Name: a graphical user interface for software-assisted tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions
Uploaded: 2017-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions at JoVE.com

Die Autoren bestätigen die Finanzierung von der DFG (EXC-1003 bis MG).

1. Zellkultur <ol><li> Kultur-HeLa- oder COS-Zellen in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g / l D-Glucose, L-Alanin-L-glutamintipeptid, Pyruvat, 10% fötalem Rinderserum und 10 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin. Kultur-Neuronen in Kulturmedien ohne L-Glutamin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, ergänzt mit 0,5 mM L-Alanin-L-glutamin-Dipeptid, serumfreien neuronalen Nahrungsergänzungsmitteln und 10 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin. </li><li> Sobald 40% Konfluenz erreicht ist, transfizieren Zellen mit Konstrukten der Wahl mit einem Transfektionsreagenz nach Herstelleranweisungen. Halten Sie transfizierte Zellen im Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 für 15-18 h. </li><li> Um die Veränderungen des pH-Werts und der Osmolarität während der Bildaufnahme zu reduzieren, füllen Sie die Zellkulturkammern (vor der Bildgebung) bis zu 90% mit 37 ° C vorgewärmtem Medium, das 20 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1 enthält -piperazethansulfonsäure (HEPES). VersiegelnDen Deckel, eine dünne Schicht Vakuumfett auf der Innenseite des Deckels auftragen und ihn vorsichtig auf die Kulturkammer auftragen, die die transfizierten Zellen enthält. </li></ol> 2. Bildaufnahme HINWEIS: Die Länge der Filopodien variiert von 2-10 μm 13 . Filopodien wachsen mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 0,05-0,1 μm / s 13 , 14 . <ol><li> Erfassen von Bildern mit einem Mikroskop mit 60X oder 100X Objektiv und kein Pixel Binning (hier ein Spinndisk konfokales Mikroskop). Verwenden Sie Erfassungsraten größer als 1 Hertz (Hz), um die filopodiale Dynamik zu verfolgen. Zur Minimierung von unscharfen Artefakten, Bildfilopodien nahe der Basalmembran ( dh Substratoberfläche). </li><li> Um eine reibungslose Verfolgung zu gewährleisten, stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera und die Laserintensität so ein, dass das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) größer als 4 ist. Vermeiden Sie die Sättigung einzelner Kanäle ( dh Pixelwerte von255 für 8-Bit-Bilder und 65.535 für 16-Bit-Bilder), da dies eine anschließende Bildanalyse ausschließt. </li><li> Um ein Durchbluten zu vermeiden, verwenden Sie nur Fluoreszenzmarkierungen, die mit Laserlinien und Filtern des Mikroskops kompatibel sind (Details siehe Referenz 15 ). </li></ol> 3. Bildvorverarbeitung HINWEIS: Verwenden Sie ImageJ oder andere verfügbare Software zur Vorverarbeitung von Bildern 16 , 17 . <ol><li> Wenn sich die Probe bewegt, korrigieren Sie die seitliche Drift mit der verfügbaren Software ( zB https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) vor der Analyse. Filme mit axialer Drift ausschließen (dh Bewegung in z-Richtung). </li><li> Korrekter Hintergrund ( dh Grauwerte von Bereichen außerhalb der Zelle), Bleichen ( dh kontinuierlicher Verlust bei Fluoreszenzintensität durch Beschädigung von Fluoreszenzproteinen) und eventueller Entlüftung ( dh Signal von einer GrippeOrescence-Sonde in den beiden Kanälen) mit der verfügbaren Software ( zB http://imagej.net/Kategorie:Plugins und 16 , 17 ). Hinweis: Fluoreszenzintensitäten einzelner Kanäle werden durch die Software nicht verändert. </li><li> Um eine spätere Bildanalyse sicherzustellen, speichern Sie Filme, die bestimmten Proteinkanälen in Graustufen entsprechen, als &#39;.tiff&#39; gestapeltes Dateiformat im Arbeitsordner. HINWEIS: Die Abmessungen (Größe, Länge) der Stapel müssen für alle Kanäle gleich sein. </li></ol> 4. Bildanalyse - Schritt 1: Bilder laden HINWEIS: Die hier beschriebene Software wurde in Matlab (als Programmiersoftware bezeichnet) geschrieben und läuft nur mit diesem Programm. <ol><li> Laden Sie den gezippten Ordner mit allen benötigten Dateien für die Bildanalyse von der folgenden Seite herunter: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwsind/. Entpacken und kopieren Sie Dateien in den Arbeitsordner. </li><li> Nach der Installation öffnen Sie die Programmiersoftware und führen &#39;filopodiaAnalysisM3.fig&#39; aus. GUI-Fenster # 1 wird geöffnet, wie in Abbildung 2A gezeigt . </li><li> Laden Sie die gespeicherten gestapelten &#39;.tiff&#39;-Dateien, die einem bestimmten Protein von Interesse im GUI-Fenster # 1 entsprechen, mit den Tasten &lt;1b&gt; für Protein A, &lt;1c&gt; für Protein B, &lt;1d&gt; für Protein C. Siehe Abbildung 2 und Tabelle 1 für Details. HINWEIS: Das im GUI-Fenster # 1 gezeigte Protein A fungiert als Referenzkanal für die endgültige ratiometrische Analyse. </li><li> Erstellen Sie ein überlagertes Bild der Zelle aus den Proteinkanälen, indem Sie auf &lt;1a&gt; klicken. </li><li> Klicken Sie auf &lt;2a&gt;, um den ersten Frame und &lt;2b&gt; für den letzten Frame zuzuweisen, der für die Analyse verwendet wird. </li><li> Optional können Sie den interessierenden Bereich (ROI) mit dem Filopodium von Interesse mit der Taste &lt;2h&gt; zuschneiden, das Bild drehenSingen Sie die Taste &lt;2i&gt; oder löschen Sie unerwünschte Bereiche mit dem Freiland-Werkzeug &lt;2j&gt;. HINWEIS: Um die Bildanalyse zu optimieren, empfiehlt es sich, den ROI ( zB Zuschneiden, Drehen, Löschen) zusammen mit den anderen Vorverarbeitungsschritten (Hintergrundsubtraktion, Bleichkorrekturen etc.) mit ImageJ zu isolieren. </li><li> Bewegen Sie den Schieberegler &lt;2c&gt; für jeden Rahmen für die Qualitätskontrolle und prüfen Sie, ob das Filopodium im ganzen Film deutlich sichtbar bleibt. </li></ol> 5. Bildanalyse - Schritt 2: Trace erzeugen <ol><li> Klicken Sie im GUI-Fenster # 1 auf die Schaltfläche &lt;3a&gt;, um das GUI-Fenster # 2 zu öffnen (siehe Abbildung 2B ). </li><li> Klicken Sie im GUI-Fenster # 2 auf die Schaltfläche &lt;4&gt;, um die Maske des überlagerten Zellenkörpers zu erzeugen (im GUI-Fenster # 1 nach dem Klicken auf &lt;1a&gt; generiert). Das Programm erzeugt auch die Grenze der Maske, wo der konvexe Rumpf implementiert wird, um die Scheitelpunkte zu erhalten. </li><li> CliCk-Taste &lt;5&gt;; Ein Cursor erscheint. Verwenden Sie den Cursor, um die Basis zu wählen (von wo aus der Abstand der filopodischen Spitze gemessen wird), gefolgt von der Spitze der Filopodien im Rahmen, wo sie zuerst erscheint. Um dies zu tun, verschiebe den Schieberegler im Fenster # 2). HINWEIS: Um Fehler bei der Datenausgabe zu minimieren, legen Sie den Basispunkt senkrecht unter die filopodiale Spitze entlang der Achse. Die Positionierung des Basispunktes an anderen Stellen ( z. B. seitlich verschoben) kann eine Richtungsvorspannung in Fluoreszenzwerten innerhalb des Zellkörpers einführen. </li><li> Wählen Sie mit &lt;6c&gt; die Schwellenlänge (oberhalb der sich die Filopodien biegen). Anmerkung: Diese Länge ist definiert als der Abstand zwischen dem Basispunkt (ausgewählt unter &lt;5&gt;) und der Grenze des Zellkörpers ( dh der Region, von wo aus die Filopodien anfangen zu wachsen). Der Abstand wird in Pixeln gemessen. </li><li> Geben Sie die Anzahl der Segmente an, die verwendet werden, um die Form der Filopodien im Feld &lt;6a&gt; zu approximieren. HINWEIS: Die mDie maximale Anzahl der Segmente hängt von der maximalen Länge ab, die durch das Filopodium erreicht wird, aber auch, wie sich das Filopodium biegt. Wählen Sie nicht eine Anzahl von Segmenten, die größer sind als die Anzahl der Pixel zwischen der Basis und der Spitze ( dh die Schwellenlänge). Auswählen mehrerer Segmente als die in Schritt 5.4 definierte Schwellenlänge. ( Dh Anzahl von Pixeln zwischen Basis und Spitze) führt zu einer Überschätzung der Länge des Filopodiums. </li><li> Geben Sie die Scan-Breite an, die als horizontaler Scanner dient, um die Knoten in &lt;6b&gt; zu platzieren. HINWEIS: Diese Knoten werden vom Programm verwendet, um die Linie zu verbinden, die die Basis und die Spitze mit dem Körper des Filopodiums verbindet ( dh das Rückgrat zu schaffen). Als Ausgangspunkt setzen Sie einen Wert in Pixel gleich der maximalen Länge multipliziert mit einem Faktor von <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55653/55653eq1.jpg" /> . </li><li> Geben Sie den Scan-Radius (in Pixeln) im Feld &lt;6d&gt; an. Verwenden Sie einen Wert, der etwa 50% größer ist als der obServiert Inter-Frame-Spitze Verschiebung. HINWEIS: Bei Verwendung eines sehr großen Scan-Radius können unerwünschte Konvex-Rumpf-Punkte in Rahmen aufgenommen werden, in denen keine echte Filopodialspitze vorhanden ist ( z. B. außerhalb der Flugzeugbewegung oder des niedrigen SNR). </li><li> Geben Sie den Biegewinkel im Feld &lt;6e&gt; an. HINWEIS: Die Winkelschwelle wird durch den maximalen Winkel bestimmt, den das Filopodium während der gesamten Analyse biegt. Die Angabe der Winkelschwelle hilft der Software, die Verfolgung von unerwünschten Strukturen, die von der Seite der Filopodien wachsen, auszuschließen, wenn sich die Filopodien in Richtung des Zellkörpers biegt. Das Programm arbeitet zuverlässig für Filopodien mit Kippwinkeln von weniger als 45 Grad von der vertikalen Achse. </li><li> Um das Tracking zu starten, klicken Sie im GUI-Fenster # 2 auf die Schaltfläche &lt;Track &amp; Analysis&gt;. Klicken Sie auf das Feld &quot;History Trace&quot; im GUI-Fenster # 2, um das gesamte Tracking-Protokoll für zukünftige Referenz zu speichern. HINWEIS: Nach Abschluss des Tracking-Vorgangs wird die Länge des Filopodiums in jedem Frame gespeichertDas Blatt &#39;length_vel&#39; von &#39;dynamics.xlsx&#39; für zukünftige Referenzen. Ebenso werden alle anderen Tracking-Parameter in dem Blatt mit dem Namen &#39;parameters&#39; von &#39;dynamics.xlsx&#39; gespeichert. </li><li> Wenn die Filopodie nicht automatisch in allen Frames erkannt wird, verwenden Sie die folgenden Schritte, um sie manuell zu korrigieren. <ol><li> Besuchen Sie den jeweiligen Rahmen mit dem Schieberegler in Fenster # 2 und wählen Sie die Spitze des Filopodiums manuell aus. Hinweis: Frames, bei denen keine konvexen Rumpfpunkte erkannt werden, werden durch eine blaue Region im Tracking-Fenster des GUI Window # 2 dargestellt. Es ist zwingend erforderlich, die Schaltfläche &quot;History Trace&quot; zu überprüfen, bevor das Tracking-Programm für den Zugriff auf die Knotenkoordinaten in diesem Frame initiiert wurde. </li><li> Wählen Sie die Referenzpunkte (Basis gefolgt von Tipp) mit &lt;6f&gt; im GUI-Fenster # 2. Spezifizieren Sie die anderen Parameter wie &#39;Scanlänge&#39;, &#39;Genaue Messung nach&#39; und &#39;Maximaler Biegewinkel&#39;; Für diesen Rahmen, wie in den Schritten 5.4-5.8 beschrieben. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &lt;6i&gt;, um die neuen Parameter zu speichern (spezifisch für diesen Rahmen). Die Schritte sind für alle Frames zu wiederholen, die durch den blauen Bereich angezeigt werden. </li><li> Wenn Sie fertig sind, initialisieren Sie den Tracking-Vorgang mit &lt;7&gt; neu. HINWEIS: Diese Korrektur kann auch verwendet werden, wenn das Programm plötzlich von einem Filopodial zum anderen innerhalb eines Films wechselt. Als Alternative, betrachten Sie Kuchen Filme, die mehrere Filopodien enthalten. </li></ol></li></ol> 6. Bildanalyse - Schritt 3: räumlich-zeitliche Proteinanalyse <ol><li> Zur räumlich-zeitlichen Analyse wählen Sie die durch &lt;8b&gt; dargestellte Box, gefolgt von dem interessierenden Proteinkanal (&lt;8c&gt; und / oder &lt;8d&gt; und / oder &lt;8e&gt;). Hinweis: Es ist zwingend erforderlich, Protein A vor der ratiometrischen Analyse (&lt;9a&gt;, &lt;9b&gt; und / oder &lt;9c&gt;) zu wählen, da Protein A als Referenz verwendet wird. </li><li> Klicken Sie auf &lt;8a&gt;Um die Proteinverfolgung entlang der filopodialen Länge unter Verwendung der in Schritt 5.9 erzeugten Spur zu initiieren. </li></ol> 7. Bildanalyse - Schritt 4: Verhältnis-metrische Proteinanalyse <ol><li> Kontrollkästchen &lt;9b&gt; oder &lt;9c&gt; und klicke auf die Schaltfläche &lt;9a&gt;, um die räumlich-zeitliche ratiometrische Darstellung zu erhalten. HINWEIS: Um eine falsche Darstellung der relativen Proteinkonzentration zu vermeiden, ist das ratiometrische Bild nicht als X / Y, sondern als log (X / Y) aufgetragen. Für die zukünftige Verwendung wird das ratiometrische Diagramm in den Dateien &#39;.png&#39; und &#39;.fig&#39; exportiert und rohe Plotdaten werden in der Datei &#39;dynamics.xlsx&#39; gespeichert. </li></ol> 8. Bildanalyse - Schritt 5: Filopodiale Tipanalyse <ol><li> Kontrollkästchen &lt;8f&gt; und spezifizieren die Spitzenlänge und die Schwellenlänge von der Basis mit &lt;8g&gt; und &lt;8h&gt;. Klicken Sie auf &lt;push button&gt;, um Daten in die Datei &#39;dynamics.xlsx&#39; zu speichern. Klicken Sie auf &lt;Analysieren von Proteinintensitäten&gt;, um das zu erzeugenSpuren von Proteinintensitäten der filopodialen Spitze und zur rettiometrischen Analyse zu speichern. HINWEIS: Die Tipplänge bestimmt die Anzahl der Pixel an der Spitze, die für die Analyse verwendet wird. Die Software gibt den durchschnittlichen Intensitätswert der Pixel an der Spitze über jeden Rahmen zurück. Die Schwellenlänge bestimmt den Mindestabstand von der Basis bis zur Spitze, über der das Filopodium (filopodiale Spitze) anfängt zu wachsen (und wenn das Programm beginnt, den Intensitätswert der Spitze zu verfolgen). So muss die Spitzenlänge kleiner sein als die Schwellenlänge. </li><li> Klicken Sie mit &lt;9d&gt; oder &lt;9e&gt; auf das gewünschte Verhältnis. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche Vergleichen &lt;9a&gt;, um die ratiometrischen Daten zu erzeugen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfolgung der filopodischen Wachstumsdynamik und der Analyse der relativen Proteinkonzentrationen in diesen dynamischen Strukturen über den konvexen Rumpfalgorithmus vor. Mit der Software können bis zu 3 Kanäle paarweise in einem einzigen Durchlauf verglichen werden, wobei die relativen Konzentrationen von zwei Kanälen ( dh Proteinen) während des gesamten Extensions- / Retraktionszyklus bestimmt und als Bild- und Datendateien in separaten Ordnern gespeicher...

Die räumlich-zeitliche Kontrolle von Aktin-regulatorischen Proteinen ist mit der Filopodium-Dynamik 1 , 2 verbunden . Die Verfolgung der räumlich aufgelösten Proteinkonzentration entlang der gesamten filopodialen Länge durch die Zeit ist daher entscheidend, um unser Verständnis der Mechanismen, die der Einleitung, der Dehnung, der Stabilisierung oder dem Zusammenbruch dieser dynamischen Strukturen 3 , 4 zugrunde liegen, voranzutreiben. Im Gegensatz zur Proteinanalyse im Cytosol, wo viele Zellformveränderungen in einem größeren Maßstab auftreten, sind Filopodien dynamische Mikrostrukturen, die sich kontinuierlich 5 abbiegen und sich biegen, wodurch eine Analyse unter Verwendung eines einfachen Ansatzes wie einer Zeilenabtastung verhindert wird. Verschiedene Softwarelösungen für die Verfolgung der filopodischen Form sind verfügbar 6 , 7 , 8 , 9 . GleichermaßenIse, Software zur ratiometrischen Verfolgung der Proteindynamik innerhalb des Zellkörpers wurde entwickelt 10 , 11 . Um die automatisierte Verfolgung der filopodischen Form und der räumlich-zeitlichen Proteinanalyse zu kombinieren, haben wir vor kurzem eine Bildanalyse-Software entwickelt, die auf dem Konvex-Rumpf-Algorithmus 12 basiert. Dieses neuartige Analyseverfahren, das über eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) betrieben wird, kombiniert erstmals die relative Proteinkonzentration entlang der filopodialen Länge und der Wachstumsgeschwindigkeit und ermöglicht so die genaue Messung der räumlich-zeitlichen Proteinverteilung unabhängig von der Bewegung dieser Dynamische Strukturen 12 Die Idee hinter der Software (Quellcode ist frei verfügbar, siehe unten) ist, dass einer der Ecken des konvexen Rumpfes mit der Spitze des Filopodiums übereinstimmt ( Abbildung 1A ). Durch das Betrachten des nachfolgenden RahmensR der nächste Scheitel des konvexen Rumpfes, die bewegte Spitze kann während des ganzen Films verfolgt werden. Sobald die Spitze in jedem Rahmen erfaßt wird, wird ihre Position verwendet, um eine Achse zu zeichnen, indem sie die Spitze mit einem Bezugspunkt an der Basis des Filopodiums verbindet ( Fig. 1B ). Schließlich werden unter Verwendung äquidistenter Knotenpunkte, deren Positionen durch das mittlere Pixel mit maximaler Intensität entlang der Linie orthogonal zur Achse bestimmt werden, verwendet, um ein Rückgrat zu bestimmen, das der filopodischen Form folgt. Unter Ausnutzung dieses adaptiven Rückgrats wird ein Kymograph erzeugt, um filopodiales Wachstum und Proteinkonzentrationen für bis zu drei Kanäle entlang der filopodialen Länge zu verfolgen ( Abbildung 1C ). <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> Abbildung 1: Funktionsprinzip der Bildanalyse-Software. ( A ) Der Algorithmus dahinterdie Software. In Schritt 1 spezifiziert der Benutzer die Referenz (Basis) und den Scheitelpunkt (die Spitze) des Filopodiums. In Schritt 2-1 wird das Rückgrat des Filopodiums unter Verwendung des Medianpixels mit maximalem Intensitätswert erhalten. In Schritt 3 wird das Rückgrat für das räumliche Proteinintensitätsprofil verwendet. In Schritt 2-2 verfolgt die Software automatisch die Spitze im nachfolgenden Rahmen. Die ganze Prozedur iteriert. ( B ) Schnappschuss des Algorithmus mit echtem Filopodium, das wichtige Elemente wie den konvexen Rumpf einführt, der für die Verfolgung verwendet wird. ( C ) Übersicht der Parameter, die mit dem Algorithmus gemessen werden können. Diese Zahl wurde aus Referenz 12 geändert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Die Bildanalyse-Software wird in Matlab (als Programmiersoftware bezeichnet) über einen grafischen Einsatz betriebenR-Schnittstelle Um die Flexibilität und Robustheit für die jeweilige experimentelle Einstellung zu maximieren, kann der Anwender eine Reihe von Tracking-Parametern ( zB zulässiger Biegewinkel und Interframe-Bewegung) anpassen und auch Korrekturen an den Filmen vornehmen ( zB Zuschneiden, Drehen, Entfernen von unerwünschten Objekten) ( Fig. 2A und Tabelle 1) . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GUI </td><td> Nein. </td><td> Zwingend notwendig </td><td colspan="5"> Beschreibung </td><td> Name (in GUI) </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Laden der gestapelten .tiff-Datei, die den Zellenkörper darstellt (mit dem eingecheckten Feld) oder den überlagerten Zellenkörper aus Kanälen erstellen </td><td> CellBody </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1b </td><td> Y </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt; Laden der gestapelten Bilddatei entsprechend Protein 1 </td><td> Protein 1 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Laden der gestapelten Bilddatei entsprechend Protein 2 </td><td> Protein 2 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Laden der gestapelten Bilddatei entsprechend Protein 3 </td><td> Protein 3 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1e </td><td> N </td><td colspan="5"> Setzt alles auf vorgespeicherte gestapelte Bilddateien zurück </td><td> Zurücksetzen </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Bildlaufleiste zur Ermittlung des Anfangsrahmens für die Analyse im GUI-Fenster # 2 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Bildlaufleiste zur Bestimmung des endgültigen Rahmens für die Analyse im GUI-Fenster # 2 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Bildlaufleiste für KurveNt Rahmen </td><td> N / A </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2d </td><td> N </td><td colspan="5"> Der Grauwert der Pixel, unterhalb derer alle Pixel auf Null gesetzt werden </td><td> N / A </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2e </td><td> N </td><td colspan="5"> Der Grauwert der Pixel, über die alle Pixel auf Maximalwerte gesetzt werden </td><td> N / A </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2f </td><td> N </td><td colspan="5"> Setzen Sie die Intensitätswerte der von &lt;2e&gt; &amp; &lt;2f&gt; angegebenen Pixel </td><td> Set </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2g </td><td> N </td><td colspan="5"> Spielen Sie den Intensitäts-angepassten Film </td><td> Spielen </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2h </td><td> N </td><td colspan="5"> Bild zuschneiden </td><td> Ernte </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2i </td><td> N </td><td colspan="5"> Bild drehen </td><td> Drehen </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2j </td><td> N </td><td colspan="5">Regionen im ganzen Stapel löschen </td><td> Regionen löschen </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Klicken Sie auf, um das &#39;Analysis Window&#39; zu öffnen (GUI-Fenster # 2) </td><td> Tracking-Fenster </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Geben Sie die Größe eines Pixels in Mikron ein </td><td> Geben Sie die Pixelgröße ein </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 4 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Klicken Sie hier, um das Rand- / Randbild des überlagerten Zellenkörpers zu erzeugen </td><td> Grenze </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 5 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Klicken Sie auf die Basis und die Spitze der Filopodien </td><td> Referentum </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Geben Sie die Anzahl der Segmente oder Knoten ein </td><td> Anzahl der Segmente </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Geben Sie die Scanlänge ein (senkrecht zur Achse) </td><td> Scan-Breite </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Geben Sie die Länge ein, über die die Filopodie beginnt zu verbiegen </td><td> Genaue Meas nach </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Geben Sie den Radius des Spitzenerkennungskreises ein (dh Bereich, in dem der Scheitelpunkt im nächsten Rahmen lokalisiert werden kann) </td><td> Radius der Spitzenerkennung </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6e </td><td> Y </td><td colspan="5"> Geben Sie den maximalen Winkel ein, den das Filopodium von der vertikalen Achse biegen kann </td><td> Winkelschwelle </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6f </td><td> N </td><td colspan="5"> Fügen Sie Referenzpunkte für Basis und Spitze für diesen bestimmten Rahmen hinzu </td><td> Referenz auswählen </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6g </td><td> N </td><td colspan="5"> Geben Sie die Länge ein, über die die Filopodie für diesen bestimmten Rahmen beginnt </td><td> Genaue Meas nach </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;Td&gt; 6h </td><td> N </td><td colspan="5"> Geben Sie den Radius des Erkennungskreises für diesen Rahmen ein </td><td> Radius der Spitzenerkennung </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6i </td><td> N </td><td colspan="5"> Nach Eingabe aller Parameter für den jeweiligen Rahmen klicken Sie, um die Werte in den Speicher und die Datei für weitere Referenz zu speichern </td><td> Hinzufügen </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6j </td><td> N </td><td colspan="5"> Klicken Sie hier, um die manuellen Parameter für diesen Rahmen zu löschen </td><td> Löschen </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6k </td><td> N </td><td colspan="5"> Klicken Sie auf, um alle Parameter zu löschen, die manuell über das &#39;optionale Merkmalsfeld&#39; für alle Frames gespeichert ist </td><td> Zurücksetzen </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6l </td><td> N </td><td colspan="5"> Check-in vor dem Tracking, um alle Tracking-Ergebnisse im Speicher für zukünftige Referenz zu speichern </td><td> Geschichtespur </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 7 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Klicken Sie hier, um das Tracking zu starten </td><td> Track &amp; Analysieren </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8a </td><td> N </td><td colspan="5"> Klicken Sie hier, um die Intensität des Proteinkanals zu verfolgen </td><td> Analysieren Sie Proteinintensitäten </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8b </td><td> N </td><td colspan="5"> Check-in, um die Protein-Kanal-Intensität entlang der filopodialen Länge zu verfolgen </td><td> Ganze Filopodien </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8c </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in für die Verfolgung der Referenz-Protein oder Protein A </td><td> ProteinA </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8d </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in für die Verfolgung des Proteins B </td><td> ProteinB </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8e </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in für die Verfolgung des Proteins C </td><td> Protein </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8f </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in, um die durchschnittliche Proteinintensität in th zu verfolgenE Tipp </td><td> Führender Tipp </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8g </td><td> N </td><td colspan="5"> Geben Sie die Länge der Spitze ein </td><td> Tipplänge </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8h </td><td> N </td><td colspan="5"> Geben Sie den Mindestabstand von der Basis ein, über der die Spitze beginnt zu bilden </td><td> Schwelle </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8i </td><td> N </td><td colspan="5"> Klicken Sie hier, um die Ergebnisse der führenden Tip-Analyse zu speichern </td><td> Knopf drücken </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9a </td><td> N </td><td colspan="5"> Klicken Sie hier, um eine ratiometrische Proteinanalyse einzuleiten </td><td> Vergleichen </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9b </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in, um Protein B in Bezug auf A zu vergleichen </td><td> Log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9c </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in, um Protein C in Bezug auf A zu vergleichen </td><td> Log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;Td&gt; 9d </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in, um Protein B in Bezug auf A an der Spitze zu vergleichen </td><td> Log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9e </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in, um Protein C in Bezug auf A an der Spitze zu vergleichen </td><td> Log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10 a </td><td> N </td><td colspan="5"> Wähle andere Farbkarte (Voreinstellung: Jetplot) </td><td> Farbkarte </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10b </td><td> N </td><td colspan="5"> Bearbeiten Sie die Farbkarte </td><td> Farbkarte bearbeiten </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Übersicht aller Funktionen In der GUI Windows # 1 und # 2 präsentieren. Sobald dies geschehen ist, erstellt das Programm einen konvexen Rumpf und verfolgt automatisch die Spitze während des Films. Aus dem Film extrahierte Parameter, wie z. B. ein ratiometrisches Kymograph, Wachstumsgeschwindigkeit und filopodiale Länge aWieder angezeigt und auch im Arbeitsordner als Bilder und als Datendateien gespeichert. Andere Parameter wie filopodiale Lebensdauer, Wachstumsrate und Retraktionsrate können dann extrahiert und aus den gespeicherten Datendateien weiter analysiert werden ( Abbildung 2B ). <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> Abbildung 2: Grafische Benutzeroberfläche zur Verwendung der Bildanalyse-Software. ( A ) GUI-Fenster # 1 dient zum Laden und Verarbeiten von Bildern. Das Programm kann bis zu 3 Proteinkanäle laden, wobei 2 Kanäle paarweise verglichen werden. Das Fenster kommt mit obligatorischen (blauen) und optionalen Funktionen (grün) für die Vorverarbeitung der Bilder vor dem Tracking ( B ) GUI Window # 2 wird für die Verfolgung der Filopodium sowie räumlich-zeitliche und Verhältnis-metrische Protein-Analyse verwendet. Auch hier sind die optionalen Funktionen grün markiert. Diese Figur ist modifi gewesenAus Referenz 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Hier stellen wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Probenvorbereitung und Softwarehandhabung vor. Wir beginnen mit detaillierten Anweisungen zur Kultivierung von Zellen und dem Erwerb von Filmen, die für die Bildanalyse optimiert sind. In diesem Abschnitt zur Datenerfassung folgt eine detaillierte Beschreibung für den Betrieb der Bildanalyse-Software. Während des gesamten Protokolls führen wir kritische Schritte und optionale Funktionen ein, die beim Sammeln und Verarbeiten von Daten berücksichtigt werden sollten. Schließlich analysieren wir Filopodien aus verschiedenen Modellsystemen mit der Bildanalyse-Software, bevor wir mit einem Vergleich der beschriebenen Bildanalyse-Software mit anderen Programmen zur filopodischen Quantifizierung und einer Diskussion über Einschränkungen und zukünftige Richtung schließen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>10% Fetal bovine serum</td><td>Biochrom AG</td><td>L11-044</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>1% penicillin/streptomycin</td><td>Biochrom AG</td><td>12212</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M stock solution)</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Citrine-N1</td><td>Addgene</td><td>54593</td><td></td></tr><tr><td>Labtech</td><td>Thermo</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Thermo</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hela</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>COS 7</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-60</td><td></td></tr><tr><td>3T3 cells</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-59</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nicon Eclipse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor</td><td>DU888 Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Unit</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr></tbody></table>

a graphical user interface for software-assisted tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions

Filopodien sind dynamische, fingerähnliche zelluläre Vorsprünge, die mit Migration und Zell-Zell-Kommunikation verbunden sind. Um die komplexen Signalisierungsmechanismen, die der filopodialen Initiation, der Dehnung und der anschließenden Stabilisierung oder dem Retraktion zugrunde liegen, besser zu verstehen, ist es entscheidend, die räumlich-zeitliche Proteinaktivität in diesen dynamischen Strukturen zu bestimmen. Um die Proteinfunktion in Filopodien zu analysieren, haben wir vor kurzem einen halbautomatischen Tracking-Algorithmus entwickelt, der sich an filopodiale Formänderungen anpasst und so eine parallele Analyse der Protrusionsdynamik und der relativen Proteinkonzentration entlang der gesamten filopodialen Länge ermöglicht. Hier stellen wir Ihnen ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für optimierte Zellhandling, Bilderfassung und Softwareanalyse vor. Für die Verwendung von optionalen Merkmalen während der Bildanalyse und der Datendarstellung stehen wir Ihnen weiter zur Verfügung, sowie Leitfaden zur Fehlerbehebung für alle kritischen Schritte auf dem Weg. Schließlich beinhalten wir auch einen Vergleich der dBeschreibende Bildanalyse-Software mit anderen Programmen zur Filopodien-Quantifizierung. Zusammen stellt das vorgestellte Protokoll einen Rahmen für eine genaue Analyse der Proteindynamik in filopodialen Vorsprüngen mit Bildanalyse-Software dar.

Unter Verwendung von COS-Zellen, die mit einem Marker für filamentösen Actin (f-Tractin 18 , rot) und einem cytosolischen Referenz (grün) transfiziert wurden, fanden wir aktinreiche filopodiale Vorsprünge ( Abbildung 3A , obere Platte). Zeitreihen zeigten, dass Filopodien sich schnell ausdehnen und zurückziehen ( Abbildung 3A , Mitteltafel). Mit der Bildanalyse-Software haben wir dann einzelne Filopo...

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A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Wir präsentieren eine Softwarelösung zur halbautomatischen Verfolgung der relativen Proteinkonzentration entlang der Länge der dynamischen zelligen Vorsprünge.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

a-graphical-user-interface-for-software-assisted-tracking-protein

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Aufrufe.  University of Muenster.  Wir präsentieren eine Softwarelösung zur halbautomatischen Verfolgung der relativen Proteinkonzentration entlang der Länge der dynamischen zelligen Vorsprünge. 

Serie: A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Forschung

Biochemie

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Biotechnik

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Immunologie und Infektion

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living cells in real time. In this protocol, we cover the fundamental steps to realize an iSCAT microscope and complement it with additional imaging channels to monitor the viability of a cell under study. Following this, we use the method for real-time detection of single proteins as they are secreted from a living cell which we demonstrate with an immortalized B-cell line (Laz388). Necessary steps concerning the preparation of microscope and sample as well as the analysis of the recorded data are discussed. The video protocol demonstrates that iSCAT microscopy offers a straightforward method to study secretion at the single-molecule level.

We present a protocol for the real-time optical detection of single unlabeled proteins as they are secreted from living cells. This is based on interferometric scattering (iSCAT) microscopy, which can be applied to a variety of different biological systems and configurations.

Markierungsfreie Imaging der einzelnen Proteine abgesondert von lebenden Zellen über iSCAT Mikroskopie

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Ingenieurwesen

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Bildverarbeitungs-Protokoll für die Analyse der Diffusion und Cluster-Größe von Membranrezeptoren durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Biologie

Probing Structural and Dynamic Properties of Trafficking Subcellular Nanostructures by Spatiotemporal Fluctuation Spectroscopy

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) is used to address the structural and dynamic properties of subcellular nanostructures, such as vesicles involved in the endo/exocytotic trafficking of solutes and biomolecules. iMSD relies on standard time-lapse imaging, is compatible with any optical setup, and does not need to dwell on single objects to extract trajectories. From each iMSD trace, a unique triplet of average structural and dynamic parameters (i.e., size, local diffusivity, anomalous coefficient) is calculated and combined to build the "iMSD signature" of the nanostructure under study. 
The potency of this approach is proved here with the exemplary case of macropinosomes. These vesicles evolve in time, changing their average size, number, and dynamic properties passing from early to late stages of intracellular trafficking. As a control, insulin secretory granules (ISGs) are used as a reference for subcellular structures that live in a stationary state in which the average structural and dynamic properties of the whole population of objects are invariant in time. The iMSD analysis highlights these peculiar features quantitatively and paves the way to similar applications at the sub-cellular level, both in the physiological and pathological states.

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) analysis is applied to macropinosomes to highlight their intrinsic time-evolving nature in terms of structural and dynamic properties. Macropinosomes are then compared to insulin secretory granules (ISGs) as a reference for subcellular structures with time-invariant average structural/dynamic properties.

Untersuchung struktureller und dynamischer Eigenschaften des Handels subzellulärer Nanostrukturen durch raumzeitliche Fluktuationsspektroskopie

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) is used to address the structural and dynamic properties of subcellular nanostructures, such as vesicles ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the construction and regeneration of tissues, and is critical in embryonic development, immunological responses, and wound healing. Dysregulation of cell motility contributes to pathological disorders, such as chronic inflammation and cancer metastasis. Cell migration, tissue invasion, axon, and dendrite outgrowth all initiate with actin polymerization-mediated cell-edge protrusions. Here, we describe a simple, efficient, time-saving method for the imaging and quantitative analysis of cell-edge protrusion dynamics during spreading. This method measures discrete features of cell-edge membrane dynamics, such as protrusions, retractions, and ruffles, and can be used to assess how manipulations of key actin regulators impact cell-edge protrusions in diverse contexts.

This protocol aims to measure the dynamic parameters (protrusions, retractions, ruffles) of protrusions at the edge of spreading cells.

Messung der Zellkanten-Überstandsdynamik während des Streuens mittels Lebendzellmikroskopie

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...