Name: visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis
Uploaded: 2017-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
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Questo studio è stato ispirato dall&#39;opera di Levine et al. , Che descriveva questo metodo sperimentale e forniva una descrizione completa dello sviluppo vascolare in Xenopus laevis. Ringraziamo i membri del nostro laboratorio per il loro contributo. Questo studio è stato sostenuto dall&#39;iniziativa di ricerca futura diretta dell&#39;università di Yonsei 2015 (2015-22- 0095) e dal Programma di Sviluppo Tecnologico Bio &amp; Medical della Fondazione Nazionale di Ricerca (NRF) finanziato dal Ministero della Scienza, delle TIC e del Futuro Pianificazione ( NRF-2013M3A9D5072551)

Tutti gli esperimenti sono stati conformi ai protocolli approvati dai comitati istituzionali di cura e uso degli animali di Yonsei University College of Medicine. 1. Preparazione degli embrioni di Xenopus tropicalis NOTA: Gli embrioni di Xenopus tropicalis sono stati prodotti come descritto in precedenza 10 , con leggera modifica. Gli embrioni di Xenopus tropicalis sono stati organizzati secondo le tabelle di Nieuwkoop e Faber 11 . <ol><li> Induzione dell&#39;ovulazione <ol><li> Per pre-prime, iniettare gonadotropina corionica umana (hCG) nel sacro linfatico dorsale di un paio di rane (un maschio e una femmina) il giorno prima del giorno di accoppiamento. Iniettare 20 unità per rana femminile e 10 unità per maschio. Casa un maschio e una femmina nello stesso carro armato durante la notte (per più di 18 h). </li><li> Per prime, il giorno successivo, iniettare 200 unità di hCG alla femmina pre-primata e 100 unità di hCG al pre-preparatomaschio; La femmina iniziata comincerà a gettare le uova in circa 3 ore e continuerà a farlo per tutta la giornata. Tenere la coppia maschile e femminile insieme per l&#39;accoppiamento naturale o in vasche separate per la fertilizzazione in vitro (punto 1.2). </li></ol></li><li> Fecondazione NOTA: Le uova possono essere fertilizzate mediante fertilizzazione naturale o fertilizzazione in vitro . Nell&#39;accoppiamento naturale, le uova vengono fecondate in quanto sono state posate, e quindi il tempo della fecondazione non può essere controllato. In alternativa, una rana femminile iniziata può essere alloggiata in un serbatoio separato e le uova non fertilitate possono essere raccolte per la fecondazione in vitro , che genera centinaia di embrioni fertilizzati allo stesso tempo. Quest&#39;ultimo approccio è utile quando viene effettuata la microinezione a blastomere prima dell&#39;etichettatura dei recipienti. In questo approccio, tuttavia, un maschio viene sacrificato. <ol><li> Accoppiamento naturale <ol><li> Lasciare la coppia primaria femminile e maschile nello stesso serbatoio. Il maschio stringerebbe la fEmale, che porta alla fecondazione immediata delle uova posate. Raccogliere le uova con una pipetta di vetro o di plastica e trasferirle in un piatto di Petri. Per evitare che le uova si attaccino alla pipetta, stendere la superficie interna della pipetta con 0,5% di albumina bovina secca (BSA). </li></ol></li><li> Fecondazione in vitro (IVF) <ol><li> Separare la femmina primed dal maschio dopo la priming. La femmina comincerà a posare le uova spontaneamente in circa 3 ore. Trasferire alcune uova posate usando una pipetta BSA-rivestita in un piatto di Petri e controllare la loro qualità sotto un microscopio. Se sono state posate uova sane (pigmento trasparente, palla a forma di elastico), preparatevi a disseccare i testicoli dal maschio primato. </li><li> Crea 0,4% di metanesolfonato di tricaina (MS222) per l&#39;eutanasia e inietta 300 μL nel sacro linfatico dorsale del maschio primogenito. In circa 10 minuti, il maschio perderà il suo senso di equilibrio e rimarrà a galla; Confermare che il maschio è eutanizzato premendo una gamba posteriore con aDue pinze sbilanciate e osservando nessuna risposta. </li><li> Disseccare i due testicoli, pulirli tagliandoli velocemente su carta sporca e trasferirli in un microtubo contenente 1 ml del 60% di Leibovitz L-15 Medium (60%) integrato con 10% di siero fetale fetale (FBS); Una procedura dettagliata è descritta altrove 10 . </li><li> Mescolare delicatamente i testicoli con un pestello per estrarre lo sperma. A questa concentrazione ( cioè 2 teste in 1 ml di 10% di FBS in 60% di L-15), alcune gocce della soluzione testica (0,1 ml) possono concimare circa trecento uova. Lo sperma rimanente può essere conservato a 4 ° C in un tubo ben sigillato e usato per il IVF il giorno successivo. </li><li> Spremere le uova dalla femmina in un piccolo piatto di Petri. Tenere la parte superiore della femmina a testa in giù sulla palma e mettere l&#39;indice tra le gambe posteriori. Diffondere le gambe posteriori con l&#39;indice e l&#39;altra mano per esporre la cloaca. Tocca la cloaca al piatto di Petri. Coat tPiatto di Petri con 0,5% BSA per distribuire uniformemente le uova come monostrato durante l&#39;IVF. </li><li> Aggiungere le gocce (0,1 mL) di substrato contenente spermatozoi L-15 alle uova. Per la fecondazione sincrona, mescolare delicatamente la soluzione spermatica attraverso il piatto. Dopo 4 minuti a temperatura ambiente, riempire il piatto di Petri con 0.01x Saline modificata di Barth (MBS), incubare per 10 minuti e sostituire la soluzione con 0.1x MBS. Le uova fecondate subiranno la prima scissione in circa 1 ora a temperatura ambiente. 1x MBS è 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,5 mM NaHCO 3 , 5 mM HEPES, 1 mM MgSO 4 e 0,7 mM CaCl2, pH 7,5. </li></ol></li></ol></li><li> (Facoltativo) Iniezione di oligonucleotidi morfolino antisenso (MOs) e / o mRNA <ol><li> Per studiare l&#39;effetto di un gene di interesse sulla formazione della nave, eseguire la microinezione di antisense MO e / o mRNA. </li><li> Per tali esperimenti, de-gelatina le uova con 2% di L-cisteina in 1x MBS (pH 7,5-7,8).Sostituire 0,1 x MBS nel piatto contenente gli embrioni fecondati con 2% di L-cisteina in 1x MBS. Versare delicatamente il piatto per mescolare la soluzione. NOTA: richiede solitamente circa 5 minuti per l&#39;eliminazione degli embrioni. Durante questo passaggio, monitorare spesso le uova per assicurarsi che non siano esagerate alla soluzione. Se le uova sono esposte, perdono elasticità e diventano appiattite, che provocheranno uno sviluppo aberrante e una letalità. </li><li> Lavare le uova de-jellied cinque volte con 0.1x MBS. Eseguire la microinezione nel 4% di Ficoll disciolto in 0.1x MBS. In genere, iniettare 4 ng di MO e 600 pg di mRNA per blastomere alla fase a due cellule. Iniettare in una sola cellula per manipolare l&#39;espressione genica solo su un lato dell&#39;embrione. Usa il lato iniettato dello stesso embrione come un controllo. </li><li> Come un altro controllo per la specificità della manipolazione genica, iniettare la stessa quantità di un controllo MO (CoMO) o mRNA di controllo ( ad esempio, beta-galattosidasi mRNA). CoMO deve avere lo stesso mPeso olecolare come MO specifico per i geni e non deve indirizzare alcun gene nel genoma di Xenopus . Per una facile visualizzazione del lato iniettato, utilizzare MO con taglio a fluoresceina o co-iniettare un tracciante ( es. EGFP mRNA). </li><li> Lasciare gli embrioni iniettati nel 4% di Ficoll per 2 ore e poi trasferirli in un nuovo piatto di Petri da 60 mm riempito di 0,1 x MBS. </li></ol></li><li> raccolta <ol><li> Sollevare gli embrioni a 23 ° C. Anche se la velocità di sviluppo può essere rallentata o accelerata utilizzando temperature inferiori o superiori a 23 ° C (range: 16-26 ° C), si raccomanda di sollevare a 23 ° C. </li></ol></li><li> (Facoltativo) Trattamento con reagenti farmacologici <ol><li> Per manipolazioni farmacologiche, somministrare farmaci agli embrioni in via di sviluppo mediante applicazione di bagno. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione dell&#39;iniezione DiI-AcLDL <ol><li> Creare una pipetta di vetro conica utilizzando un micr standardEstrattore opiper. Posizionare un tubo di vetro borosilicato nel tirante della micropipetta e utilizzare le seguenti impostazioni: pressione, 200; Calore, 30; Tirare, 30; Velocità, 120; Tempo, 200. </li><li> Conservare la soluzione di base di Di-AcLDL a 4 ° C. Prendi la parte superiore libera della soluzione per l&#39;iniezione, ma non le particelle precipitate sul fondo del tubo. Eventuali detriti nella pipetta di vetro disturberanno la corretta espulsione della soluzione. </li><li> Riempire la pipetta di vetro preparata con una quantità adeguata di soluzione DiI-AcLDL (~ 5 μL) usando un microelaboratore. </li><li> Spingere la punta della pipetta di vetro a poco a poco usando un paio di pinze (numero 55). Impostare il sistema di iniezione controllato dalla pressione in modo che circa 5 nL di soluzione venga espulsa alla volta; 50-60 nL di DiI-AcLDL è sufficiente per macchiare i vasi di un embrione. </li><li> Non lasciare in aria la pipetta caricata da DiI-AcLDL per un lungo periodo di tempo per evitare l&#39;essiccazione. Tenere la punta della pipetta sommersa in 0,04% MS222 in soluzione 0.1S MBS. Poco prima di iniettarlo nell&#39;embrione (passo 4.2.1), verificare se la stessa quantità di colorante viene espulsa. </li></ol> 3. Impostazione dell&#39;iniezione <ol><li> Stampo di Sylgard <ol><li> Per preparare un piccolo stampo Sylgard, mescolare la base Sylgard e l&#39;agente di stiro con un rapporto di peso compreso tra 10 e 1. Riempire con questa soluzione mista circa la metà di un piccolo piatto di Petri (piatto da 35 mm o 60 mm) e lasciarlo solidificare per circa 48 h a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Anestesia <ol><li> Utilizzare 0,04% MS222 in 1x MBS (pH 7,5-8,0) per l&#39;anestesia. Quando è necessaria una lunga anestesia ( ad es. Durante l&#39;imaging in diretta), utilizzare 0.04% MS222 in 0.1x MBS per ridurre lo squilibrio osmotico. Per regolare il pH, aggiungere alcune gocce di NaOH (~ 20 μL) e controllare il pH utilizzando carta pH. </li><li> Attendere finché gli embrioni trasferiti non si muovono. Toccare le alette dorsali degli embrioni e verificare se rispondono per confermare la completa anesthesia. </li></ol></li><li> Posizionamento degli embrioni per iniezione <ol><li> Inserisci la superficie dello stampo temprato Sylgard con una lama sottile e affilata. Fare un indentazione concava a forma di V in cui collocare gli embrioni (vedere la Figura 2D ). Posizionare un embrione anestetizzato, con l&#39;aspetto ventrale, in modo leggermente obliquo (circa 30 °) ( Figura 2D ). </li><li> Riempire lo stampo con la soluzione MS222 e collocare gli embrioni nello stampo. </li></ol></li></ol> 4. Iniezione DiI-AcLDL <ol><li> Incisione della pelle che sovrasta il cuore <ol><li> Preparare due perni (Minutiens, 0,10 mm) per tagliare la pelle sovrastante il cuore. Fissare bene ogni perno ad un porta-pin; Il cuore deve essere facilmente identificabile mentre pulsava ( Figura 2A-2C , rosa). </li><li> Puntare la pelle di un embrione con un perno. Inserire il perno attraverso il foro nello spazio tra il cuore e la pelle ( Figura 2C </strOng&gt;, freccia solida). Non forare il cuore. Posizionare la parte inserita di questo perno nella regione in cui verrà eseguita l&#39;incisione. </li><li> Effettuare un&#39;incisione lineare strofinando delicatamente l&#39;altro perno tenuto fuori dalla pelle contro il perno inserito. Estendete delicatamente questa incisione con due punte, esponendo il cuore ( figura 2B &#39; e 2D&#39; , freccia). La pipetta caricata con DiI-AcLDL può ora avvicinarsi direttamente al cuore ( figura 2D &#39; ). </li></ol></li><li> Iniezione <ol><li> Inserire la punta della pipetta di vetro caricata nel cuore e iniettare 50-60 nL di soluzione DiI-AcLDL in circa 10 impulsi di espulsione. Non iniettare una quantità eccessiva di soluzione, in quanto provoca il rottura del cuore. Controllare se il cuore continua a battere dopo l&#39;iniezione. Dopo ogni iniezione, controllare se venga espulsa la stessa quantità di DiI-AcLDL; Altrimenti, la punta della pipetta può essere bloccata (vedere passo 2.5). </li></ol></li><li><stroNg&gt; Ripristino e screening visivo <ol><li> Trasferite gli embrioni iniettati in un nuovo piatto di Petri riempito di 0,1x MBS per il recupero. Dopo 5-10 minuti, i tadpoles dovrebbero riconquistare la coscienza e iniziare a muoversi. A questo punto le imbarcazioni contrassegnate possono essere riprese. Si raccomanda di visualizzare visivamente embrioni con etichettatura con successo con un microscopio a fluorescenza ( Figura 3A e 3B ). Se una quantità insufficiente di DiI-AcLDL viene iniettata in un embrione, può essere nuovamente iniettata ( Figura 3C ). </li><li> Scartare i tadpoles che hanno altri organi etichettati ( Figura 3D ). Continuare fino a ottenere il numero richiesto di embrioni con etichettatura con successo. </li></ol></li><li> (Facoltativo) Fissazione degli embrioni <ol><li> Per una più approfondita imaging dei vasi sanguigni, utilizzare la microscopia confocale; Potrebbe essere più facile fissare gli embrioni etichettati per la microscopia confocale. Prima di anestetizzare gli embrioni etichettati in 0,04% MS222 in 1x MBS (pH 7,5-8,0) e poi fissarli in 4% di paraformaldeide in 1X salina fosfato-tamponata (PBS) per 1 ora a temperatura ambiente. Gli embrioni fissi possono essere conservati per diversi giorni a 4 ° C; Proteggere i campioni iniettati dalla luce per evitare la fotolibrazione del DiI. </li></ol></li></ol> 5. Imaging di DiI-AcLDL <ol><li> Imaging stereoscopico <ol><li> Scattare fotografie sotto un microscopio stereoscopico a fluorescenza ( Figura 3 ) per valutare la morfologia complessiva della vasculatura. </li><li> Sciogliere 1% agarosio in 1x PBS per embrioni fissi o in 1x MBS per imaging live. Versate l&#39;agarosio fuso in un piatto di Petri e aspettate che si solidifichi. Effettuare una indentazione poco profonda sulla superficie del gel agarosico che si adatta all&#39;embrione da imaging quando si trova sul lato laterale. Riempire il piatto con tampone (soluzione MS222 per embrioni anestetizzati o 1x PBS per embrioni fissi). </li></ol></li><li> Microscopia a fluorescenza (Rhodamine filter set) <ol><li> Poichè DiI è un colorante verde emesso e emesso di rosso, l&#39;immagine utilizza un set di filtri standard per rodamine o fluorofori spettrali collegati (massima eccitazione a 554 nm e emissione a 571 nm). Posizionare gli embrioni iniettati negli indentazioni dello stampo agarosio e fotografare ( Figura 3 ). </li></ol></li><li> Microscopia confocale NOTA: Per un&#39;analisi più approfondita dell&#39;architettura vascolare, utilizzare la microscopia confocale. <ol><li> Se si utilizza un microscopio invertito, posizionare gli embrioni su un piatto in vetro. Aggiungere alcune gocce di 1x PBS e immobilizzarle mettendo un coperchio di copertura sulla parte superiore. Rimuovere l&#39;eccesso di PBS. Se si devono immaginare embrioni vivi, utilizzare embrioni anestetizzati e utilizzare 0.015% MS222 in 0.1x MBS anziché PBS. </li><li> Per l&#39;imaging a basso ingrandimento, utilizzare un obiettivo 4X a 10X per trovare l&#39;area di interesse; La parte rostrale della vena cardinale posteriore (PCV) è una regione utile per indagare l&#39;angiogenesi dello sviluppo (Figura 4, tratteggiatascatole). <ol><li> Utilizzare un&#39;impostazione di acquisizione per un fluoroforo di emissione rossa (come Rhodamine). </li><li> Effettuare immagini z-stacked facendo imaging la metà laterale di un embrione. Innanzitutto, concentrarsi sul PCV sul lato laterale vicino all&#39;obiettivo e quindi impostare il limite inferiore del fuoco nella posizione in cui i vasi più vicini all&#39;obiettivo sono concentrati. Impostare il limite superiore nella posizione in cui la parte mediale del PCV in scansione può essere focalizzata. Immagine l&#39;intera metà laterale dell&#39;embrione. Utilizzare software che memorizza i metadati sulle impostazioni di acquisizione, ad esempio le scale x, y e z, in quanto sono necessarie per calcolare le lunghezze del vaso. </li><li> Se necessario, utilizzare la modalità di scansione delle mattonelle per rappresentare l&#39;intera vasculatura di un embrione. Determinare empiricamente il numero di piastrelle orizzontali e verticali. </li></ol></li><li> Per l&#39;imaging ad alta ingrandimento, seguire le procedure sopra descritte per rappresentare la parte rostrale del PCV e delle 4 vene rostral-intersomitiche (ISV) ( Figura 4 ,Casella tratteggiata). Regolare il numero di stack (z-stack) e delle piastrelle (scansione delle piastrelle) in modo appropriato. </li></ol></li></ol> 6. Quantificazione delle navi con marchio DiI NOTA: Le navi con marchio DiI possono essere tracciate manualmente o utilizzando software. Utilizziamo un semplice tracciatore di neurite, un plugin gratuito ImageJ (NIH), che consente il tracciamento semi-automatico di strutture tubolari come i vasi sanguigni e le neurite 12 . Utilizzando questo software libero, è possibile calcolare i seguenti parametri. Una procedura dettagliata per l&#39;utilizzo di questo software è descritta altrove (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . Sotto, usiamo esempi della vasculatura di embrioni in cui la segnalazione Tie2 è inibita o migliorata ( Figura 4A-4C ) 5 . L&#39;esposizione di embrioni iniettati da Antisense Tie2MO riduce l&#39;angiogenesi e riduce gli ISV ( Figura 4B ), mentre la coinezione di Tie2 costitutivamente attivaL&#39;mRNA mutante (caTie2 mRNA) sovrascrive questo fenotipo, provocando rami esuberanti di ISV ( Figura 4C ). <ol><li> Lunghezze ISV <ol><li> Usando il semplice tracciatore neurite, calcolare la lunghezza di ogni vaso tracciato. Calcola le lunghezze dei 4 ISV più rostral. </li></ol></li><li> Fili ISV NOTA: Negli embrioni di tipo selvatico, solo alcuni rami corti germinano dai più severi ISV di rostral alla fase 42. <ol><li> Nel semplice tracciante Neurite traccia questi piccoli vasi dopo aver fatto l&#39;ISV da cui provengono il ramo primario. Calcolare i seguenti parametri di queste filiali provenienti dagli ISV. </li><li> Numero totale del ramo <ol><li> Una volta che tutti i ISV ei rami associati sono tracciati, calcolare il numero totale di rami ( Figura 5B-5D ). </li></ol></li><li> Ordine di filiale <ol><li> Come semplice tracciante Neurite registra l&#39;ordine di ogni ramo ( Figura 5A ), calcolareE il numero di rami per ogni ordine. La maggioranza delle navi in ​​embrioni di tipo selvatico dovrebbe essere rami primari ( cioè ISV). </li></ol></li><li> Indice di complessità delle vene (VCI) <ol><li> Poiché VCI è un parametro utile per la complessità delle vasche, che dà maggiore peso ai rami di ordine superiore, calcolare il VCI per ogni embrione utilizzando la formula nella figura 5A . Ad esempio, gli embrioni iniettati da Tie2MO hanno un VCI più basso rispetto al controllo ( Figura 5B e 5C ) e gli embrioni iniettati con mTG2 hanno un VCI più elevato ( Figura 5D ). </li></ol></li></ol></li></ol>

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M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+acetylated+low-density+lipoprotein+uptake+and+low+tyrosine+kinase+with+immunoglobulin+and+epidermal+growth+factor+homology+domains-2+(Tie2)+promoter+activity+distinguish+sinusoids+from+other+vessel+types+in+murine+bone+marrow.">High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow.</a> Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Il protocollo qui presentato è stato innanzitutto sviluppato da Ali H. Brivanlou e colleghi per indagare gli eventi di sviluppo durante la formazione vascolare in Xenopus laevis 4 , ma, come mostrato in questo manoscritto, può essere applicato ad altri piccoli animali. L&#39;iniezione di tintura nel cuore è semplice da eseguire, e l&#39;intera rete vascolare può essere ripresa in un microscopio di dissezione a fluorescenza, così come un microscopio confocale. Se il colorante viene i...

La vasculogenesi, la formazione di nuovi vasi sanguigni delle cellule endoteliali appena nate e l&#39;angiogenesi, la formazione di nuovi vasi da recipienti preesistenti, sono due processi distinti che formano la vasculatura embrionale 1 . Qualsiasi disregolazione in questi processi provoca diverse malattie cardiache e anomalie strutturali delle navi. Inoltre, la crescita tumorale è associata a una crescita incontrollata dei vasi. Come tali, i meccanismi molecolari che sottendono la vasculogenesi e l&#39;angiogenesi sono oggetto di un&#39;intensa ricerca 2 . Xenopus e zebrafish sono modelli vertebrati attraenti per studi di vasculogenesi e angiogenesi, per diversi motivi. In primo luogo, i loro embrioni sono piccoli; Pertanto, è relativamente facile immaginare l&#39;intera vascolarizzazione. Secondo, lo sviluppo embrionale è rapido; Ci vorranno solo un paio di giorni per sviluppare l&#39;intera vasculatura, durante il quale la vascul in via di sviluppo<html> Può essere ripresa. Terzo, gli interventi genetici e farmacologici prima e durante la formazione della nave sono facili da eseguire, come per esempio attraverso la microinezione di anticorpi nucleotidi morfologici (MOs) nell&#39;embrione in via di sviluppo o attraverso l&#39;applicazione della droga dei farmaci 3 , 4 , 5 . Il vantaggio unico di Xenopus sullo zebrafish è che le manipolazioni embriologiche possono essere eseguite poiché Xenopus segue scomponi stereotipari olooblastici e la mappa del destino embrionale è ben definita 6 . Ad esempio, è possibile generare un embrione in cui solo un lato laterale viene manipolato geneticamente iniettando un MO antisenso a una sola cellula a due stadi. È anche possibile trapianto il primordio cardiaco da un embrione all&#39;altro per determinare se il gene esercita la sua funzione da un meccanismo intrinseco o extrinsico a celluleAss = &quot;xref&quot;&gt; 7. Anche se queste tecniche sono state sviluppate per lo più in Xenopus laevis , che è allotetraploide e quindi non è ideale per gli studi genetici, possono essere direttamente applicati a Xenopus tropicalis , una specie diploide strettamente correlata 8 . Un modo per visualizzare la vascolarizzazione in un embrione live Xenopus è quello di iniettare un colorante fluorescente per etichettare i vasi sanguigni. La lipoproteina a bassa densità acetilata (AcLDL) etichettata con una molecola fluorescente come DiI è una sonda molto utile. A differenza di LDL nonacetilato, AcLDL non si lega al recettore LDL 9 ma è endocitata da macrofagi e cellule endoteliali. L&#39;iniezione di DiI-AcLDL nel cuore di un animale vivo produce l&#39;etichettatura fluorescente specifica delle cellule endoteliali e l&#39;intera vascolarizzazione può essere rappresentata mediante microscopia a fluorescenza in embrioni vivi o fissi 4 . Qui, ci aspettiamoI protocolli dettagliati per la visualizzazione e la quantificazione dei vasi sanguigni usando DiI-AcLDL in Xenopus tropicalis ( Figura 1 ). Forniamo punti chiave pratici, con esempi di esperimenti di successo e non riusciti. Inoltre, forniamo un metodo diretto per l&#39;analisi quantitativa della complessità vascolare, che potrebbe essere utile per valutare gli effetti dei fattori genetici e ambientali sulla formazione della rete vascolare.

<table><tbody><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>SPL</td><td>10035</td><td>Sylgard mold frame</td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>SPL</td><td>10060</td><td>Embryo raising tray</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass</td><td>Sutter instrument</td><td>B100-50-10</td><td>Needle for injection</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059-10G</td><td>Coating reagent</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>D.S.P.GR Reagent</td><td></td><td>0.1x MBS component</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Superior</td><td>HSU-0111520</td><td>For confocal imaging</td></tr><tr><td>DiI-AcLDL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3484</td><td>Vessel staining solution</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH.30919.02</td><td>For storage of testis</td></tr><tr><td>Fiber Optical Illuminator</td><td>World Precision Instruments</td><td>Z-LITE-Z</td><td>Light</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td>Injection buffer</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter instrument</td><td>P-97</td><td>Injection needle puller</td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Fine Science Tool</td><td>11255-20</td><td>For embryo hatching and&lt;br/&gt; needle tip cutting</td></tr><tr><td>Glass Bottom dish</td><td>SPL</td><td>100350</td><td>For confocal imaging</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MNS Korea</td><td></td><td>For priming of frogs</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Buffering agent</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Lab. Companion</td><td>ILP-02</td><td>For raising embryos</td></tr><tr><td>KCl</td><td>DAEJUNG</td><td>6566-4400</td><td>MBS component</td></tr><tr><td>L15 medium</td><td>Gibco</td><td>11415-114</td><td>For storage of testis</td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>168149-100G</td><td>De-jellying reagent</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>MBS component</td></tr><tr><td>Microtube</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C-S</td><td>For storage of testis</td></tr><tr><td>MS222</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>Anesthetic powder</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>DAEJUNG</td><td>7647-14-5</td><td>MBS component</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S-0899</td><td>pH adjusting reagent</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Fixatives</td></tr><tr><td>PBS</td><td>BIOSESANG</td><td>P2007</td><td>Buffer for imaging</td></tr><tr><td>pH paper</td><td>Sigma</td><td>P4536-100EA</td><td>For confirming pH</td></tr><tr><td>PICO-LITER INJECTOR</td><td>Waner instruments</td><td>PLI-100A</td><td>For injection</td></tr><tr><td>Pin</td><td>Pinservice</td><td>26002-10</td><td>For incision</td></tr><tr><td>Pinholder</td><td>Scitech Korea</td><td>26016-12</td><td>For incision</td></tr><tr><td>Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td><td>World Precision Instruments</td><td>PZMIII</td><td>For visual screening</td></tr><tr><td>Standard Manual Control Micromanipulator&amp;nbsp;</td><td>Waner instruments</td><td>W4 64-0056</td><td>For microinjection</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>For DiI injection</td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Korea Ace Scientific Co.</td><td>YM.B78-400</td><td>For eggs and&lt;br/&gt; embryo collection</td></tr></tbody></table>

visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis

I vasi sanguigni forniscono ossigeno e sostanze nutritive in tutto il corpo, e la formazione della rete vascolare è sotto stretto controllo dello sviluppo. L&#39;efficace visualizzazione in vivo dei vasi sanguigni e la quantificazione affidabile della loro complessità sono fondamentali per comprendere la biologia e la malattia della rete vascolare. Qui forniamo un metodo dettagliato per la visualizzazione dei vasi sanguigni con un colorante fluorescente disponibile in commercio, il complesso di Di-AcLDL lipoproteinico a bassa densità acetilato plasmatico umano (DiI-AcLDL) e per quantificare la loro complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere etichettati con una semplice iniezione di Di-AcLDL nel cuore battente di un embrione ei vasi sanguigni in tutto l&#39;embrione possono essere immaginati in embrioni vivi o fissi. Combinata con la perturbazione del gene mediante la microinezione mirata di acidi nucleici e / o l&#39;applicazione del bagno di reagenti farmacologici, i ruoli di un gene o di un percorso di segnalazione sullo sviluppo vascolare possono essere inveStregata entro una settimana senza ricorrere a sofisticati animali geneticamente modificati. A causa del sistema venoso ben definito di Xenopus e della sua angiogenesi stereotipica, lo spruzzo di vasi preesistenti, la complessità dei vasi può essere quantificata in modo efficiente dopo gli esperimenti di perturbazione. Questo protocollo relativamente semplice dovrebbe servire come strumento facilmente accessibile in diversi settori della ricerca cardiovascolare.

Timeline degli esperimenti (figure 1 e 2) Poco dopo la fecondazione, si può eseguire una microinezione mirata per modulare l&#39;espressione genica. Ad esempio, un MO antisensivo che si lega specificamente al codone di iniziazione del mRNA Tie2 endogeno può essere iniettato, inibendo la traduzione del mRNA di bersaglio Tie2 da ostacoli sterici. Un MO può essere coniugato alla fluoresceina per una facile visualizzazione degli e...

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Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l&#39;iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

visualization-quantitative-analysis-embryonic-angiogenesis-xenopus

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

8.4K Views.  Yonsei University College of Medicine.  Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo . 

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Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizzando Analisi confocale di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A zebrafish xenograft is created by implanting mammalian tumor cells into the perivitelline space of two days-post-fertilization zebrafish embryos, followed by measuring the extent of the angiogenic response observed at an experimental endpoint up to two days post-implantation. The key advantage to this method is the ability to accurately quantitate the zebrafish host angiogenic response to the graft. This enables detailed examination of the molecular mechanisms as well as the host vs tumor contribution to the angiogenic response. The xenografted embryos can be subjected to a variety of treatments, such as incubation with potential anti-angiogenesis drugs, in order to investigate strategies to inhibit tumor angiogenesis. The angiogenic response can also be live-imaged in order to examine more dynamic cellular processes. The relatively undemanding experimental technique, cheap maintenance costs of zebrafish and short experimental timeline make this model especially useful for the development of strategies to manipulate tumor angiogenesis.

The aim of this method is to generate an in vivo model of tumor angiogenesis by xenografting mammalian tumor cells into a zebrafish embryo that has fluorescently-labelled blood vessels. By imaging the xenograft and associated vessels, a quantitative measurement of the angiogenic response can be obtained.

Imaging in vivo e quantitazione dell'ospite risposta angiogenica in Xenogrfts tumore zebrati

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Ricerca sul cancro

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biologia

Utilizzo delle larve di pesce zebra per studi efficienti sui tumori in vivo

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

Autore in primo piano: Avanzamento delle terapie antitumorali utilizzando lo xenotrapianto tumorale nel pesce zebra

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in

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Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata

Utilizzando Analisi confocale di

Cellule staminali simil-

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo

Imaging in vivo e quantitazione dell'ospite risposta angiogenica in Xenogrfts tumore zebrati

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish