Diese Studie wurde von der Arbeit von Levine et al. , Die diese experimentelle Methode beschrieben und eine umfassende Beschreibung der vaskulären Entwicklung in Xenopus laevis zur Verfügung stellte . Wir danken den Mitgliedern unseres Labors für ihre Inputs. Diese Studie wurde von der Yonsei University Future-führenden Forschungsinitiative von 2015 (2015-22-0095) und dem Bio &amp; Medical Technology Development Program der Nationalen Forschungsstiftung (NRF) unterstützt, die vom Ministerium für Wissenschaft, IKT &amp; Zukunftsplanung ( NRF-2013M3A9D5072551)

Alle Experimente erfüllten die Protokolle, die von der Yonsei University College of Medicine Institutional Animal Care und Use Committees genehmigt wurden. 1. Vorbereitung von Xenopus tropicalis Embryos ANMERKUNG : Xenopus tropicalis Embryos wurden wie zuvor beschrieben 10 mit leichter Modifikation hergestellt. Xenopus tropicalis Embryos wurden nach den Tabellen von Nieuwkoop und Faber 11 inszeniert. <ol><li> Induktion des Eisprungs <ol><li> Zur Vorprime, injizieren menschliches Choriongonadotropin (hCG) in den dorsalen Lymphbeutel eines Paares von Fröschen (ein Mann und ein Weibchen) am Tag vor dem Tag der Paarung. Spritzen Sie 20 Einheiten pro weiblichen Frosch und 10 Einheiten pro Mann. Haus ein Mann und ein Weibchen im selben Tank über Nacht (für mehr als 18 Stunden). </li><li> Zum Prime, am folgenden Tag, injizieren 200 Einheiten von hCG auf die vor-grundierte weibliche und 100 Einheiten von hCG auf die vor-grundiertmännlich; Die grundierte Frau wird beginnen, Eier in ca. 3 Stunden zu legen und wird auch weiterhin den ganzen Tag tun. Halten Sie das männliche und weibliche Paar zusammen für natürliche Paarung oder in separaten Tanks für In-vitro- Fertilisation (Schritt 1.2). </li></ol></li><li> Düngung HINWEIS: Eier können durch natürliche Paarung oder In-vitro- Fertilisation befruchtet werden. In der natürlichen Paarung werden die Eier befruchtet, während sie gelegt werden, und daher kann der Zeitpunkt der Befruchtung nicht kontrolliert werden. Alternativ kann ein grundierter weiblicher Frosch in einem separaten Tank untergebracht werden und unbefruchtete Eier können für die In-vitro- Fertilisation gesammelt werden, die Hunderte von gleichzeitig befruchteten Embryonen erzeugt. Der letztere Ansatz ist nützlich, wenn eine Blastomere-zielgerichtete Mikroinjektion vor der Gefäßkennzeichnung durchgeführt wird. Bei diesem Ansatz wird jedoch ein Mann geopfert. <ol><li> Natürliche Paarung <ol><li> Lassen Sie grundierte weibliche und männliche Paar in den gleichen Tank. Der Mann wird die fEmale, was zur sofortigen Befruchtung der gelegten Eier führt. Die Eier mit einer Glas- oder Plastikpipette sammeln und in eine Petrischale überführen. Um zu verhindern, dass die Eier an der Pipette haften, beschichten Sie die innere Oberfläche der Pipette mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA). </li></ol></li><li> In-vitro- Fertilisation (IVF) <ol><li> Trennen Sie das grundierte Weibchen vom Männchen nach dem Grundieren. Das Weibchen fängt an, Eier spontan in ca. 3 h zu legen. Übertragen Sie einige gelegte Eier mit einer BSA-beschichteten Pipette zu einer Petrischale und überprüfen Sie ihre Qualität unter einem Mikroskop. Wenn gesunde Eier (klares Pigment, elastisch kugelförmig) gelegt wurden, bereiten Sie sich vor, um die Hoden aus dem grundierten Männchen zu sezieren. </li><li> Machen Sie 0,4% Tricainmethansulfonat (MS222) für die Euthanasie und injizieren Sie 300 μl in den dorsalen Lymphsack des grundierten Mannes. In etwa 10 min wird der Mann sein Gleichgewicht verlieren und wird über Wasser bleiben; Bestätigen Sie, dass das Männchen durch das Einklemmen eines Hinterbeins mit einemPaar stumpfe Zangen und beobachtete keine Antwort. </li><li> Ziehen Sie die beiden Hoden heraus, reinigen Sie sie, indem Sie sie schnell auf fusselfreies Papier klopfen und in ein Mikroröhrchen mit 1 ml 60% Leibovitz L-15 Medium (60%), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), überführen. Ein detailliertes Verfahren ist an anderer Stelle beschrieben 10 . </li><li> Die Hoden vorsichtig mit einer Pistille zerkleinern, um das Sperma zu extrahieren. Bei dieser Konzentration ( dh 2 Hoden in 1 ml 10% FBS in 60% L-15) können einige Tropfen der Hodenlösung (0,1 ml) etwa dreihundert Eier befruchten. Das verbleibende Sperma kann bei 4 ° C in einem dicht verschlossenen Rohr gelagert und für IVF am nächsten Tag verwendet werden. </li><li> Squeeze die Eier von der Frau in eine kleine Petrischale. Halten Sie den oberen Teil des Weibchens umgedreht auf die Handfläche und setzen Sie den Zeigefinger zwischen die Hinterbeine. Verbreiten Sie seine Hinterbeine mit dem Zeigefinger und die andere Hand, um die Kloake zu entlarven. Berühre die Kloake zur Petrischale. Mantel tEr Petrischale mit 0,5% BSA, um die Eier gleichmäßig als Monoschicht während der IVF zu verteilen. </li><li> Fügen Sie ein paar Tropfen (0,1 ml) des Spermien enthaltenden L-15-Mediums zu den Eiern hinzu. Für die synchrone Befruchtung rühren Sie die Spermien-Lösung vorsichtig über die Schale. Nach 4 min bei Raumtemperatur füllen Sie die Petrischale mit 0,01x modifizierter Barth&#39;s Saline (MBS), inkubieren für 10 min und ersetzen Sie die Lösung mit 0.1x MBS. Die befruchteten Eier werden die erste Spaltung in ca. 1 h bei Raumtemperatur durchlaufen. 1x MBS beträgt 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,5 mM NaHCO 3 , 5 mM HEPES, 1 mM MgSO 4 und 0,7 mM CaCl 2 , pH 7,5. </li></ol></li></ol></li><li> (Optional) Injektion von Antisense-Morpholino-Oligonukleotiden (MOs) und / oder mRNAs <ol><li> Um die Wirkung eines Gens von Interesse auf die Gefäßbildung zu untersuchen, führen Sie die Mikroinjektion von Antisense MO und / oder mRNAs durch. </li><li> Für solche Experimente entgleisen die Eier mit 2% L-Cystein in 1x MBS (pH 7,5-7,8).Ersetzen Sie 0,1x MBS in der Schale mit den befruchteten Embryonen mit 2% L-Cystein in 1x MBS. Die Schale vorsichtig umdrehen, um die Lösung zu mischen. ANMERKUNG: Es dauert normalerweise ungefähr 5 min, damit die Embryonen entblößt werden. Während dieses Schrittes, überwachen Sie die Eier häufig, um sicherzustellen, dass sie nicht überbelichtet werden, um die Lösung. Wenn die Eier überbelichtet sind, verlieren sie die Elastizität und werden abgeflacht, was zu einer abweichenden Entwicklung und Letalität führen wird. </li><li> Waschen Sie die de-jellied Eier fünfmal mit 0.1x MBS. Führen Sie die Mikroinjektion in 4% Ficoll aufgelöst in 0.1x MBS. Typischerweise injizieren Sie 4 ng MO und 600 pg mRNA pro Blastomere im Zweizellenstadium. In eine Zelle injizieren, um die Genexpression nur auf einer Seite des Embryos zu manipulieren. Benutze die uninjizierte Seite des gleichen Embryos als Kontrolle. </li><li> Als weitere Kontrolle für die Spezifität der Genmanipulation injizieren Sie die gleiche Menge einer Kontrolle MO (CoMO) oder Kontrolle mRNA ( zB Beta-Galactosidase mRNA). CoMO muss das gleiche haben mOleculargewicht als Gen-spezifisches MO und darf keinem Gen im Xenopus- Genom ansprechen. Zur leichten Visualisierung der injizierten Seite verwenden Sie Fluorescein-markiertes MO oder co-injizieren einen Tracer ( zB EGFP mRNA). </li><li> Lassen Sie die injizierten Embryonen in 4% Ficoll für 2 h und überweisen sie dann auf eine neue 60 mm Petrischale mit 0.1x MBS gefüllt. </li></ol></li><li> Anheben <ol><li> Heben Sie die Embryonen bei 23 ° C an. Obwohl die Entwicklungsgeschwindigkeit durch Verwendung von Temperaturen unter oder über 23 ° C (Bereich: 16-26 ° C) verlangsamt oder beschleunigt werden kann, empfiehlt es sich, diese bei 23 ° C anzuheben. </li></ol></li><li> (Optional) Behandlung mit pharmakologischen Reagenzien <ol><li> Für pharmakologische Manipulationen, verabreichen Medikamente an die sich entwickelnden Embryonen durch Badanwendung. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung der DiI-AcLDL-Injektion <ol><li> Machen Sie eine verjüngende Glaspipette mit einem Standard-MikrOpipettenabzieher Legen Sie eine Borosilikatglasröhre in den Mikropipettenabzieher und verwenden Sie folgende Einstellungen: Druck, 200; Hitze, 30; Ziehen, 30; Geschwindigkeit, 120; Zeit, 200. </li><li> Die DiI-AcLDL-Stammlösung bei 4 ° C aufbewahren. Nehmen Sie den oberen klaren Teil der Lösung für die Injektion, aber nicht die ausgefällten Partikel auf der Unterseite des Tubus. Alle Schutt in der Glaspipette stört den richtigen Ausstoß der Lösung. </li><li> Füllen Sie die vorbereitete Glaspipette mit einer geeigneten Menge an DiI-AcLDL-Lösung (~ 5 μL) mit einem Mikroloader. </li><li> Clip aus der Spitze der Glaspipette nach und nach mit einer feinen Pinzette (Nummer 55). Stellen Sie das druckgesteuerte Einspritzsystem so ein, dass ca. 5 nL Lösung zu einem Zeitpunkt ausgeworfen wird. 50-60 nL DiI-AcLDL-Lösung reicht aus, um die Gefäße eines Embryos zu färben. </li><li> Lassen Sie die DiI-AcLDL-beladene Pipette längere Zeit nicht an der Luft ab, um ein Trocknen zu vermeiden. Halten Sie die Spitze der Pipette in 0,04% MS versenkt222 in 0.1X MBS-Lösung. Kurz vor dem Einspritzen in den Embryo (Schritt 4.2.1), um zu sehen, ob die gleiche Menge an Farbstoff ausstößt. </li></ol> 3. Einspritzung <ol><li> Sylgard-Schimmel <ol><li> Um eine kleine Sylgard-Form herzustellen, mischen Sie Sylgard-Base und Härtungsmittel mit einem Gewichtsverhältnis von 10 bis 1. Füllen Sie etwa die Hälfte einer kleinen Petrischale (35 mm oder 60 mm Schale) mit dieser gemischten Lösung und lassen Sie sie dann etwa verfestigen 48 h bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Anästhesie <ol><li> Verwenden Sie 0,04% MS222 in 1x MBS (pH 7,5-8,0) für Anästhesie. Wenn lange Anästhesie benötigt wird ( zB während der Live-Bildgebung), verwenden Sie 0,04% MS222 in 0.1x MBS, um das osmotische Ungleichgewicht zu reduzieren. Um den pH-Wert einzustellen, fügen Sie einige Tropfen NaOH (~ 20 μL) hinzu und überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Papier. </li><li> Warten Sie, bis die übertragenen Embryos aufhören zu bewegen. Berühre die Rückenflossen der Embryonen und kontrolliere, ob sie darauf antworten, dass sie vollständig bestätigenNesthesie </li></ol></li><li> Embryonen zur Injektion positionieren <ol><li> Einzug der Oberfläche der gehärteten Sylgard-Form mit einer dünnen und scharfen Klinge. Machen Sie eine V-förmige konkave Einbuchtung, in der die Embryonen platziert werden können (siehe Abbildung 2D ). Legen Sie einen anästhesierten Embryo, ventral-Seite nach oben, in einer etwas schrägen Art (ca. 30 °) (Abbildung 2D ). </li><li> Füllen Sie die Form mit MS222-Lösung und legen Sie die Embryonen in die Form. </li></ol></li></ol> 4. DiI-AcLDL-Injektion <ol><li> Inzision der Haut über dem Herzen <ol><li> Bereiten Sie zwei Stifte (Minutiens, 0,10 mm) vor, um die Haut über dem Herzen zu schneiden. Fixieren Sie jeden Stift fest an einen Stifthalter; Das Herz sollte leicht identifizierbar sein, wie es pulsiert (Abbildung 2A-2C , rosa). </li><li> Punktion der Haut eines Embryos mit einem Stift. Setzen Sie den Stift durch das Loch in den Raum zwischen dem Herzen und der Haut ( Abbildung 2C </strOng&gt;, solider Pfeil). Nicht das Herz durchstechen. Positionieren Sie den eingefügten Teil dieses Stifts in den Bereich, in dem der Schnitt gemacht wird. </li><li> Machen Sie einen linearen Einschnitt durch sanftes Reiben der anderen Pin außerhalb der Haut gegen den eingelegten Stift gehalten. Diese Inzision mit zwei Stiften vorsichtig erweitern und das Herz aussetzen ( Abbildung 2B &#39; und 2D&#39; , Pfeil). Die mit DiI-AcLDL geladene Pipette kann sich nun direkt dem Herzen nähern (Abbildung 2D &#39; ). </li></ol></li><li> Injektion <ol><li> Setzen Sie die Spitze der beladenen Glaspipette in das Herz ein und injizieren Sie 50-60 nL DiI-AcLDL-Lösung in ca. 10 Ausstoßimpulsen. Spritzen Sie nicht eine übermäßige Menge an Lösung, da es das Herz zu brechen verursacht. Prüfen Sie, ob das Herz nach der Injektion weiter schlägt. Nach jeder Injektion prüfen, ob die gleiche Menge an DiI-AcLDL ausgeworfen wird. Andernfalls kann die Spitze der Pipette blockiert werden (siehe Schritt 2.5). </li></ol></li><li><stroNg&gt; Wiederherstellung und visuelles Screening <ol><li> Übertragen Sie die injizierten Embryos auf eine neue Petrischale, die mit 0.1x MBS zur Verwertung gefüllt ist. Nach 5-10 min sollten die Kaulquappen das Bewusstsein wiedererlangen und beginnen sich zu bewegen. Zu diesem Zeitpunkt können die markierten Gefäße abgebildet werden. Es empfiehlt sich, erfolgreich markierte Embryonen unter einem Fluoreszenzmikroskop zu visualisieren (Abbildung 3A und 3B ). Wenn eine unzureichende Menge an DiI-AcLDL in einen Embryo injiziert wird, kann er wieder injiziert werden (Abbildung 3C ). </li><li> Verwerfe die Kaulquappen, die andere Organe haben ( Abbildung 3D ). Weiter, bis die erforderliche Anzahl erfolgreich markierter Embryonen erreicht ist. </li></ol></li><li> (Optional) Fixierung der Embryonen <ol><li> Für eine gründlichere Bildgebung von Blutgefäßen, verwenden Sie konfokale Mikroskopie; Es könnte einfacher sein, die markierten Embryonen für konfokale Mikroskopie zu fixieren. Zuerst betonen die markierten Embryonen in 0,04% MS222 in 1x MBS (pH 7,5-8,0) und fixieren sie dann in 4% Paraformaldehyd in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1 h bei Raumtemperatur. Feste Embryos können für mehrere Tage bei 4 ° C gelagert werden; Schützen die eingespritzten Proben vor Licht, um das Photobleichen des DiI zu vermeiden. </li></ol></li></ol> 5. Bildgebung von DiI-AcLDL <ol><li> Stereoskopische Bildgebung <ol><li> Nehmen Sie Fotos unter einem fluoreszierenden stereoskopischen Mikroskop (Abbildung 3 ), um die Gesamtmorphologie des Gefäßsystems zu beurteilen. </li><li> 1% Agarose in 1x PBS für feste Embryonen oder in 1x MBS für lebende Bildgebung schmelzen. Gießen Sie geschmolzene Agarose in eine Petrischale und warten Sie, bis sie erstarrt. Machen Sie eine flache Einbuchtung auf der Oberfläche des Agarosegels, die den Embryo passieren wird, um abgebildet zu werden, wenn er auf seiner lateralen Seite liegt. Füllen Sie die Schale mit Puffer (MS222-Lösung für anästhesierte Embryonen oder 1x PBS für feste Embryonen). </li></ol></li><li> Fluoreszenzmikroskopie (Rhodaminfilter seT) <ol><li> Als DiI ist ein grün-angeregter und rot emittierender Farbstoff, Bild unter Verwendung eines Standardfiltersatzes für Rhodamin oder spektral verwandte Fluorophore (maximale Anregung bei 554 nm und Emission bei 571 nm). Lege die injizierten Embryos in die Vertiefungen auf die Agaroseform und fotografiere (Abbildung 3 ). </li></ol></li><li> Konfokale mikroskopie HINWEIS: Für eine genauere Analyse der Gefäßarchitektur verwenden Sie konfokale Mikroskopie. <ol><li> Wenn Sie ein invertiertes Mikroskop verwenden, positionieren Sie die Embryonen auf einer Glasbodenschale. Fügen Sie ein paar Tropfen von 1x PBS hinzu und immobilisieren Sie sie, indem Sie einen Deckzettel auf die Oberseite legen. Entfernen Sie überschüssiges PBS. Wenn lebende Embryonen abgebildet werden sollen, verwenden Sie anästhesierte Embryonen und verwenden Sie 0,015% MS222 in 0,1x MBS anstelle von PBS. </li><li> Für die Vergrößerung Bildgebung, verwenden Sie ein 4X bis 10X Ziel, um den Bereich von Interesse zu finden; Der rostrale Teil der hinteren Kardinalvene (PCV) ist eine nützliche Region, um die Entwicklungsangiogenese zu untersuchen (Abbildung 4, gestricheltBoxen). <ol><li> Verwenden Sie eine Erfassungseinstellung für einen roten Emissions-Fluorophor (wie Rhodamin). </li><li> Machen Sie z-gestapelte Bilder durch die Abbildung der lateralen Hälfte eines Embryos. Zuerst konzentriere ich mich auf den PCV auf der lateralen Seite in der Nähe des Objektivs und setze dann die untere Grenze des Fokus an die Stelle, wo die Schiffe, die dem Ziel am nächsten liegen, im Fokus sind. Setzen Sie die obere Grenze an die Stelle, an der der mediale Teil des abgebildeten PCV fokussiert werden kann. Bild diese ganze laterale Hälfte des Embryos. Verwenden Sie Software, die Metadaten auf den Erfassungseinstellungen speichert, wie z. B. x-, y- und z-Skalen, da sie die Gefäßlängen berechnen müssen. </li><li> Wenn nötig, verwenden Sie den Fliesen-Scan-Modus, um das gesamte Gefäßsystem eines Embryos abzubilden. Empirisch bestimmen die Anzahl der horizontalen und vertikalen Fliesen. </li></ol></li><li> Für die Bildverarbeitung mit hoher Vergrößerung folgen Sie den oben beschriebenen Vorgehensweisen, um den rostralen Teil des PCV und 4 rostral-am meisten intersomitischen Venen (ISVs) abzubilden (Abbildung 4 ,Gestrichelte Kiste). Passen Sie die Anzahl der Stapel (z-Stack) und Fliesen (Fliesen-Scan) entsprechend an. </li></ol></li></ol> 6. Quantifizierung von DiI-markierten Gefäßen HINWEIS: DiI-markierte Schiffe können manuell oder mit Software verfolgt werden. Wir verwenden &quot;Simple Neurite Tracer&quot;, ein freies ImageJ (NIH) Plugin, das eine halbautomatische Verfolgung von röhrenartigen Strukturen wie Blutgefäßen und Neuriten ermöglicht. Mit dieser freien Software können folgende Parameter berechnet werden. Eine detaillierte Vorgehensweise für die Verwendung dieser Software ist an anderer Stelle beschrieben (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . Im Folgenden verwenden wir Beispiele für die Gefäße von Embryonen, in denen Tie2-Signalisierung gehemmt oder verstärkt wird (Abbildung 4A-4C ) 5 . Antisense Tie2MO-injizierte Embryonen zeigen die Angiogenese und verkürzt die ISVs (Abbildung 4B ), während die Co-Injektion von konstitutiv aktivem Tie2Mutante mRNA (caTie2 mRNA) überholt diesen Phänotyp, was zu üppigen ISV-Verzweigungen führt (Abbildung 4C ). <ol><li> ISV-Längen <ol><li> Mit einfachem Neuriten-Tracer, berechnen Sie die Länge jedes verfolgten Schiffes. Berechnen Sie die Längen der 4 rostral-meisten ISVs. </li></ol></li><li> ISV Niederlassungen ANMERKUNG: In Wildtyp-Embryonen sprießen nur wenige kurze Zweige von den rostral-meisten ISVs in Stufe 42. <ol><li> In Simple Neuriten Tracer, verfolgen diese kleinen Schiffe nach der ISV, aus denen sie den Primärzweig stammen. Berechnen Sie die folgenden Parameter dieser Zweige, die aus den ISVs stammen. </li><li> Gesamtzahl der Filialen <ol><li> Sobald alle ISVs und die zugehörigen Zweige verfolgt sind, berechnen Sie die Gesamtzahl der Zweige (Abbildung 5B-5D ). </li></ol></li><li> Zweigbestellung <ol><li> Als einfacher Neuriten-Tracer die Reihenfolge jedes Zweigs aufzeichnet ( Abbildung 5A ), kalkulierenE die Anzahl der Zweige für jede Bestellung. Die Mehrheit der Schiffe in Wildtyp Embryonen sollten primäre Zweige ( dh ISVs) sein. </li></ol></li><li> Vene-Komplexitätsindex (VCI) <ol><li> Da VCI ein nützlicher Parameter für die Gefäßkomplexität ist, der mehr Ätzungen höherer Ordnung ergibt, berechnen Sie die VCI für jeden Embryo unter Verwendung der Formel in 5A . Zum Beispiel haben Tie2MO-injizierte Embryos eine niedrigere VCI im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 5B und 5C ), und CaTie2 mRNA-injizierte Embryos haben eine höhere VCI (Abbildung 5D ). </li></ol></li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das hier vorgestellte Protokoll wurde zuerst von Ali H. Brivanlou und Kollegen entwickelt, um Entwicklungsereignisse während der Gefäßbildung in Xenopus laevis 4 zu untersuchen, aber wie in diesem Manuskript gezeigt, kann es auf andere kleine Tiere angewendet werden. Die Farbinjektion in das Herz ist einfach durchzuführen, und das gesamte Gefäßnetzwerk kann unter einem Fluoreszenzdissektionsmikroskop sowie ein konfokales Mikroskop abgebildet werden. Wenn der Farbstoff während der ...

Die Vaskulogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus neugeborenen Endothelzellen und die Angiogenese, die Bildung neuer Gefäße aus bereits vorhandenen Gefäßen, sind zwei verschiedene Prozesse, die das embryonale Gefäßbild verändern. Jede Dysregulation in diesen Prozessen führt zu verschiedenen Herzerkrankungen und strukturellen Anomalien der Gefäße. Darüber hinaus ist das Tumorwachstum mit dem unkontrollierten Gefäßwachstum verbunden. Als solche sind molekulare Mechanismen, die der Vaskulogenese und der Angiogenese zugrunde liegen, Gegenstand intensiver Untersuchungen 2 . Xenopus und Zebrafisch sind aus verschiedenen Gründen attraktive Wirbeltiermodelle für Vaskulogenese- und Angiogenese-Studien. Zuerst sind ihre Embryos klein; Daher ist es relativ einfach, die gesamte vaskulatur zu bildlich zu machen. Zweitens ist die embryonale Entwicklung schnell; Es dauert nur ein paar tage für das gesamte vasculature zu entwickeln, während welcher zeit das entwickelnde vaskul<html> Ature kann abgebildet werden. Drittens sind genetische und pharmakologische Interventionen vor und während der Gefäßbildung leicht durchzuführen, wie durch die Mikroinjektion von Antisense-Morpholino-Nukleotiden (MOs) in den sich entwickelnden Embryo oder durch die Badanwendung der Medikamente 3 , 4 , 5 . Der einmalige Vorteil von Xenopus über Zebrafisch ist, dass embryologische Manipulationen durchgeführt werden können, weil Xenopus stereotypen holoblastischen Spaltungen folgt und die embryonale Schicksalskarte gut definiert ist 6 . Beispielsweise ist es möglich, einen Embryo zu erzeugen, bei dem nur eine laterale Seite genetisch manipuliert wird, indem man ein Antisense-MO zu einer Zelle im Zweizellenstadium injiziert. Es ist auch möglich, das Herz-Primordium von einem Embryo zu einem anderen zu transplantieren, um zu bestimmen, ob das Gen seine Funktion durch einen zell-intrinsischen oder -extrinsischen Mechanismus ausübtAss = &quot;xref&quot;&gt; 7 Obwohl diese Techniken meist in Xenopus laevis entwickelt wurden, das allotetraploid ist und daher nicht ideal für genetische Studien ist, können sie direkt auf Xenopus tropicalis angewendet werden , eine eng verwandte diploide Spezies 8 . Eine Möglichkeit, die Vaskulatur in einem lebenden Xenopus- Embryo zu visualisieren, besteht darin, einen Fluoreszenzfarbstoff zu injizieren, um die Blutgefäße zu etikettieren. Acetyliertes Lipoprotein mit niedriger Dichte (AcLDL), das mit einem fluoreszierenden Molekül wie DiI markiert ist, ist eine sehr nützliche Sonde. Im Gegensatz zu nichtacetyliertem LDL bindet AcLDL nicht an den LDL-Rezeptor 9, sondern wird durch Makrophagen und Endothelzellen endozytiert. Die Injektion von DiI-AcLDL in das Herz eines lebenden Tieres führt zu einer spezifischen fluoreszierenden Markierung von Endothelzellen, und das gesamte Gefäßsystem kann durch Fluoreszenzmikroskopie in lebenden oder fixierten Embryonen abgebildet werden 4 . Hier haben wir vorDetaillierte Protokolle für die Visualisierung und Quantifizierung von Blutgefäßen mit DiI-AcLDL in Xenopus tropicalis ( Abbildung 1 ). Wir bieten wichtige praktische Punkte, mit Beispielen für erfolgreiche und erfolglose Experimente. Darüber hinaus bieten wir eine einfache Methode zur quantitativen Analyse der vaskulären Komplexität, die bei der Beurteilung der Auswirkungen von genetischen und umweltbedingten Faktoren auf die Formgebung des Gefäßnetzes nützlich sein könnte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">35mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10035</td>
			<td style="width:180px;">Sylgard mold frame</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">60mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10060</td>
			<td>Embryo raising tray</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">B100-50-10</td>
			<td>Needle for injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">BSA</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">A3059-10G</td>
			<td>Coating reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">CaCl2</td>
			<td style="width:113px;">D.S.P.GR Reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>0.1X MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Coverslip</td>
			<td style="width:113px;">Superior</td>
			<td style="width:93px;">HSU-0111520</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">DiI-AcLDL</td>
			<td style="width:113px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:93px;">L3484</td>
			<td>Vessel staining solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">FBS</td>
			<td style="width:113px;">Hyclone</td>
			<td style="width:93px;">SH.30919.02</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Fiber Optical Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">Z-LITE-Z</td>
			<td>Light</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Ficoll</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">F4375</td>
			<td>Injection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">P-97</td>
			<td>Injection needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Forcep</td>
			<td style="width:113px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:93px;">11255-20</td>
			<td style="width:180px;">For embryo hatching and 
			needle tip cutting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Glass Bottom dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">100350</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">hCG</td>
			<td style="width:113px;">MNS Korea</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For priming of frogs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">HEPES</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">H3375</td>
			<td>Buffering agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Incubator</td>
			<td style="width:113px;">Lab. Companion</td>
			<td style="width:93px;">ILP-02</td>
			<td>For raising embryos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">KCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">6566-4400</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L15 medium</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:93px;">11415-114</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">168149-100G</td>
			<td>De-jellying reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MgSO4</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">M7506</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Microtube</td>
			<td style="width:113px;">Axygen</td>
			<td style="width:93px;">MCT-175-C-S</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MS222</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">E10521</td>
			<td>Anesthetic powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">7647-14-5</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaOH</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">S-0899</td>
			<td>pH adjusting reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148</td>
			<td>Fixatives</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">PBS</td>
			<td style="width:113px;">BIOSESANG</td>
			<td style="width:93px;">P2007</td>
			<td>Buffer for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">pH paper</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P4536-100EA</td>
			<td>For confirming pH</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">PICO-LITER INJECTOR</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">PLI-100A</td>
			<td>For injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pin</td>
			<td style="width:113px;">Pinservice</td>
			<td style="width:93px;">26002-10</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pinholder</td>
			<td style="width:113px;">Scitech Korea</td>
			<td style="width:93px;">26016-12</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">PZMIII</td>
			<td>For visual screening</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:153px;">Standard Manual Control Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">W4 64-0056</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">SYLGARD 184 Kit</td>
			<td style="width:113px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For DiI injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:113px;">Korea Ace Scientific Co.</td>
			<td style="width:93px;">YM.B78-400</td>
			<td>For eggs and 
			embryo collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis

Blutgefäße liefern Sauerstoff und Nährstoffe im ganzen Körper, und die Bildung des Gefäßnetzes ist unter engen Entwicklungskontrolle. Die effiziente In-vivo- Visualisierung von Blutgefäßen und die zuverlässige Quantifizierung ihrer Komplexität sind der Schlüssel zum Verständnis der Biologie und der Erkrankung des Gefäßnetzes. Hier stellen wir eine detaillierte Methode zur Verfügung, um Blutgefäße mit einem handelsüblichen Fluoreszenzfarbstoff, einem humanen Plasma acetylierten Diiplex (DiI-AcLDL) mit niedriger Dichte zu identifizieren und ihre Komplexität in Xenopus tropicalis zu quantifizieren . Blutgefäße können durch eine einfache Injektion von DiI-AcLDL in das schlagende Herz eines Embryos markiert werden, und Blutgefäße im gesamten Embryo können in lebenden oder fixierten Embryonen abgebildet werden. Kombiniert mit der Genstörung durch die gezielte Mikroinjektion von Nukleinsäuren und / oder die Badanwendung von pharmakologischen Reagenzien können die Rollen eines Gens oder eines Signalweges auf der Gefäßentwicklung auftretenStammte innerhalb einer Woche ohne Rückgriff auf anspruchsvolle gentechnisch veränderte Tiere. Wegen des wohldefinierten venösen Systems von Xenopus und seiner stereotypen Angiogenese kann das Keimen von bereits vorhandenen Gefäßen die Gefäßkomplexität nach Störungsexperimenten effizient quantifiziert werden. Dieses relativ einfache Protokoll sollte als ein leicht zugängliches Werkzeug in verschiedenen Bereichen der Herz-Kreislauf-Forschung dienen.

Zeitplan der Experimente (Abb. 1 und 2) Kurz nach der Befruchtung kann eine gezielte Mikroinjektion durchgeführt werden, um die Genexpression zu modulieren. Beispielsweise kann ein Antisense-MO, das spezifisch an das Initiationscodon der endogenen Tie2-mRNA bindet, injiziert werden, was die Translation von Tie2-Ziel-mRNA durch sterische Hinderung hemmt. Ein MO kann mit Fluorescein für die einfache visuelle Screening von erfolgr...

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Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

visualization-quantitative-analysis-embryonic-angiogenesis-xenopus

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

8.3K Aufrufe.  Yonsei University College of Medicine.  Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen. 

Serie: Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transkriptom Profilieren<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

Lichtvermittelte reversible Modulation des mitogenaktivierten Proteinkinase-Pathways während der Zelldifferenzierung und<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Entwicklung

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...