Yazarlar, DFG&#39;den (MG için EXC-1003) finansman sağlamışlardır.

1. Hücre Kültürü <ol><li> 4.5 g / L D-glükoz, L-alanin-L-glutamin dipeptid, piruvat,% 10 sığır fetüsü serumu ve 10 ünite / ml penisilin / streptomisin içeren Dulbecco&#39;nun Değiştirilmiş Kartal Ortamında (DMEM) Kültür HeLa veya COS hücreleri. 0.5 mM L-alanin-L-glutamin dipeptid, serumsuz nöronal takviyeleri ve 10 ünite / ml penisilin / streptomis ile takviye edilmiş L-glutamin, glutamik asit veya aspartik asit içermeyen kültür ortamındaki kültür nöronları. </li><li> % 40 confluency ulaşıldığında, üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon reaktifi kullanarak seçim yapıları ile transfekte hücreleri. 37 ° C&#39;de inkübe edilen transfekte hücreleri tutun ve 15-18 saat boyunca% 5 CO 2 . </li><li> Görüntü alımı sırasında pH ve ozmolarite (buharlaşma nedeniyle) değişiklikleri azaltmak için, hücre kültürü odalarını (görüntülemeye başlamadan önce)% 90&#39;a kadar, 20 mM 4- (2-hidroksietil) -1 içeren 37 ° C önceden ısıtılmış ortam ile doldurun -piperazinetansülfonik asit (HEPES). MühürlemekKapak, vakum gres ince bir tabaka içinde kapağın iç uygulayın ve yavaşça transfekte hücreleri içeren kültür odası üzerine bastırın. </li></ol> 2. Görüntü Edinimi NOT: Filopodiya uzunluğu 2-10 μm3 arasında değişir 13 . Filopodia ortalama hız 0.05-0.1 μm / sn&#39;de büyür 13 , 14 . <ol><li> 60X veya 100X objektif ve hiçbir piksel binning (burada bir dönen disk konfokal mikroskop) ile bir mikroskop kullanılarak görüntü elde edin. Filopodial dinamikleri izlemek için 1 Hertz&#39;den (Hz) büyük edinim hızları kullanın. Odak dışı nesneleri en aza indirgemek için görüntü filopodisi bazal membrana ( yani substrat yüzeyi) yakındır. </li><li> Düzgün izlemeyi sağlamak için kameranın maruz kalma zamanını ve lazer yoğunluğunu, sinyal / gürültü oranı (SNR) 4&#39;ten büyük olacak şekilde ayarlayın. Bireysel kanalların doygunluğundan kaçının ( örn .255 8-bit görüntüler için 65.535 16-bit görüntüler için), daha sonraki görüntü analizini engelleyecektir. </li><li> Kanamayı önlemek için, lazer çizgileri ve mikroskop filtreleri ile uyumlu floresan etiketleri kullanın (ayrıntılar için bkz. Referans 15 ). </li></ol> 3. Görüntü Ön işleme NOT: Görüntüleri önceden işleme koymak için ImageJ veya diğer mevcut yazılımı kullanın 16 , 17 . <ol><li> Örnek hareket ediyorsa, analiz öncesinde mevcut yazılımları kullanarak yanal sürüklenmeyi düzeltin ( örn. Https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ). Filmleri eksenel sürüklenme (yani, z-yönünde hareket) ile hariç tutun. </li><li> Doğru arka plan ( yani hücrenin dışındaki alanların gri değerleri), ağartma ( yani , flüoresans proteinlerine hasar vermesi nedeniyle floresan yoğunluğu varsa sürekli kaybı) ve olası kanama yalakı ( yani , bir gribten gelen sinyal(Örn. Http://imagej.net/Category:Plugins ve 16 , 17 ) kullanarak). Not: Münferit kanalların floresan yoğunluğu yazılım tarafından değiştirilmez. </li><li> Sonraki görüntü analizini sağlamak için, belirli protein kanallarına karşılık gelen filmleri, gri tonlamalı olarak &#39;.tiff&#39; yığınlı dosya formatı olarak çalışma klasörüne kaydedin. NOT: İstiflerin boyutları (boyut, uzunluk) tüm kanallar için aynı olmalıdır. </li></ol> 4. Görüntü Analizi - Adım 1: Resim Yükleme NOT: Burada açıklanan yazılım Matlab&#39;da (programlama yazılımı olarak anılır) yazılmıştır ve yalnızca bu program ile çalışır. <ol><li> Görüntü analizleri için gerekli tüm dosyaları içeren sıkıştırılmış klasörü aşağıdaki siteden indirin: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwdır-dir/. Dosyaları iş klasörüne sıkıştırın ve kopyalayın. </li><li> Kurulduktan sonra programlama yazılımını açın ve &#39;filopodiaAnalysisM3.fig&#39; dosyasını çalıştırın. GUI Penceresi # 1 Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi açılacaktır. </li><li> Belirli bir proteine ​​karşılık gelen kaydedilmiş yığınlanmış &#39;.tiff&#39; dosyalarını, protein C için &lt;1b&gt; protein B, &lt;1c&gt;, protein C için &lt;1d&gt; düğmelerini kullanarak GUI Pencere # 1&#39;e yükleyin. Bkz. Şekil 2 ve Tablo 1 ayrıntıları için. NOT: GUI Penceresi # 1&#39;de gösterilen Protein A, nihai rasyonel analiz için referans kanalı görevi görür. </li><li> &lt;1a&gt; &#39;yı tıklayarak protein kanallarından hücre üst üste imajı oluşturun. </li><li> İlk kareyi atamak için &lt;2a&gt;, analiz için kullanılan son kareye &lt;2b&gt; tıklayın. </li><li> İsteğe bağlı olarak, &lt;2h&gt; düğmesini kullanarak ilgilenilen filopodiumu içeren ilgi alanını (ROI) kırpın, resmi döndürünüz u&lt;2i&gt; deyin veya serbest el çizim aracını &lt;2j&gt; kullanarak istenmeyen bölgeleri silin. NOT: Görüntü analizini kolaylaştırmak için ImageJ kullanarak ROI&#39;yı (diğer bir deyişle kırpma, döndürme, silme) diğer ön işleme adımlarıyla (arka plan çıkarımı, çamaşır suyu düzeltmeleri vb.) Ayırmanız önerilir. </li><li> Kalite kontrolü için her çerçeve için kaydırıcıyı hareket ettirin ve filmin tamamında filopodyumun açıkça görülebileceğini kontrol edin. </li></ol> 5. Görüntü Analizi - Adım 2: İz Yaratın <ol><li> GUI Pencere # 2&#39;yi açmak için GUI Pencere # 1&#39;deki &lt;3a&gt; düğmesine tıklayın ( Şekil 2B&#39;ye bakın). </li><li> Üst üste yerleştirilen hücre gövdesinin maskesini oluşturmak için GUI Penceresi # 2&#39;deki &lt;4&gt; düğmesine tıklayın (&lt;1a&gt; &#39;yi tıkladıktan sonra GUI Penceresi # 1&#39;de oluşturulur). Program aynı zamanda vertex noktalarını elde etmek için konveks gövde uygulandığı maskenin sınırını oluşturur. </li><li> cliCk düğmesi &lt;5&gt;; Bir imleç belirecektir. İmleci (filopodial ucu mesafesinin ölçülmekte olduğu) tabanı ve ardından ilk göründüğü çerçevedeki filopodinin ucunu seçmek için imleci kullanın. Bunu yapmak için kaydırıcıyı Pencere # 2&#39;de hareket ettirin). NOT: Veri çıkışındaki hataları en aza indirgemek için, taban noktasını eksene göre filopodial ucun altına dikey olarak yerleştirin. Taban noktasının başka yerlere yerleştirilmesi ( örneğin yanal olarak kaydırılmış olması), hücre gövdesi içerisindeki floresans değerlerinde yönsel bir önyargı ortaya çıkarabilir. </li><li> &lt;6c&gt; &#39;yi kullanarak eşik uzunluğunu (filopodinin üzerinde bükülecek) seçin. Not: Bu uzunluk, taban noktası (&lt;5&gt; kullanılarak seçilen) ile hücre gövdesinin sınırı (filopodinin büyümeye başladığı bölge) arasındaki uzaklık olarak tanımlanır. Mesafe piksel olarak ölçülür. </li><li> &lt;6a&gt; kutusunda filopodiya şekline yaklaşmak için kullanılan kesim sayısını belirtin. NOT: mEn az sayıda bölüm, filopodyum tarafından ulaşılan maksimum uzunluğa, ayrıca filopodyumun nasıl bükülmesine bağlıdır. Taban ve ucu arasındaki piksel sayısından daha büyük sayıda segment ( örn . Eşik uzunluğu) seçmeyin. Adım 5.4&#39;te tanımlanan eşik uzunluğundan daha fazla segment seçme. ( Yani taban ve uç arasındaki piksel sayısı) filopodyumun uzunluğunun bir tahmini ile sonuçlanacaktır. </li><li> Düğümleri yerleştirmek için yatay tarayıcı görevi gören tarama genişliğini &lt;6b&gt; olarak belirtin. NOT: Bu düğümler, program tarafından, filopodyumun gövdesi ile taban ve ucu birleştiren çizginin ( yani omurgasını oluşturmak için) sığdırılması için kullanılır. Bir başlangıç ​​noktası olarak, maksimum uzunluğa bir faktör ile çarpılmış piksele bir değer koyun <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55653/55653eq1.jpg" /> . </li><li> &lt;6d&gt; kutusunda tarama yarıçapını (piksel cinsinden) belirtin. Ob&#39;dan yaklaşık% 50 daha büyük bir değer kullanınÇerçeveler arası uç yer değiştirmesini sağladı. NOT: Çok büyük bir tarama yarıçapı kullanmak, gerçek filopodial ucu bulunmayan çerçevelerde istenmeyen konveks gövde noktalarını yakalayabilir ( örneğin düzlem dışı hareket veya düşük SNR). </li><li> Kutu &lt;6e&gt; &#39;de eğme açısını belirtin. NOT: Açı eşiği, bütün analiz sırasında filopodyumun bükülmüş maksimum açısı ile belirlenir. Açı eşiğini belirtmek, filopodiya hücre gövdesine doğru eğildiğinde yazılımın filopodiya yanından büyüyen istenmeyen yapıların izlemesini hariç tutmasına yardımcı olur. Program dikey eksenden 45 dereceden daha az eğilme açısı ile filopodiya için güvenilir şekilde çalışır. </li><li> İzlemeye başlamak için GUI Penceresi # 2&#39;deki &lt;Track &amp; Analyze&gt; düğmesini tıklayın. Gelecekteki referans için tüm izleme protokolünü kaydetmek için GUI Penceresi # 2&#39;deki &#39;Geçmiş izlemesi&#39; kutusunu tıklayın. NOT: İzleme işlemi tamamlandıktan sonra, her karedeki filopodyumun uzunluğu,Gelecekteki başvurular için &#39;dynamics.xlsx&#39; dosyasının &#39;length_vel&#39; adlı sayfası. Aynı şekilde, diğer tüm izleme parametreleri &#39;dynamics.xlsx&#39; parametrelerinde saklanır. </li><li> İsteğe bağlı olarak, filopodiya tüm karelerde otomatik olarak algılanmazsa, elle düzeltmek için aşağıdaki adımları kullanın. <ol><li> Pencere # 2&#39;deki kaydırıcıyı kullanarak ilgili çerçeveyi ziyaret edin ve elle filopodyumun ucunu seçin. Not: Dışbükey gövde noktalarının bulunmadığı çerçeveler, GUI Penceresi # 2&#39;nin izleme penceresinde mavi bir bölge ile temsil edilecektir. Bu çerçeve içindeki düğüm koordinatlarına erişmek için izleme programı başlatılmadan önce &#39;Geçmiş izi&#39; düğmesini kontrol etmek zorunludur. </li><li> GUI Penceresi # 2&#39;de &lt;6f&gt; kullanarak referans noktalarını (taban ve ipucu) seçin. &#39;Tarama uzunluğu&#39;, &#39;Sonradan Hassas Ölüm&#39; ve &#39;maksimum eğme açısı&#39; gibi diğer parametreleri belirtin; 5.4-5.8 adımlarında açıklandığı gibi bu çerçeve için. </li><li> Yeni parametreleri kaydetmek için &lt;6i&gt; düğmesine tıklayın (bir kareye özgü). Adımlar mavi bölgenin gösterdiği tüm kareler için tekrarlanmalıdır. </li><li> İşiniz bittiğinde, &lt;7&gt; tuşunu kullanarak izleme prosedürünü yeniden başlatın. NOT: Bu düzeltme, program bir filmdeki bir filopodialden aniden geçiş yaparsa da kullanılabilir. Alternatif olarak, birden fazla filopodiyi içeren filmleri kırpmayı düşünün. </li></ol></li></ol> 6. Görüntü Analizi - 3. Adım: Spatio-temporal Protein Analizi <ol><li> Uzay-zaman analizi için, &lt;8b&gt; ile temsil edilen kutuyu ve ardından ilgili protein kanalı (&lt;8c&gt; ve / veya &lt;8d&gt; ve / veya &lt;8e&gt;) seçin. Not: Protein A referans olarak kullanıldığından, rasatometrik analizden (&lt;9a&gt;, &lt;9b&gt; ve / veya &lt;9c&gt;) önce Protein A seçilmesi zorunludur. </li><li> &lt;8a&gt; &#39;yı tıklayın5.9. Adımda üretilen izi kullanarak filopodial uzunluk boyunca protein izlemeyi başlatmak için. </li></ol> 7. Görüntü Analizi - 4. Adım: Oran-metrik Protein Analizi <ol><li> Uzay-zamansal oranlamalı grafiği elde etmek için &lt;9b&gt; veya &lt;9c&gt; onay kutusunu işaretleyin ve &lt;9a&gt; düğmesine tıklayın. NOT: Göreceli protein konsantrasyonunun yanlış gösterilmesini önlemek için, ratiyometrik görüntü X / Y olarak değil, log (X / Y) olarak çizilmemektedir. İleride kullanılması için, ratiyometrik grafiğe &#39;.png&#39; ve &#39;.fig&#39; format dosyaları verilir ve gebelik verisi &#39;dynamics.xlsx&#39; dosyası içinde saklanır. </li></ol> 8. Görüntü Analizi - Adım 5: Filopodial İpucu Analizi <ol><li> &lt;8f&gt; onay kutusunu işaretleyin ve ucu uzunluğunu ve eşik uzunluğunu &lt;8g&gt; ve &lt;8h&gt; kullanarak tabandan belirleyin. Verileri &#39;dynamics.xlsx&#39; dosyasına kaydetmek için &lt;basma düğmesine&gt; tıklayın. &lt;Protein yoğunluklarını analiz&gt; seçeneğini tıklayarakFilopodial ucun protein yoğunluklarının izini sürmek ve rasatiyometrik analiz için tasarruf sağlamaktır. NOT: İpucu uzunluğu, analiz için kullanılan uçtaki piksel sayısını belirler. Yazılım, her çerçevedeki uçtaki piksellerin ortalama yoğunluk değerini döndürür. Eşik uzunluğu, filopodyumun (filopodial ucu) büyümeye başladığı (ve program ucun yoğunluk değerini izlemeye başladığında) tabandan uca minimum mesafeyi belirler. Bu nedenle uç uzunluğu eşik uzunluğundan daha küçük olmalıdır. </li><li> &lt;9d&gt; veya &lt;9e&gt; kullanılarak analiz edilecek arzulanan oranı tıklayın. </li><li> Orantılı verileri oluşturmak için karşılaştırma düğmesini &lt;9a&gt; tıklayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).</li><li>Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+dendritic+spines:+a+form+of+regulated+plasticity+at+excitatory+synapses.">Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses.</a> Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).</li><li>Galic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+the+curvature-sensitive+protein+ArhGAP44+to+nanoscale+membrane+deformations+limits+exploratory+filopodia+initiation+in+neurons.">Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons.</a> Elife. 3, e03116 (2014).</li><li>Hotulainen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+mechanisms+of+actin+polymerization+and+depolymerization+during+dendritic+spine+morphogenesis.">Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis.</a> J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).</li><li>Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+buckling+of+actin+inside+filopodia+generates+traction.">Helical buckling of actin inside filopodia generates traction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+characterization+of+cell+shape+changes+during+amoeboid+motility+by+skeletonization.">Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization.</a> BMC Syst Biol. 4, 33 (2010).</li><li>Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+shape+analysis+of+neuroanatomical+structures+based+on+medial+models.">Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models.</a> Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).</li><li>Blum, H., Wathen-Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transformation+for+extracting+new+descriptors+of+shape.">A transformation for extracting new descriptors of shape.</a> Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium. , 362-380 (1967).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Machacek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+Rho+GTPase+activities+during+cell+protrusion.">Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion.</a> Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).</li><li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filopodial+length+and+spatially+resolved+protein+concentration+via+adaptive+shape+tracking.">Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).</li><li>Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+study+of+growth+cone+filopodial+extension.">A quantitative study of growth cone filopodial extension.</a> J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).</li><li>Mogilner, A., Rubinstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+filopodial+protrusion.">The physics of filopodial protrusion.</a> Biophys J. 89 (2), 782-795 (2005).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATtrack:+A+MATLAB-Based+Quantitative+Image+Analysis+Platform+for+Investigating+Real-Time+Photo-Converted+Fluorescent+Signals+in+Live+Cells.">MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells.</a> PLoS One. 10 (10), e0140209 (2015).</li><li>Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+1,4,5-trisphosphate+3-kinase+A+associates+with+F-actin+and+dendritic+spines+via+its+N+terminus.">Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus.</a> J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).</li><li>Korobova, F., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+synaptic+actin+cytoskeleton+in+hippocampal+neurons+reveals+a+mechanism+of+dendritic+spine+morphogenesis.">Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).</li><li>Cheadle, L., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+synaptogenic+protein+Farp1+links+postsynaptic+cytoskeletal+dynamics+and+transsynaptic+organization.">The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization.</a> J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).</li><li>Tarnok, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tool+for+the+quantitative+analysis+of+dendritic+filopodial+motility.">A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility.</a> Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).</li><li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuronGrowth,+a+software+for+automatic+quantification+of+neurite+and+filopodial+dynamics+from+time-lapse+sequences+of+digital+images.">NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images.</a> Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).</li><li>Costantino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+quantification+of+filopodial+dynamics.">Semi-automated quantification of filopodial dynamics.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 165-173 (2008).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Syst Biol. 7, 66 (2013).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, filopodial büyüme dinamikleri ve konveks gövde algoritması yoluyla bu dinamik yapılardaki bağıl protein konsantrasyonlarının izlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Yazılımı kullanarak, iki kanalın ( yani proteinler) göreli konsantrasyonlarının uzatma / geri çekme çevrimi boyunca belirlendiği ve ayrı klasörler halinde görüntü ve veri dosyaları olarak depolandığı tek bir programda üç kanala tek tek karşılaştırılabilir. Yazılım, rutin işlemlere ek olarak,...

Aktin düzenleyici proteinlerin spatio-temporal kontrolü filopodium dinamikler 1 , 2 ile ilişkilidir. Zamanla tüm filopodial uzunluk boyunca uzaysal olarak çözülen protein konsantrasyonunun izlenmesi, bu dinamik yapıların başlatılması, uzatılması, stabilizasyonu veya çökmesinin altında yatan mekanizmaları anlamak için çok önemlidir 3 , 4 . Birçok hücre şekli değişikliğinin daha büyük bir ölçekte gerçekleştiği sitoplazmada protein analizinin aksine, filopodiya, sürekli olarak 5 virajını kavrayan ve virüs oluşturan dinamik mikro yapılar olup, bu nedenle çizgi tarama gibi basit bir yaklaşımla analiz yapılmamaktadır. Filopodial şekli izlemek için farklı yazılım özümleri mevcuttur 6 , 7 , 8 , 9 . LikewHücre gövdesi içerisindeki protein dinamiklerinin oraniyometrik izlenmesi için yazılım geliştirilmiştir. 10 , 11 . Filopodial şekil ve uzay-zamanlı protein analizinin otomatik izlenmesini birleştirmek için son zamanlarda konveks-gövde algoritmasına 12 dayalı bir görüntü analiz yazılımı geliştirdik. Bir grafiksel kullanıcı arabirimi (GUI) aracılığıyla çalıştırılan bu yeni analiz yöntemi, filopodial uzunluk ve büyüme hızı boyunca göreli protein konsantrasyonunu ilk kez birleştirir ve böylece uzay-temporal protein dağılımının bu ölçümlerin hareketlerinden bağımsız olarak doğru ölçümünü sağlar Dinamik yapılar 12 . Yazılımın arkasındaki fikir (kaynak kodu serbestçe bulunur, aşağıya bakınız), konveks gövdesinin köşelerinden biri filopodyumun ucuyla örtüşecektir ( Şekil 1A ). Sonraki çerçeveye bakarak,Dışbükey gövdenin en yakın tepe noktası, hareketli uç tüm film boyunca izlenebilir. Ucu her karede algılandıktan sonra, konumu, filopodyum tabanında bir referans noktası ile ucu birleştirerek bir eksen çizmek için kullanılır ( Şekil 1B ). Son olarak, konumları eksene dik olan çizgide maksimum yoğunluk ile medyan piksel ile belirlenen eşit uzaklıktaki düğüm noktaları kullanılarak, filopodial şekli takip eden omurga belirlenir. Bu adaptif omurgadan yararlanarak, filopodial uzunluk boyunca üç kanala kadar filopodial büyüme ve protein konsantrasyonlarını izlemek için bir kymograph oluşturulur ( Şekil 1C ). <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> Şekil 1: Görüntü Analiz Yazılımının Çalışma Prensibi. ( A ) Arkasındaki algoritmayazılım. Adım1&#39;de kullanıcı, filopodyumun referansını (tabanı) ve tepeyi (ucu) belirtir. Adım 2-1&#39;de, filopodyumun omurgası, maksimum yoğunluk değerine sahip medyan piksel kullanılarak elde edilir. Adım 3&#39;te omurga mekansal protein yoğunluğu profili için kullanılır. Adım 2-2&#39;de, yazılım otomatik olarak sonraki çerçevedeki ucu izler. Bütün prosedür tekrarlanır. ( B ) İzlem için kullanılan konveks gövde gibi önemli elementleri sunan gerçek filopodyumlu algoritmanın anlık görüntüsü. ( C ) Algoritma ile ölçülebilen parametrelere genel bakış. Bu rakam referans 12&#39;den değiştirildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Görüntü analiz yazılımı, grafiksel bir kullanım yoluyla Matlab&#39;da (programlama yazılımı olarak anılır) çalıştırılırR arabirimi. Belli deneysel ayarlar için esneklik ve dayanıklılığı en üst düzeye çıkarmak için kullanıcı bir dizi izleme parametresini ayarlayabilir ( örneğin, izin verilen eğme açısı ve çerçeve içi hareketi) ve filmlerde bazı düzeltmeler yapabilir ( örneğin, kırpma, döndürme, istenmeyen nesnelerin giderilmesi) ( Şekil 2A ve Tablo 1) . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GUI </td><td> Yok hayır. </td><td> Zorunlu </td><td colspan="5"> Açıklama </td><td> İsim (GUI&#39;de) </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1 A </td><td> Y </td><td colspan="5"> Hücre gövdesini (kutu işaretli olarak) gösteren yığınlanmış .tiff dosyasını yüklemek veya kanallardan üst üste yerleştirilen hücre gövdesi oluşturmak </td><td> Vücut hücresi </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1b </td><td> Y </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt; Proteine ​​1 karşılık gelen istiflenmiş resim dosyası yükleniyor </td><td> Protein 1 </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Protein 2&#39;ye karşılık gelen yığılmış görüntü dosyasını yükleme </td><td> Protein 2 </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Protein 3&#39;e karşılık gelen yığınlanmış görüntü dosyasını yükleme </td><td> Protein 3 </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1e </td><td> N- </td><td colspan="5"> Önceden yüklenmiş yığılmış görüntü dosyalarına her şeyi sıfırlar </td><td> Reset </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2a </td><td> Y </td><td colspan="5"> GUI penceresinde # 2 analiz için ilk kareyi belirlemek için kaydırma çubuğu </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2b </td><td> Y </td><td colspan="5"> GUI penceresinde # 2 analiz için son kareyi belirlemek için kaydırma çubuğu </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Curre&#39;yi temsil eden kaydırma çubuğuNt çerçevesi </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2d </td><td> N- </td><td colspan="5"> Tüm piksellerin altında sıfıra ayarlanacağı piksellerin gri değeri </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2e </td><td> N- </td><td colspan="5"> Yukarıdaki tüm piksellerin maksimum değerlere ayarlanacağı piksellerin gri değeri </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2f </td><td> N- </td><td colspan="5"> &lt;2e&gt; &amp; &lt;2f&gt; ile belirtilen piksellerin yoğunluk değerlerini ayarlayın. </td><td> Set </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2 g </td><td> N- </td><td colspan="5"> Yoğunluğu ayarlanmış filmi oynat </td><td> Oyun </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2s </td><td> N- </td><td colspan="5"> Görüntüyü kırp </td><td> ekin </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2i </td><td> N- </td><td colspan="5"> Resmi Döndür </td><td> Döndürme </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2j </td><td> N- </td><td colspan="5">Tüm yığında bölgeleri sil </td><td> Bölgeleri sil </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 3 A </td><td> Y </td><td colspan="5"> &#39;Analiz Penceresi&#39;ni açmak için tıklayın (GUI penceresi # 2) </td><td> İzleme Penceresi </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 3b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Mikron cinsinden bir piksel boyutunu girin </td><td> Piksel boyutunu girin </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 4 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Üst üste yerleştirilen hücre gövdesinin sınır / kenar görüntüsünü oluşturmak için tıklayın </td><td> Sınır </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 5 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Filopodiyanın taban ve ucunu seçmek için tıklayın </td><td> Referernce </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Segmentlerin veya düğümlerin sayısını girin </td><td> Segment sayısı </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Tarama uzunluğunu girin (eksene dik olarak) </td><td> Tarama Genişliği </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Filopodinin yukarıya doğru bükülmeye başlama uzunluğunu girin </td><td> Sonra Doğru Ölçümler </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6d </td><td> Y </td><td colspan="5"> İpucu algılama çemberinin yarıçapını girin (yani, vertex&#39;in bir sonraki çerçevede lokalize edilebileceği alan) </td><td> İpucu algılama yarıçapı </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6e </td><td> Y </td><td colspan="5"> Filopodium&#39;un dikey eksenden kıvrılabileceği maksimum açıyı girin </td><td> Açı Eşiği </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6f </td><td> N- </td><td colspan="5"> Belirli çerçeve için taban ve uç için referans noktaları ekleyin </td><td> Referans seç </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6g </td><td> N- </td><td colspan="5"> Belli bir çerçeve için filopodinin bükülmeye başlandığı uzunluğu girin </td><td> Sonra Doğru Ölçümler </td></tr><tr><td> 2. </td> &lt;td&gt; 6h </td><td> N- </td><td colspan="5"> Belirli çerçeve için algılama çemberinin yarıçapını girin </td><td> İpucu algılama yarıçapı </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6i </td><td> N- </td><td colspan="5"> Belirli bir çerçeve için tüm parametreleri girdikten sonra, daha sonraki referanslar için bellek ve dosyalara değerleri depolamak için tıklayın. </td><td> Eklemek </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6j&#39;nin </td><td> N- </td><td colspan="5"> Bu karenin elle ayar parametrelerini silmek için tıklayın </td><td> silmek </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6k </td><td> N- </td><td colspan="5"> Tüm kareler için &#39;isteğe bağlı özellikler paneli&#39; kullanılarak manuel olarak saklanan tüm parametreleri silmek için tıklayın </td><td> Reset </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6l </td><td> N- </td><td colspan="5"> Gelecekteki referans için tüm izleme sonuçlarını belleğe kaydetmek için izleme işleminden önce kontrol edin </td><td> Geçmiş izi </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 7 </td><td> Y </td><td colspan="5"> İzlemeyi başlatmak için tıklayın </td><td> Takip ve Analiz </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8a </td><td> N- </td><td colspan="5"> Protein kanalı yoğunluğunu izlemeye başlamak için tıklayın </td><td> Protein yoğunluklarını analiz edin </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8b </td><td> N- </td><td colspan="5"> Filopodial uzunluk boyunca protein kanal yoğunluğunu izlemek için kontrol edin </td><td> Bütün filopodi </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8c </td><td> N- </td><td colspan="5"> Referans proteinini veya protein A&#39;yı izlemek için kontrol edin </td><td> Protein A </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8d </td><td> N- </td><td colspan="5"> B proteinini izlemek için kontrol edin </td><td> ProteinB </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8e </td><td> N- </td><td colspan="5"> Proteini C izlemek için kontrol edin </td><td> ProteinC </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8f </td><td> N- </td><td colspan="5"> Ortalama protein yoğunluğunu izlemek için kontrol edin.E uç </td><td> Öne çıkan ipucu </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8g </td><td> N- </td><td colspan="5"> İpucunun uzunluğunu girin </td><td> İpucu Uzunluğu </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8h </td><td> N- </td><td colspan="5"> Ucun üstünde şekillendirme başladığı minimum mesafeyi girin </td><td> eşik </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8i </td><td> N- </td><td colspan="5"> Öncü ipucu analiz sonuçlarını dosyaya kaydetmek için tıklayın. </td><td> Butona basınız </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 9a </td><td> N- </td><td colspan="5"> Ratiyometrik protein analizi başlatmak için tıklayın </td><td> Karşılaştırmak </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 9b </td><td> N- </td><td colspan="5"> A proteinine B proteinini karşılaştırmak için giriş yapın. </td><td> log 10 (B / A) </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 9c </td><td> N- </td><td colspan="5"> Protein C&#39;yi A&#39;ya göre karşılaştırmak için kontrol edin </td><td> log 10 (C / A) </td></tr><tr><td> 2. </td> &lt;td&gt; 9d </td><td> N- </td><td colspan="5"> Protein B&#39;yi uçtaki A&#39;ya göre karşılaştırmak için kontrol edin </td><td> log 10 (B / A) </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 9e </td><td> N- </td><td colspan="5"> Protein C&#39;yi uçtaki A&#39;ya göre karşılaştırmak için kontrol edin </td><td> log 10 (C / A) </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 10a </td><td> N- </td><td colspan="5"> Diğer renk haritasını seçin (varsayılan: Jetplot) </td><td> Renk Haritası </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 10b </td><td> N- </td><td colspan="5"> Renk haritasını düzenle </td><td> Renk haritasını düzenle </td></tr></tbody></table> Tablo 1: GUI&#39;de Bulunan Tüm İşlevlere Genel Bakış Windows # 1 ve # 2. Bu gerçekleştirildiğinde, program bir konveks gövde oluşturur ve film boyunca ucu otomatik olarak izler. Filmden çıkarılan parametreler, örneğin bir sıçanometrik kymograph, büyüme hızı ve filopodial uzunluk aYeniden görüntülenir ve iş klasörüne görüntüler ve veri dosyaları olarak saklanır. Filopodial yaşam süresi, büyüme hızı ve geri çekme oranı gibi diğer parametreler daha sonra çıkarılabilir ve depolanmış veri dosyalarından daha fazla analiz edilebilir ( Şekil 2B ). <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> Şekil 2: Görüntü Analiz Yazılımının Kullanımı için Grafik Kullanıcı Arayüzü. ( A ) GUI Penceresi # 1, resim yüklemek ve işlemek için kullanılır. Program 3 kanala kadar yükleyebilir, böylece 2 kanal karşılaştırılır. Pencere, izlemeden önce görüntülerin ön işleme tabi tutulması için zorunlu (mavi) ve isteğe bağlı özellikler (yeşil) ile birlikte gelir ( B ) GUI Pencere # 2, filopodyumun yanı sıra zamansal ve oran-metrik protein analizi izlemek için kullanılır. Yine, isteğe bağlı özellikler yeşil olarak işaretlenmiştir. Bu rakam modifi olduKaynakça 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Burada, örnek hazırlama ve yazılım kullanımı için ayrıntılı bir protokol sunmaktayız. Hücrelerin kültürlenmesi ve görüntü analizi için optimize edilmiş filmlerin edinilmesi ile ilgili ayrıntılı talimatlarla başlayacağız. Veri edinimi ile ilgili bu bölüm, görüntü analiz yazılımını çalıştırmak için ayrıntılı bir açıklama izliyor. Protokol boyunca, verileri toplamak ve işlemek için dikkate alınması gereken kritik adımları ve isteğe bağlı özellikleri tanıtmaktayız. Son olarak, açıklanan görüntü analiz yazılımının filopodial niceleme için mevcut olan diğer programlarla karşılaştırılması ve sınırlamalar ve geleceğe yönelik bir tartışma ile kapanmadan önce, filopodiyi görüntü analiz yazılımı ile farklı model sistemlerinden analiz ediyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="816">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">DMEM</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">31966-021</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">10% Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">L11-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">1% penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">12212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">B27</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">HEPES (1M stock solution)</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Citrine-N1</td>
			<td style="width:204px;">Addgene</td>
			<td style="width:204px;">54593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Labtech</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Glutamax-I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Hela</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">COS 7</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">3T3 cells</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Microscope</td>
			<td>Nicon Eclipse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU888 Ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Confocal Unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a graphical user interface for software-assisted tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions

Filopodia, göç ve hücre-hücre iletişimi ile ilişkili dinamik, parmak benzeri hücresel çıkıntılardır. Filopodial başlatma, uzama ve daha sonra stabilizasyon veya geri çekmenin altında yatan karmaşık sinyal mekanizmalarını daha iyi anlamak için, bu dinamik yapılarda uzay-zamansal protein aktivitesinin belirlenmesi çok önemlidir. Filopodiya&#39;daki protein fonksiyonunu analiz etmek için kısa bir süre önce filopodial şekil değişikliklerine uyum sağlayan yarı otomatikleştirilmiş bir izleme algoritması geliştirdik ve böylece tüm filopodial uzunluk boyunca çıkıntı dinamiklerinin ve göreceli protein konsantrasyonunun paralel analizine izin verdik. Burada, optimize hücre işleme, görüntü toplama ve yazılım analizi için ayrıntılı bir adım adım protokol sunuyoruz. Ayrıca görüntü analizi ve veri sunumu sırasında isteğe bağlı özelliklerin kullanımı ile ilgili talimatların yanı sıra yol boyunca tüm kritik adımlar için giderme yönergeleri sağlıyoruz. Son olarak, aynı zamanda dFilopodia niceleme için hazır bulunan diğer programlarla birlikte görüntü analiz yazılımını hazırlar. Sunulan protokol, birlikte görüntü analizi yazılımı kullanarak filopodial çıkıntılar protein dinamikleri doğru analiz için bir çerçeve sağlar.

Filamentöz aktin (f-traktin 18 , kırmızı) ve sitosolik referans (yeşil) için bir markör ile transfekte edilmiş COS hücrelerini kullanarak, aktin bakımından zengin filopodial çıkıntıları bulduk ( Şekil 3A , üst panel). Zaman serileri, filopodinin hızla uzaması ve geri çekilmesi olduğunu gösterdi ( Şekil 3A , orta panel). Görüntü analiz yazılımını kullanarak, bireysel filopodi...

Watch this Scientific Journal Video about A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions at JoVE.com

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Dinamik hücresel çıkıntıların uzunluğu boyunca göreli protein yoğunluğunun yarı otomatik olarak izlenmesi için bir yazılım çözümü sunmaktayız.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

a-graphical-user-interface-for-software-assisted-tracking-protein

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Görüntüleme.  University of Muenster.  Dinamik hücresel çıkıntıların uzunluğu boyunca göreli protein yoğunluğunun yarı otomatik olarak izlenmesi için bir yazılım çözümü sunmaktayız. 

Video: A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Kronik Deneyleri Montaj Elektrotlar veya mikrodiyaliz Problar Işık tedavi Diş Yapıştırıcı Reçine Uygulama

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Biyoloji

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Drosophila Uçuş sırasında Görme aracılığı Koku Takibi

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Erken Civciv Embriyo morfogenetik Doku deformasyonlar Takibi

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...