Yazarlar, DFG&#39;den (MG için EXC-1003) finansman sağlamışlardır.

1. Hücre Kültürü <ol><li> 4.5 g / L D-glükoz, L-alanin-L-glutamin dipeptid, piruvat,% 10 sığır fetüsü serumu ve 10 ünite / ml penisilin / streptomisin içeren Dulbecco&#39;nun Değiştirilmiş Kartal Ortamında (DMEM) Kültür HeLa veya COS hücreleri. 0.5 mM L-alanin-L-glutamin dipeptid, serumsuz nöronal takviyeleri ve 10 ünite / ml penisilin / streptomis ile takviye edilmiş L-glutamin, glutamik asit veya aspartik asit içermeyen kültür ortamındaki kültür nöronları. </li><li> % 40 confluency ulaşıldığında, üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon reaktifi kullanarak seçim yapıları ile transfekte hücreleri. 37 ° C&#39;de inkübe edilen transfekte hücreleri tutun ve 15-18 saat boyunca% 5 CO 2 . </li><li> Görüntü alımı sırasında pH ve ozmolarite (buharlaşma nedeniyle) değişiklikleri azaltmak için, hücre kültürü odalarını (görüntülemeye başlamadan önce)% 90&#39;a kadar, 20 mM 4- (2-hidroksietil) -1 içeren 37 ° C önceden ısıtılmış ortam ile doldurun -piperazinetansülfonik asit (HEPES). MühürlemekKapak, vakum gres ince bir tabaka içinde kapağın iç uygulayın ve yavaşça transfekte hücreleri içeren kültür odası üzerine bastırın. </li></ol> 2. Görüntü Edinimi NOT: Filopodiya uzunluğu 2-10 μm3 arasında değişir 13 . Filopodia ortalama hız 0.05-0.1 μm / sn&#39;de büyür 13 , 14 . <ol><li> 60X veya 100X objektif ve hiçbir piksel binning (burada bir dönen disk konfokal mikroskop) ile bir mikroskop kullanılarak görüntü elde edin. Filopodial dinamikleri izlemek için 1 Hertz&#39;den (Hz) büyük edinim hızları kullanın. Odak dışı nesneleri en aza indirgemek için görüntü filopodisi bazal membrana ( yani substrat yüzeyi) yakındır. </li><li> Düzgün izlemeyi sağlamak için kameranın maruz kalma zamanını ve lazer yoğunluğunu, sinyal / gürültü oranı (SNR) 4&#39;ten büyük olacak şekilde ayarlayın. Bireysel kanalların doygunluğundan kaçının ( örn .255 8-bit görüntüler için 65.535 16-bit görüntüler için), daha sonraki görüntü analizini engelleyecektir. </li><li> Kanamayı önlemek için, lazer çizgileri ve mikroskop filtreleri ile uyumlu floresan etiketleri kullanın (ayrıntılar için bkz. Referans 15 ). </li></ol> 3. Görüntü Ön işleme NOT: Görüntüleri önceden işleme koymak için ImageJ veya diğer mevcut yazılımı kullanın 16 , 17 . <ol><li> Örnek hareket ediyorsa, analiz öncesinde mevcut yazılımları kullanarak yanal sürüklenmeyi düzeltin ( örn. Https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ). Filmleri eksenel sürüklenme (yani, z-yönünde hareket) ile hariç tutun. </li><li> Doğru arka plan ( yani hücrenin dışındaki alanların gri değerleri), ağartma ( yani , flüoresans proteinlerine hasar vermesi nedeniyle floresan yoğunluğu varsa sürekli kaybı) ve olası kanama yalakı ( yani , bir gribten gelen sinyal(Örn. Http://imagej.net/Category:Plugins ve 16 , 17 ) kullanarak). Not: Münferit kanalların floresan yoğunluğu yazılım tarafından değiştirilmez. </li><li> Sonraki görüntü analizini sağlamak için, belirli protein kanallarına karşılık gelen filmleri, gri tonlamalı olarak &#39;.tiff&#39; yığınlı dosya formatı olarak çalışma klasörüne kaydedin. NOT: İstiflerin boyutları (boyut, uzunluk) tüm kanallar için aynı olmalıdır. </li></ol> 4. Görüntü Analizi - Adım 1: Resim Yükleme NOT: Burada açıklanan yazılım Matlab&#39;da (programlama yazılımı olarak anılır) yazılmıştır ve yalnızca bu program ile çalışır. <ol><li> Görüntü analizleri için gerekli tüm dosyaları içeren sıkıştırılmış klasörü aşağıdaki siteden indirin: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwdır-dir/. Dosyaları iş klasörüne sıkıştırın ve kopyalayın. </li><li> Kurulduktan sonra programlama yazılımını açın ve &#39;filopodiaAnalysisM3.fig&#39; dosyasını çalıştırın. GUI Penceresi # 1 Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi açılacaktır. </li><li> Belirli bir proteine ​​karşılık gelen kaydedilmiş yığınlanmış &#39;.tiff&#39; dosyalarını, protein C için &lt;1b&gt; protein B, &lt;1c&gt;, protein C için &lt;1d&gt; düğmelerini kullanarak GUI Pencere # 1&#39;e yükleyin. Bkz. Şekil 2 ve Tablo 1 ayrıntıları için. NOT: GUI Penceresi # 1&#39;de gösterilen Protein A, nihai rasyonel analiz için referans kanalı görevi görür. </li><li> &lt;1a&gt; &#39;yı tıklayarak protein kanallarından hücre üst üste imajı oluşturun. </li><li> İlk kareyi atamak için &lt;2a&gt;, analiz için kullanılan son kareye &lt;2b&gt; tıklayın. </li><li> İsteğe bağlı olarak, &lt;2h&gt; düğmesini kullanarak ilgilenilen filopodiumu içeren ilgi alanını (ROI) kırpın, resmi döndürünüz u&lt;2i&gt; deyin veya serbest el çizim aracını &lt;2j&gt; kullanarak istenmeyen bölgeleri silin. NOT: Görüntü analizini kolaylaştırmak için ImageJ kullanarak ROI&#39;yı (diğer bir deyişle kırpma, döndürme, silme) diğer ön işleme adımlarıyla (arka plan çıkarımı, çamaşır suyu düzeltmeleri vb.) Ayırmanız önerilir. </li><li> Kalite kontrolü için her çerçeve için kaydırıcıyı hareket ettirin ve filmin tamamında filopodyumun açıkça görülebileceğini kontrol edin. </li></ol> 5. Görüntü Analizi - Adım 2: İz Yaratın <ol><li> GUI Pencere # 2&#39;yi açmak için GUI Pencere # 1&#39;deki &lt;3a&gt; düğmesine tıklayın ( Şekil 2B&#39;ye bakın). </li><li> Üst üste yerleştirilen hücre gövdesinin maskesini oluşturmak için GUI Penceresi # 2&#39;deki &lt;4&gt; düğmesine tıklayın (&lt;1a&gt; &#39;yi tıkladıktan sonra GUI Penceresi # 1&#39;de oluşturulur). Program aynı zamanda vertex noktalarını elde etmek için konveks gövde uygulandığı maskenin sınırını oluşturur. </li><li> cliCk düğmesi &lt;5&gt;; Bir imleç belirecektir. İmleci (filopodial ucu mesafesinin ölçülmekte olduğu) tabanı ve ardından ilk göründüğü çerçevedeki filopodinin ucunu seçmek için imleci kullanın. Bunu yapmak için kaydırıcıyı Pencere # 2&#39;de hareket ettirin). NOT: Veri çıkışındaki hataları en aza indirgemek için, taban noktasını eksene göre filopodial ucun altına dikey olarak yerleştirin. Taban noktasının başka yerlere yerleştirilmesi ( örneğin yanal olarak kaydırılmış olması), hücre gövdesi içerisindeki floresans değerlerinde yönsel bir önyargı ortaya çıkarabilir. </li><li> &lt;6c&gt; &#39;yi kullanarak eşik uzunluğunu (filopodinin üzerinde bükülecek) seçin. Not: Bu uzunluk, taban noktası (&lt;5&gt; kullanılarak seçilen) ile hücre gövdesinin sınırı (filopodinin büyümeye başladığı bölge) arasındaki uzaklık olarak tanımlanır. Mesafe piksel olarak ölçülür. </li><li> &lt;6a&gt; kutusunda filopodiya şekline yaklaşmak için kullanılan kesim sayısını belirtin. NOT: mEn az sayıda bölüm, filopodyum tarafından ulaşılan maksimum uzunluğa, ayrıca filopodyumun nasıl bükülmesine bağlıdır. Taban ve ucu arasındaki piksel sayısından daha büyük sayıda segment ( örn . Eşik uzunluğu) seçmeyin. Adım 5.4&#39;te tanımlanan eşik uzunluğundan daha fazla segment seçme. ( Yani taban ve uç arasındaki piksel sayısı) filopodyumun uzunluğunun bir tahmini ile sonuçlanacaktır. </li><li> Düğümleri yerleştirmek için yatay tarayıcı görevi gören tarama genişliğini &lt;6b&gt; olarak belirtin. NOT: Bu düğümler, program tarafından, filopodyumun gövdesi ile taban ve ucu birleştiren çizginin ( yani omurgasını oluşturmak için) sığdırılması için kullanılır. Bir başlangıç ​​noktası olarak, maksimum uzunluğa bir faktör ile çarpılmış piksele bir değer koyun <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55653/55653eq1.jpg" /> . </li><li> &lt;6d&gt; kutusunda tarama yarıçapını (piksel cinsinden) belirtin. Ob&#39;dan yaklaşık% 50 daha büyük bir değer kullanınÇerçeveler arası uç yer değiştirmesini sağladı. NOT: Çok büyük bir tarama yarıçapı kullanmak, gerçek filopodial ucu bulunmayan çerçevelerde istenmeyen konveks gövde noktalarını yakalayabilir ( örneğin düzlem dışı hareket veya düşük SNR). </li><li> Kutu &lt;6e&gt; &#39;de eğme açısını belirtin. NOT: Açı eşiği, bütün analiz sırasında filopodyumun bükülmüş maksimum açısı ile belirlenir. Açı eşiğini belirtmek, filopodiya hücre gövdesine doğru eğildiğinde yazılımın filopodiya yanından büyüyen istenmeyen yapıların izlemesini hariç tutmasına yardımcı olur. Program dikey eksenden 45 dereceden daha az eğilme açısı ile filopodiya için güvenilir şekilde çalışır. </li><li> İzlemeye başlamak için GUI Penceresi # 2&#39;deki &lt;Track &amp; Analyze&gt; düğmesini tıklayın. Gelecekteki referans için tüm izleme protokolünü kaydetmek için GUI Penceresi # 2&#39;deki &#39;Geçmiş izlemesi&#39; kutusunu tıklayın. NOT: İzleme işlemi tamamlandıktan sonra, her karedeki filopodyumun uzunluğu,Gelecekteki başvurular için &#39;dynamics.xlsx&#39; dosyasının &#39;length_vel&#39; adlı sayfası. Aynı şekilde, diğer tüm izleme parametreleri &#39;dynamics.xlsx&#39; parametrelerinde saklanır. </li><li> İsteğe bağlı olarak, filopodiya tüm karelerde otomatik olarak algılanmazsa, elle düzeltmek için aşağıdaki adımları kullanın. <ol><li> Pencere # 2&#39;deki kaydırıcıyı kullanarak ilgili çerçeveyi ziyaret edin ve elle filopodyumun ucunu seçin. Not: Dışbükey gövde noktalarının bulunmadığı çerçeveler, GUI Penceresi # 2&#39;nin izleme penceresinde mavi bir bölge ile temsil edilecektir. Bu çerçeve içindeki düğüm koordinatlarına erişmek için izleme programı başlatılmadan önce &#39;Geçmiş izi&#39; düğmesini kontrol etmek zorunludur. </li><li> GUI Penceresi # 2&#39;de &lt;6f&gt; kullanarak referans noktalarını (taban ve ipucu) seçin. &#39;Tarama uzunluğu&#39;, &#39;Sonradan Hassas Ölüm&#39; ve &#39;maksimum eğme açısı&#39; gibi diğer parametreleri belirtin; 5.4-5.8 adımlarında açıklandığı gibi bu çerçeve için. </li><li> Yeni parametreleri kaydetmek için &lt;6i&gt; düğmesine tıklayın (bir kareye özgü). Adımlar mavi bölgenin gösterdiği tüm kareler için tekrarlanmalıdır. </li><li> İşiniz bittiğinde, &lt;7&gt; tuşunu kullanarak izleme prosedürünü yeniden başlatın. NOT: Bu düzeltme, program bir filmdeki bir filopodialden aniden geçiş yaparsa da kullanılabilir. Alternatif olarak, birden fazla filopodiyi içeren filmleri kırpmayı düşünün. </li></ol></li></ol> 6. Görüntü Analizi - 3. Adım: Spatio-temporal Protein Analizi <ol><li> Uzay-zaman analizi için, &lt;8b&gt; ile temsil edilen kutuyu ve ardından ilgili protein kanalı (&lt;8c&gt; ve / veya &lt;8d&gt; ve / veya &lt;8e&gt;) seçin. Not: Protein A referans olarak kullanıldığından, rasatometrik analizden (&lt;9a&gt;, &lt;9b&gt; ve / veya &lt;9c&gt;) önce Protein A seçilmesi zorunludur. </li><li> &lt;8a&gt; &#39;yı tıklayın5.9. Adımda üretilen izi kullanarak filopodial uzunluk boyunca protein izlemeyi başlatmak için. </li></ol> 7. Görüntü Analizi - 4. Adım: Oran-metrik Protein Analizi <ol><li> Uzay-zamansal oranlamalı grafiği elde etmek için &lt;9b&gt; veya &lt;9c&gt; onay kutusunu işaretleyin ve &lt;9a&gt; düğmesine tıklayın. NOT: Göreceli protein konsantrasyonunun yanlış gösterilmesini önlemek için, ratiyometrik görüntü X / Y olarak değil, log (X / Y) olarak çizilmemektedir. İleride kullanılması için, ratiyometrik grafiğe &#39;.png&#39; ve &#39;.fig&#39; format dosyaları verilir ve gebelik verisi &#39;dynamics.xlsx&#39; dosyası içinde saklanır. </li></ol> 8. Görüntü Analizi - Adım 5: Filopodial İpucu Analizi <ol><li> &lt;8f&gt; onay kutusunu işaretleyin ve ucu uzunluğunu ve eşik uzunluğunu &lt;8g&gt; ve &lt;8h&gt; kullanarak tabandan belirleyin. Verileri &#39;dynamics.xlsx&#39; dosyasına kaydetmek için &lt;basma düğmesine&gt; tıklayın. &lt;Protein yoğunluklarını analiz&gt; seçeneğini tıklayarakFilopodial ucun protein yoğunluklarının izini sürmek ve rasatiyometrik analiz için tasarruf sağlamaktır. NOT: İpucu uzunluğu, analiz için kullanılan uçtaki piksel sayısını belirler. Yazılım, her çerçevedeki uçtaki piksellerin ortalama yoğunluk değerini döndürür. Eşik uzunluğu, filopodyumun (filopodial ucu) büyümeye başladığı (ve program ucun yoğunluk değerini izlemeye başladığında) tabandan uca minimum mesafeyi belirler. Bu nedenle uç uzunluğu eşik uzunluğundan daha küçük olmalıdır. </li><li> &lt;9d&gt; veya &lt;9e&gt; kullanılarak analiz edilecek arzulanan oranı tıklayın. </li><li> Orantılı verileri oluşturmak için karşılaştırma düğmesini &lt;9a&gt; tıklayın. </li></ol>

<ol><li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).</li>
<li>Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+in+dendritic+spines%3A+a+form+of+regulated+plasticity+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses.</a> Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).</li>
<li>Galic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+recruitment+of+the+curvature-sensitive+protein+ArhGAP44+to+nanoscale+membrane+deformations+limits+exploratory+filopodia+initiation+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons.</a> Elife. 3, e03116(2014).</li>
<li>Hotulainen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+mechanisms+of+actin+polymerization+and+depolymerization+during+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis.</a> J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).</li>
<li>Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+buckling+of+actin+inside+filopodia+generates+traction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Helical buckling of actin inside filopodia generates traction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+characterization+of+cell+shape+changes+during+amoeboid+motility+by+skeletonization%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization.</a> BMC Syst Biol. 4, 33(2010).</li>
<li>Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+shape+analysis+of+neuroanatomical+structures+based+on+medial+models%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Image+Anal%22%5BJournal%5D)">Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models.</a> Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).</li>
<li>Blum, H. A transformation for extracting new descriptors of shape. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+H+%22Models+for+the+Perception+of+Speech+and+Visual+Form%3A+Proceedings+of+a+Symposium%22">Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium</a>. Wathen-Dunn, W. , MIT Press. Cambridge, MA. 362-380 (1967).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Machacek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+Rho+GTPase+activities+during+cell+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion.</a> Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+filopodial+length+and+spatially+resolved+protein+concentration+via+adaptive+shape+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).</li>
<li>Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+growth+cone+filopodial+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of growth cone filopodial extension.</a> J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).</li>
<li>Mogilner, A., Rubinstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+filopodial+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The physics of filopodial protrusion.</a> Biophys J. 89 (2), 782-795 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="https://imagescience.org/meijering/publications/download/bio2004.pdf">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATtrack%3A+A+MATLAB-Based+Quantitative+Image+Analysis+Platform+for+Investigating+Real-Time+Photo-Converted+Fluorescent+Signals+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells.</a> PLoS One. 10 (10), e0140209(2015).</li>
<li>Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+3-kinase+A+associates+with+F-actin+and+dendritic+spines+via+its+N+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus.</a> J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).</li>
<li>Korobova, F., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+synaptic+actin+cytoskeleton+in+hippocampal+neurons+reveals+a+mechanism+of+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).</li>
<li>Cheadle, L., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+synaptogenic+protein+Farp1+links+postsynaptic+cytoskeletal+dynamics+and+transsynaptic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization.</a> J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).</li>
<li>Tarnok, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tool+for+the+quantitative+analysis+of+dendritic+filopodial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility.</a> Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).</li>
<li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-dynamics%3A+automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).</li>
<li>Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuronGrowth%2C+a+software+for+automatic+quantification+of+neurite+and+filopodial+dynamics+from+time-lapse+sequences+of+digital+images%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images.</a> Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).</li>
<li>Costantino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+quantification+of+filopodial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Semi-automated quantification of filopodial dynamics.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 165-173 (2008).</li>
<li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FiloDetect%3A+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Syst Biol. 7, 66(2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, filopodial büyüme dinamikleri ve konveks gövde algoritması yoluyla bu dinamik yapılardaki bağıl protein konsantrasyonlarının izlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Yazılımı kullanarak, iki kanalın ( yani proteinler) göreli konsantrasyonlarının uzatma / geri çekme çevrimi boyunca belirlendiği ve ayrı klasörler halinde görüntü ve veri dosyaları olarak depolandığı tek bir programda üç kanala tek tek karşılaştırılabilir. Yazılım, rutin işlemlere ek olarak,...

Aktin düzenleyici proteinlerin spatio-temporal kontrolü filopodium dinamikler 1 , 2 ile ilişkilidir. Zamanla tüm filopodial uzunluk boyunca uzaysal olarak çözülen protein konsantrasyonunun izlenmesi, bu dinamik yapıların başlatılması, uzatılması, stabilizasyonu veya çökmesinin altında yatan mekanizmaları anlamak için çok önemlidir 3 , 4 . Birçok hücre şekli değişikliğinin daha büyük bir ölçekte gerçekleştiği sitoplazmada protein analizinin aksine, filopodiya, sürekli olarak 5 virajını kavrayan ve virüs oluşturan dinamik mikro yapılar olup, bu nedenle çizgi tarama gibi basit bir yaklaşımla analiz yapılmamaktadır. Filopodial şekli izlemek için farklı yazılım özümleri mevcuttur 6 , 7 , 8 , 9 . LikewHücre gövdesi içerisindeki protein dinamiklerinin oraniyometrik izlenmesi için yazılım geliştirilmiştir. 10 , 11 . Filopodial şekil ve uzay-zamanlı protein analizinin otomatik izlenmesini birleştirmek için son zamanlarda konveks-gövde algoritmasına 12 dayalı bir görüntü analiz yazılımı geliştirdik. Bir grafiksel kullanıcı arabirimi (GUI) aracılığıyla çalıştırılan bu yeni analiz yöntemi, filopodial uzunluk ve büyüme hızı boyunca göreli protein konsantrasyonunu ilk kez birleştirir ve böylece uzay-temporal protein dağılımının bu ölçümlerin hareketlerinden bağımsız olarak doğru ölçümünü sağlar Dinamik yapılar 12 . Yazılımın arkasındaki fikir (kaynak kodu serbestçe bulunur, aşağıya bakınız), konveks gövdesinin köşelerinden biri filopodyumun ucuyla örtüşecektir ( Şekil 1A ). Sonraki çerçeveye bakarak,Dışbükey gövdenin en yakın tepe noktası, hareketli uç tüm film boyunca izlenebilir. Ucu her karede algılandıktan sonra, konumu, filopodyum tabanında bir referans noktası ile ucu birleştirerek bir eksen çizmek için kullanılır ( Şekil 1B ). Son olarak, konumları eksene dik olan çizgide maksimum yoğunluk ile medyan piksel ile belirlenen eşit uzaklıktaki düğüm noktaları kullanılarak, filopodial şekli takip eden omurga belirlenir. Bu adaptif omurgadan yararlanarak, filopodial uzunluk boyunca üç kanala kadar filopodial büyüme ve protein konsantrasyonlarını izlemek için bir kymograph oluşturulur ( Şekil 1C ). <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> Şekil 1: Görüntü Analiz Yazılımının Çalışma Prensibi. ( A ) Arkasındaki algoritmayazılım. Adım1&#39;de kullanıcı, filopodyumun referansını (tabanı) ve tepeyi (ucu) belirtir. Adım 2-1&#39;de, filopodyumun omurgası, maksimum yoğunluk değerine sahip medyan piksel kullanılarak elde edilir. Adım 3&#39;te omurga mekansal protein yoğunluğu profili için kullanılır. Adım 2-2&#39;de, yazılım otomatik olarak sonraki çerçevedeki ucu izler. Bütün prosedür tekrarlanır. ( B ) İzlem için kullanılan konveks gövde gibi önemli elementleri sunan gerçek filopodyumlu algoritmanın anlık görüntüsü. ( C ) Algoritma ile ölçülebilen parametrelere genel bakış. Bu rakam referans 12&#39;den değiştirildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Görüntü analiz yazılımı, grafiksel bir kullanım yoluyla Matlab&#39;da (programlama yazılımı olarak anılır) çalıştırılırR arabirimi. Belli deneysel ayarlar için esneklik ve dayanıklılığı en üst düzeye çıkarmak için kullanıcı bir dizi izleme parametresini ayarlayabilir ( örneğin, izin verilen eğme açısı ve çerçeve içi hareketi) ve filmlerde bazı düzeltmeler yapabilir ( örneğin, kırpma, döndürme, istenmeyen nesnelerin giderilmesi) ( Şekil 2A ve Tablo 1) . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GUI </td><td> Yok hayır. </td><td> Zorunlu </td><td colspan="5"> Açıklama </td><td> İsim (GUI&#39;de) </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1 A </td><td> Y </td><td colspan="5"> Hücre gövdesini (kutu işaretli olarak) gösteren yığınlanmış .tiff dosyasını yüklemek veya kanallardan üst üste yerleştirilen hücre gövdesi oluşturmak </td><td> Vücut hücresi </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1b </td><td> Y </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt; Proteine ​​1 karşılık gelen istiflenmiş resim dosyası yükleniyor </td><td> Protein 1 </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Protein 2&#39;ye karşılık gelen yığılmış görüntü dosyasını yükleme </td><td> Protein 2 </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Protein 3&#39;e karşılık gelen yığınlanmış görüntü dosyasını yükleme </td><td> Protein 3 </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1e </td><td> N- </td><td colspan="5"> Önceden yüklenmiş yığılmış görüntü dosyalarına her şeyi sıfırlar </td><td> Reset </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2a </td><td> Y </td><td colspan="5"> GUI penceresinde # 2 analiz için ilk kareyi belirlemek için kaydırma çubuğu </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2b </td><td> Y </td><td colspan="5"> GUI penceresinde # 2 analiz için son kareyi belirlemek için kaydırma çubuğu </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Curre&#39;yi temsil eden kaydırma çubuğuNt çerçevesi </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2d </td><td> N- </td><td colspan="5"> Tüm piksellerin altında sıfıra ayarlanacağı piksellerin gri değeri </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2e </td><td> N- </td><td colspan="5"> Yukarıdaki tüm piksellerin maksimum değerlere ayarlanacağı piksellerin gri değeri </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2f </td><td> N- </td><td colspan="5"> &lt;2e&gt; &amp; &lt;2f&gt; ile belirtilen piksellerin yoğunluk değerlerini ayarlayın. </td><td> Set </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2 g </td><td> N- </td><td colspan="5"> Yoğunluğu ayarlanmış filmi oynat </td><td> Oyun </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2s </td><td> N- </td><td colspan="5"> Görüntüyü kırp </td><td> ekin </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2i </td><td> N- </td><td colspan="5"> Resmi Döndür </td><td> Döndürme </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2j </td><td> N- </td><td colspan="5">Tüm yığında bölgeleri sil </td><td> Bölgeleri sil </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 3 A </td><td> Y </td><td colspan="5"> &#39;Analiz Penceresi&#39;ni açmak için tıklayın (GUI penceresi # 2) </td><td> İzleme Penceresi </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 3b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Mikron cinsinden bir piksel boyutunu girin </td><td> Piksel boyutunu girin </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 4 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Üst üste yerleştirilen hücre gövdesinin sınır / kenar görüntüsünü oluşturmak için tıklayın </td><td> Sınır </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 5 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Filopodiyanın taban ve ucunu seçmek için tıklayın </td><td> Referernce </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Segmentlerin veya düğümlerin sayısını girin </td><td> Segment sayısı </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Tarama uzunluğunu girin (eksene dik olarak) </td><td> Tarama Genişliği </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Filopodinin yukarıya doğru bükülmeye başlama uzunluğunu girin </td><td> Sonra Doğru Ölçümler </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6d </td><td> Y </td><td colspan="5"> İpucu algılama çemberinin yarıçapını girin (yani, vertex&#39;in bir sonraki çerçevede lokalize edilebileceği alan) </td><td> İpucu algılama yarıçapı </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6e </td><td> Y </td><td colspan="5"> Filopodium&#39;un dikey eksenden kıvrılabileceği maksimum açıyı girin </td><td> Açı Eşiği </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6f </td><td> N- </td><td colspan="5"> Belirli çerçeve için taban ve uç için referans noktaları ekleyin </td><td> Referans seç </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6g </td><td> N- </td><td colspan="5"> Belli bir çerçeve için filopodinin bükülmeye başlandığı uzunluğu girin </td><td> Sonra Doğru Ölçümler </td></tr><tr><td> 2. </td> &lt;td&gt; 6h </td><td> N- </td><td colspan="5"> Belirli çerçeve için algılama çemberinin yarıçapını girin </td><td> İpucu algılama yarıçapı </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6i </td><td> N- </td><td colspan="5"> Belirli bir çerçeve için tüm parametreleri girdikten sonra, daha sonraki referanslar için bellek ve dosyalara değerleri depolamak için tıklayın. </td><td> Eklemek </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6j&#39;nin </td><td> N- </td><td colspan="5"> Bu karenin elle ayar parametrelerini silmek için tıklayın </td><td> silmek </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6k </td><td> N- </td><td colspan="5"> Tüm kareler için &#39;isteğe bağlı özellikler paneli&#39; kullanılarak manuel olarak saklanan tüm parametreleri silmek için tıklayın </td><td> Reset </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6l </td><td> N- </td><td colspan="5"> Gelecekteki referans için tüm izleme sonuçlarını belleğe kaydetmek için izleme işleminden önce kontrol edin </td><td> Geçmiş izi </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 7 </td><td> Y </td><td colspan="5"> İzlemeyi başlatmak için tıklayın </td><td> Takip ve Analiz </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8a </td><td> N- </td><td colspan="5"> Protein kanalı yoğunluğunu izlemeye başlamak için tıklayın </td><td> Protein yoğunluklarını analiz edin </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8b </td><td> N- </td><td colspan="5"> Filopodial uzunluk boyunca protein kanal yoğunluğunu izlemek için kontrol edin </td><td> Bütün filopodi </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8c </td><td> N- </td><td colspan="5"> Referans proteinini veya protein A&#39;yı izlemek için kontrol edin </td><td> Protein A </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8d </td><td> N- </td><td colspan="5"> B proteinini izlemek için kontrol edin </td><td> ProteinB </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8e </td><td> N- </td><td colspan="5"> Proteini C izlemek için kontrol edin </td><td> ProteinC </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8f </td><td> N- </td><td colspan="5"> Ortalama protein yoğunluğunu izlemek için kontrol edin.E uç </td><td> Öne çıkan ipucu </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8g </td><td> N- </td><td colspan="5"> İpucunun uzunluğunu girin </td><td> İpucu Uzunluğu </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8h </td><td> N- </td><td colspan="5"> Ucun üstünde şekillendirme başladığı minimum mesafeyi girin </td><td> eşik </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8i </td><td> N- </td><td colspan="5"> Öncü ipucu analiz sonuçlarını dosyaya kaydetmek için tıklayın. </td><td> Butona basınız </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 9a </td><td> N- </td><td colspan="5"> Ratiyometrik protein analizi başlatmak için tıklayın </td><td> Karşılaştırmak </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 9b </td><td> N- </td><td colspan="5"> A proteinine B proteinini karşılaştırmak için giriş yapın. </td><td> log 10 (B / A) </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 9c </td><td> N- </td><td colspan="5"> Protein C&#39;yi A&#39;ya göre karşılaştırmak için kontrol edin </td><td> log 10 (C / A) </td></tr><tr><td> 2. </td> &lt;td&gt; 9d </td><td> N- </td><td colspan="5"> Protein B&#39;yi uçtaki A&#39;ya göre karşılaştırmak için kontrol edin </td><td> log 10 (B / A) </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 9e </td><td> N- </td><td colspan="5"> Protein C&#39;yi uçtaki A&#39;ya göre karşılaştırmak için kontrol edin </td><td> log 10 (C / A) </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 10a </td><td> N- </td><td colspan="5"> Diğer renk haritasını seçin (varsayılan: Jetplot) </td><td> Renk Haritası </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 10b </td><td> N- </td><td colspan="5"> Renk haritasını düzenle </td><td> Renk haritasını düzenle </td></tr></tbody></table> Tablo 1: GUI&#39;de Bulunan Tüm İşlevlere Genel Bakış Windows # 1 ve # 2. Bu gerçekleştirildiğinde, program bir konveks gövde oluşturur ve film boyunca ucu otomatik olarak izler. Filmden çıkarılan parametreler, örneğin bir sıçanometrik kymograph, büyüme hızı ve filopodial uzunluk aYeniden görüntülenir ve iş klasörüne görüntüler ve veri dosyaları olarak saklanır. Filopodial yaşam süresi, büyüme hızı ve geri çekme oranı gibi diğer parametreler daha sonra çıkarılabilir ve depolanmış veri dosyalarından daha fazla analiz edilebilir ( Şekil 2B ). <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> Şekil 2: Görüntü Analiz Yazılımının Kullanımı için Grafik Kullanıcı Arayüzü. ( A ) GUI Penceresi # 1, resim yüklemek ve işlemek için kullanılır. Program 3 kanala kadar yükleyebilir, böylece 2 kanal karşılaştırılır. Pencere, izlemeden önce görüntülerin ön işleme tabi tutulması için zorunlu (mavi) ve isteğe bağlı özellikler (yeşil) ile birlikte gelir ( B ) GUI Pencere # 2, filopodyumun yanı sıra zamansal ve oran-metrik protein analizi izlemek için kullanılır. Yine, isteğe bağlı özellikler yeşil olarak işaretlenmiştir. Bu rakam modifi olduKaynakça 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Burada, örnek hazırlama ve yazılım kullanımı için ayrıntılı bir protokol sunmaktayız. Hücrelerin kültürlenmesi ve görüntü analizi için optimize edilmiş filmlerin edinilmesi ile ilgili ayrıntılı talimatlarla başlayacağız. Veri edinimi ile ilgili bu bölüm, görüntü analiz yazılımını çalıştırmak için ayrıntılı bir açıklama izliyor. Protokol boyunca, verileri toplamak ve işlemek için dikkate alınması gereken kritik adımları ve isteğe bağlı özellikleri tanıtmaktayız. Son olarak, açıklanan görüntü analiz yazılımının filopodial niceleme için mevcut olan diğer programlarla karşılaştırılması ve sınırlamalar ve geleceğe yönelik bir tartışma ile kapanmadan önce, filopodiyi görüntü analiz yazılımı ile farklı model sistemlerinden analiz ediyoruz.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>10% Fetal bovine serum</td><td>Biochrom AG</td><td>L11-044</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>1% penicillin/streptomycin</td><td>Biochrom AG</td><td>12212</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M stock solution)</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Citrine-N1</td><td>Addgene</td><td>54593</td><td></td></tr><tr><td>Labtech</td><td>Thermo</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Thermo</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hela</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>COS 7</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-60</td><td></td></tr><tr><td>3T3 cells</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-59</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nicon Eclipse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor</td><td>DU888 Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Unit</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr></tbody></table>

a graphical user interface for software-assisted tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions

Filopodia, göç ve hücre-hücre iletişimi ile ilişkili dinamik, parmak benzeri hücresel çıkıntılardır. Filopodial başlatma, uzama ve daha sonra stabilizasyon veya geri çekmenin altında yatan karmaşık sinyal mekanizmalarını daha iyi anlamak için, bu dinamik yapılarda uzay-zamansal protein aktivitesinin belirlenmesi çok önemlidir. Filopodiya&#39;daki protein fonksiyonunu analiz etmek için kısa bir süre önce filopodial şekil değişikliklerine uyum sağlayan yarı otomatikleştirilmiş bir izleme algoritması geliştirdik ve böylece tüm filopodial uzunluk boyunca çıkıntı dinamiklerinin ve göreceli protein konsantrasyonunun paralel analizine izin verdik. Burada, optimize hücre işleme, görüntü toplama ve yazılım analizi için ayrıntılı bir adım adım protokol sunuyoruz. Ayrıca görüntü analizi ve veri sunumu sırasında isteğe bağlı özelliklerin kullanımı ile ilgili talimatların yanı sıra yol boyunca tüm kritik adımlar için giderme yönergeleri sağlıyoruz. Son olarak, aynı zamanda dFilopodia niceleme için hazır bulunan diğer programlarla birlikte görüntü analiz yazılımını hazırlar. Sunulan protokol, birlikte görüntü analizi yazılımı kullanarak filopodial çıkıntılar protein dinamikleri doğru analiz için bir çerçeve sağlar.

Filamentöz aktin (f-traktin 18 , kırmızı) ve sitosolik referans (yeşil) için bir markör ile transfekte edilmiş COS hücrelerini kullanarak, aktin bakımından zengin filopodial çıkıntıları bulduk ( Şekil 3A , üst panel). Zaman serileri, filopodinin hızla uzaması ve geri çekilmesi olduğunu gösterdi ( Şekil 3A , orta panel). Görüntü analiz yazılımını kullanarak, bireysel filopodi...

Watch this Scientific Journal Video about A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions at JoVE.com

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Dinamik hücresel çıkıntıların uzunluğu boyunca göreli protein yoğunluğunun yarı otomatik olarak izlenmesi için bir yazılım çözümü sunmaktayız.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

a-graphical-user-interface-for-software-assisted-tracking-protein

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Görüntüleme.  University of Muenster.  Dinamik hücresel çıkıntıların uzunluğu boyunca göreli protein yoğunluğunun yarı otomatik olarak izlenmesi için bir yazılım çözümü sunmaktayız. 

Video: A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Biyokimya

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Biyomühendislik

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living cells in real time. In this protocol, we cover the fundamental steps to realize an iSCAT microscope and complement it with additional imaging channels to monitor the viability of a cell under study. Following this, we use the method for real-time detection of single proteins as they are secreted from a living cell which we demonstrate with an immortalized B-cell line (Laz388). Necessary steps concerning the preparation of microscope and sample as well as the analysis of the recorded data are discussed. The video protocol demonstrates that iSCAT microscopy offers a straightforward method to study secretion at the single-molecule level.

We present a protocol for the real-time optical detection of single unlabeled proteins as they are secreted from living cells. This is based on interferometric scattering (iSCAT) microscopy, which can be applied to a variety of different biological systems and configurations.

Etiket içermeyen Imaging, tek proteinler salgılanan iSCAT mikroskobu ile yaşayan hücrelerden

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Mühendislik

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Biyoloji

Probing Structural and Dynamic Properties of Trafficking Subcellular Nanostructures by Spatiotemporal Fluctuation Spectroscopy

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) is used to address the structural and dynamic properties of subcellular nanostructures, such as vesicles involved in the endo/exocytotic trafficking of solutes and biomolecules. iMSD relies on standard time-lapse imaging, is compatible with any optical setup, and does not need to dwell on single objects to extract trajectories. From each iMSD trace, a unique triplet of average structural and dynamic parameters (i.e., size, local diffusivity, anomalous coefficient) is calculated and combined to build the "iMSD signature" of the nanostructure under study. 
The potency of this approach is proved here with the exemplary case of macropinosomes. These vesicles evolve in time, changing their average size, number, and dynamic properties passing from early to late stages of intracellular trafficking. As a control, insulin secretory granules (ISGs) are used as a reference for subcellular structures that live in a stationary state in which the average structural and dynamic properties of the whole population of objects are invariant in time. The iMSD analysis highlights these peculiar features quantitatively and paves the way to similar applications at the sub-cellular level, both in the physiological and pathological states.

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) analysis is applied to macropinosomes to highlight their intrinsic time-evolving nature in terms of structural and dynamic properties. Macropinosomes are then compared to insulin secretory granules (ISGs) as a reference for subcellular structures with time-invariant average structural/dynamic properties.

Spatiotemporal Dalgalanma Spektroskopisi ile Kaçakçılık Yapan Hücre Altı Nanoyapıların Yapısal ve Dinamik Özelliklerinin İncelenmesi

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) is used to address the structural and dynamic properties of subcellular nanostructures, such as vesicles ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the construction and regeneration of tissues, and is critical in embryonic development, immunological responses, and wound healing. Dysregulation of cell motility contributes to pathological disorders, such as chronic inflammation and cancer metastasis. Cell migration, tissue invasion, axon, and dendrite outgrowth all initiate with actin polymerization-mediated cell-edge protrusions. Here, we describe a simple, efficient, time-saving method for the imaging and quantitative analysis of cell-edge protrusion dynamics during spreading. This method measures discrete features of cell-edge membrane dynamics, such as protrusions, retractions, and ruffles, and can be used to assess how manipulations of key actin regulators impact cell-edge protrusions in diverse contexts.

This protocol aims to measure the dynamic parameters (protrusions, retractions, ruffles) of protrusions at the edge of spreading cells.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...