für angeborene Muskelerkrankung. Darüber hinaus wird das Potenzial zu schweren Einfrieren Artefakte im Muskel produzieren erfordert besondere Vorkehrungen beim Einfrieren der Skelettmuskulatur für die histologische Untersuchung, die nicht häufig verwendet werden, beim Einfrieren von anderen Geweben. Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll zum schnellen Einfrieren von Skelettmuskel mit Isopentan (2-Methylbutan) mit flüssigem Stickstoff gekühlt, um eine optimale Skelettmuskelmorphologie erhalten. Dieses Verfahren ist auch für freezing Gewebe zur genetischen oder Proteinexpressionsstudien vorgesehen. Darüber hinaus haben wir unsere Gefrierprotokoll in eine breitere Verfahren, das beschreibt auch bevorzugte Verfahren für die kurzfristige Triage-Gewebe für (1) Einzelfaser funktionelle Studien und (2) Myoblasten-Zellkultur, mit einem Fokus auf den minimalen Aufwand, der notwendig zu sammeln integriert Gewebe und transportieren sie zu spezialisierten Forschungs oder Referenzlabors, diese Studien abzuschließen. Insgesamt bietet diese Handschrift einen Überblick, wie frisches Gewebe effektiv für eine Vielzahl von phänotypischen Studien verteilt und bietet Standardarbeitsanweisungen (SOPs) für pathologische Untersuchungen zu angeborenen Muskelerkrankung im Zusammenhang damit.

Um Beispiele für die Artefakte mit unsachgemäßen Einfrieren gesehen zu schaffen, wurden mehrere Maus Quadrizeps-Muskeln mit verschiedenen Techniken (Abbildung 3) auf häufig anzutreff Fehler replizieren eingefroren. Wie in 3A gezeigt ist, in geeigneter Weise eingefroren Skelettmuskel zeigt eine enge Apposition Muskelfasern des umgebenden Gewebes (gewöhnlich andere Muskelfasern, sondern manchmal das Endomysium Raum zwischen Muskelfasern mit Fibrose oder Entzündungszellen in einer Vielzahl von Krankheiten oder Verletzungen Prozessen gefüllt) und eine deutlich sichtbare cytoplasmatische Fach. Für die pathologische Analyse ist die Fähigkeit, die intrazellulären Raum anzuzeigen oft wichtiger als die Endomysium-Fach, wie es in der Regel wichtig, die Anwesenheit von degenerativen Veränderungen, regenerativen Veränderungen oder andere pathognomonisches Befunde (Zentralkernen, intrazelluläre Einschlüsse) in diese eindeutig zu identifizieren Raum. Somit ist die Anwesenheit von Eiskristallen in dem intrazellulären Kompartiment Uhrichtige Problem in der pathologischen Beurteilung der Muskel. Ordnungsgemäße Einfrieren des Muskelgewebes erfordert sowohl ausreichend kalten Temperaturen und eine ausreichende Geschwindigkeit des Einfrierens, um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern. Auch bei der Bilanzierung von beiden Faktoren können erhebliche Einfrieren Artefakt immer noch wegen der übermäßigen Feuchtigkeit tritt im Muskelgewebe. Diese Frage wird am häufigsten in der Muskulatur, die zuvor in Kochsalzlösung eingetaucht worden war und nicht ausreichend getrocknet oder als Muskel in direktem Kontakt mit Oktober Montage Medien an der Stelle der Schnitt (3B, 3E) aufgetreten. Während einige Kontakt mit Oktober ist in der Regel unvermeidbar als Folge des Montageprozesses sollten alle Anstrengungen unternommen werden, um den Kontakt zwischen den Bereichen, die histologisch untersucht werden und die für die Montage verwendet Oktober zu vermeiden. Im Gegensatz dazu die Proben eingefroren mit einem -80 ° C Gefrierschrank (3C) und flüssigem Stickstoff (3D) bieten beispielsweises Gefrierpunkt Artefakt, das durch suboptimale Temperatur oder Gefriergeschwindigkeit erzeugt wird. Die langsame Gefrierverfahren, indem Gewebe in einem -80 ° C Gefrierschrank angetroffen stellt ein extremes Beispiel für das Einfrieren Artefakte. Bei Verwendung von flüssigem Stickstoff, ist das Hauptproblem, dass der Kontakt zwischen flüssigem Stickstoff und dem Gewebe verursacht eine Hülle aus gasförmigen Stickstoff in der Gewebe-Flüssigkeit-Grenzfläche zu bilden, und dieses gasförmige Schnittstelle nicht kalt genug, um eine schnelle Einfrieren Muskel 1 herzustellen. Dies kann erhebliche Einfrieren Artefakt in der Nähe der Oberfläche der Probe zu produzieren, aber interne Bereiche der Probe sind mit einer geeigneten Geschwindigkeit eher Flash-freeze und kann vollständig aus Einfrieren Artefakt verschont bleiben. Während das einfache Eintauchen des Muskelgewebes in flüssigem Stickstoff ist bei weitem nicht so nützlich, wie Isopentan-Gefrierprozess, kann es sinnvoll für das Einfrieren der großen Muskelproben in Situationen, in denen Isopentan ist nicht verfügbar (wie klinische Autopsie Proben bei Institutionen seinklinische Muskel Pathologie-Laboratorien). Ergebnisse mit dieser Strategie sind in der Regel besser, wenn große Teile des Gewebes (&gt; 2 cm in mehreren Dimensionen). Während die Vermeidung von Gefrierartefakten bietet optimale histologischen Ergebnisse wurde eine Technik entwickelt worden (und beschrieben), die im Wesentlichen kehrt Einfrieren Artefakte, die Bewertung der ordnungsgemäß gefrorenem Gewebe zu ermöglichen. Gewebe, die nicht ordnungsgemäß eingefroren wird (Fig. 3E) kann aufgetaut und unter streng kontrollierten Bedingungen (Fig. 3F) eingefroren, um die Umverteilung von Wasser in den Fasern zu ermöglichen, und der Grad der morphologischen Konservierung, die erhältlich ist, kann ausgezeichnet sein. Nach unserer Erfahrung ist dieses Verfahren erhält die intrazelluläre Morphologie des Gewebes zu einem bemerkenswerten Ausmaß, aber oft ein Artefakt Trennung der Fasern innerhalb der Endomysium-Raum. Wie vielen pathologischen Endpunkte sind in den intrazellulären Raum und die in gefundendie endomysiale Raum werden am besten mit Spezialfärbungen (entweder Fibrose hervorzuheben oder andere Zelltypen zu identifizieren), sind diese Änderungen artifactual unwahrscheinlich, dass die pathologische Auswertung der Muskel wirklich beeinträchtigen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig1highres.jpg" width="500" /> Fig. 1 ist. Triage Gewebe für strukturelle, funktionelle und zelluläre Studien von Skelettmuskel. Abhängig von den Arten von Studien gewünscht, können gesammelt Skelettmuskelgewebe in einer Vielzahl von Möglichkeiten für optimale Ergebnisse verarbeitet werden. Die in diesem Dokument beschriebenen Protokolle beschreiben Verfahren zur Selektierung oder Bearbeitung der Skelettmuskulatur Proben für die Off-Site-Studien, um die Ergebnisse, die aus Expertenkernanlagen zu optimieren. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig2highres.jpg" width = &quot;500&quot; /&gt; 2. Beispiele für Vorrichtungen zur Muskel Einfrieren verwendet. Wie in dem Protokoll beschrieben, optimale Muskel Einfrieren erfordert Eintauchen des Muskelgewebes in Isopentan, das in seiner Gefriertemperatur ist. Ein sicheres und effizientes Mittel zur Erlangung eiskaltem Isopentan umfasst die Verwendung eines Metallbehälters für das Isopentan, das in einem umgebenden gekühlten Dewar mit flüssigem Stickstoff. Da es oft bequem beide Hände frei zu haben, ist es möglich, eine Klammer wie ein Ringgerüst (A) verwenden, um den Behälter Isopentan in den flüssigen Stickstoff zu halten, während gegen das Vermischen der beiden Flüssigkeiten. Alternativ kann der Behälter auch in den flüssigen Stickstoff manuell (B) gehalten werden. In jedem Fall wird das Gewebe nicht in das Isopentan, bis das Isopentan sichtbar Gefrieren am Boden des Behälters (üblicherweise opake, weiße Kieselsteine), dann sollte für 10-20 Sekunden getaucht werden, um eine vollständige Gefrieren ermöglichen platziert werden. Isopentane bei Gefriertemperatur erzeugt minimal &quot;Nebel&quot;, (das heißt, wenn die Temperatur unzureichend beträchtlichen Nebel vorhanden ist). Sobald das Gewebe eingefroren ist, legen Sie sie direkt in die vorgekühlten Behälter (und dann direkt in einen Kühler-oder Gefrierschrank), um ein versehentliches Auftauen nach dem Einfrieren zu verhindern. (C) Passend montiert gefrorenen Muskel sollte die Mehrheit der von einer Basis von gefrorenen OCT hervor Muskelgewebe haben. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Beispiele Artefakt Einfrieren und Auftauen der effektiven / Wiedereinfrieren. Repräsentative Bilder von (A) entsprechend Isopentan eingefroren Muskel, (B) Muskel angemessen in Isopentan eingefroren, aber während in Kontakt mit Oktober Montagemedium, (C) eingefroren Muskel in einem -80 ° C Gefrierschrank und (D </strong&gt;) Muskel in flüssigem Stickstoff eingefroren, die alle zeigen unterschiedliche Grade der Gefrier Artefakt. Wie in (B) gezeigt, der hohe Flüssigkeitsgehalt Oktober produziert signifikante Einfrieren Artefakt in Muskel, der mit ihm in Kontakt ist, so dass nur die minimale Menge von Oktober für die Montage erforderlich verwendet werden sollte, und der Muskel für die histologische Evaluierung sollte &quot;stehend sein out &quot;von seiner Oberfläche. Die Langsamkeit des Gefrierverfahren unter Verwendung einer (C) -80 ° C Gefrierschrank oder (D) flüssiger Stickstoff (bezogen auf die Geschwindigkeit des Einfrierens in eiskaltem Isopentan) können zur Herstellung von signifikanten Einfrieren Artefakte führen. Panels E und F zeigen Muskel aus der gleichen Probe, die war (E) zunächst suboptimal gefroren (aufgrund übermäßiger Kontakt mit OCT) und dann (F) aufgetaut und wieder eingefroren unter Verwendung der hier beschriebenen Technik. Während man einige Artefakt Trennung zwischen den Fasern wieder eingefroren in der Probe zu beobachten, die Verbesserung in die intrazelluläre Morphologie der Muskelfasern ist leicht ersichtlich. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Tissue Triage und Einfrieren der Modelle von Skelettmuskelerkrankungen

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

39.8K Aufrufe.  Medical College of Wisconsin. The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Serie: Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Forschung

Biologie

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur der Maus

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring compositional changes in the microbiome is crucial in identifying the functional relationships between these physiological changes. Caenorhabditis elegans has emerged as a powerful host system to examine the molecular drivers of host-microbiome interactions. With its transparent body plan and fluorescent-tagged natural microbes, the relative levels of microbes within the gut microbiome of an individual C. elegans animal can be easily quantified using a large particle sorter. Here we describe the procedures for the experimental setup of a microbiome, collection, and analysis of C. elegans populations in the desired life stage, operation, and maintenance of the sorter, and statistical analyses of the resulting datasets. We also discuss considerations for optimizing sorter settings based on the microbes of interest, the development of effective gating strategies for C. elegans life stages, and how to utilize sorter capabilities to enrich animal populations based on gut microbiome composition. Examples of potential applications will be presented as part of the protocol, including the potential for scalability to high-throughput applications.

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans is a powerful model to examine the molecular determinants driving host-microbiome interactions. We present a high throughput pipeline profiling the single animal levels of gut microbiome colonization together with key aspects of the C. elegans physiology.

Anwendung der Flow-Vermimetrie zur Quantifizierung und Analyse des Darmmikrobioms von Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...