Name: a graphical user interface for software-assisted tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions
Uploaded: 2017-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
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著者らは、DFG（EXC-1003からMG）への資金提供を認めている。

1.細胞培養<ol><li> 4.5g / LのD-グルコース、L-アラニン-L-グルタミンジペプチド、ピルビン酸塩、10％ウシ胎児血清、および10単位/ mlのペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中の培養HeLaまたはCOS細胞。 L-グルタミン、グルタミン酸またはアスパラギン酸を含まない培養培地中の培養ニューロンで、0.5mMのL-アラニン-L-グルタミンジペプチド、無血清ニューロン補充物および10単位/ mlのペニシリン/ストレプトマイシンを補充した。 </li><li> 40％のコンフルエントに達したら、製造業者の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いて細胞を選択したコンストラクトでトランスフェクションする。 37℃、5％CO 2のインキュベーターにトランスフェクションした細胞を15〜18時間保管してください。 </li><li>画像取得中のpHおよび浸透圧の変化を減少させるために、20 mM 4-（2-ヒドロキシエチル）-1を含む37℃の予熱した培地で90％まで細胞培養チャンバーを満たす（イメージング前） - ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）。封印する蓋の内側に真空グリースの薄層を塗布し、トランスフェクトされた細胞を含む培養チャンバー上に軽く押し付ける。 </li></ol> 2.画像​​取得注：糸状仮足の長さは2〜10μmです。フィロポディアは平均速度0.05-0.1μm/ sで増殖する13,14 。 <ol><li> 60Xまたは100Xの対物レンズを使用し、ピクセルビニングなしの顕微鏡（ここでは、回転円板共焦点顕微鏡）を使用して画像を取得します。フィリピンのダイナミクスを追跡するには、1ヘルツ（Hz）以上の取得速度を使用します。焦点外れアーチファクトを最小限に抑えるために、基底膜（ すなわち、基材表面）に近い画像糸状仮足（filopodia）。 </li><li>スムーズなトラッキングを保証するには、信号対雑音比（SNR）が4を超えるようにカメラの露光時間とレーザー強度を調整します。個々のチャネルの飽和を避ける8ビット画像では255、16ビット画像では65,535）、以後の画像解析はできません。 </li><li>ブリードスルーを避けるために、顕微鏡のレーザーラインとフィルターに適合する蛍光タグのみを使用してください（詳細は参考文献15を参照）。 </li></ol> 3.画像前処理注：ImageJまたは他の利用可能なソフトウェアを使用して画像16,17を前処理します。 <ol><li>サンプルが動いている場合は、分析前に利用可能なソフトウェア（ 例： https : //github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ）を使用して横方向ドリフトを補正します。アキシャルドリフト（z方向の動き）でムービーを除外します。 </li><li>バックグラウンド（ すなわち 、細胞外領域のグレー値）、漂白（ すなわち 、蛍光タンパク質の損傷による蛍光強度の場合の連続的な損失）および可能なブリードトラフ（ すなわち 、1つのインフルエンザからのシグナル（ 例えば、 http://imagej.net/Category:Pluginsおよび16,17）を使用して、2つのチャンネルの蛍光プローブ（orescence probe） 注：個々のチャンネルの蛍光強度はソフトウェアによって変更されません。 </li><li>後続の画像解析を確実にするために、特定のタンパク質チャンネルに対応するムービーを、グレースケールで、ワークフォルダ内の「.tiff」スタックファイル形式で保存します。 注：スタックの寸法（サイズ、長さ）は、すべてのチャネルで同じでなければなりません。 </li></ol> 4.画像解析 - ステップ1：画像を読み込む注記：ここに記載されているソフトウェアはMatlab（プログラミングソフトウェアと呼ばれます）で書かれており、このプログラムでのみ実行されます。 <ol><li>次のサイトから、画像解析に必要なファイルがすべて入っているzipフォルダをダウンロードしてください。https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softw/である。ファイルを解凍してワークフォルダにコピーします。 </li><li>インストールが完了したら、プログラミングソフトウェアを開き、 &#39;filopodiaAnalysisM3.fig&#39;を実行します。 GUIウィンドウ＃1が図2Aに示すように開く。 </li><li>プロテインAの場合は&lt;1b&gt;、プロテインBの場合は&lt;1c&gt;、プロテインCの場合は&lt;1d&gt;を使用して、保存したスタックされた &#39;.tiff&#39;ファイルをGUI Window＃1にロードします。 図2および表1を参照してください。 注記：GUIウィンドウ＃1に表示されているプロテインAは、最終的なレシオメトリック解析の参照チャネルとして機能します。 </li><li> &lt;1a&gt;をクリックして、タンパク質チャンネルから細胞のスーパーインポーズ画像を作成します。 </li><li> &lt;2a&gt;をクリックして最初のフレームを、&lt;2b&gt;を解析に使用した最後のフレームに割り当てます。 </li><li>必要に応じて、ボタン&lt;2h&gt;を使用して目的のフィリピンを含む関心領域（ROI）をクロッピングし、イメージを回転させます歌ボタン&lt;2i&gt;を押すか、フリーハンド描画ツール&lt;2j&gt;を使用して不要な領域を削除します。 注：イメージ解析を合理化するため、ImageJを使用して、ROI（クロップ、回転、削除）と他の前処理ステップ（バックグラウンド減算、漂白補正など）を分離することをお勧めします。 </li><li>各フレームのスライダ&lt;2c&gt;を品質管理のために動かし、フィリピンが映画全体を通して明確に見えるかどうかをチェックします。 </li></ol> 5.画像解析 - ステップ2：トレースを生成する<ol><li> GUIウィンドウ＃1のボタン&lt;3a&gt;をクリックしてGUIウィンドウ＃2を開きます （ 図2Bを参照）。 </li><li> GUIウィンドウ＃2のボタン&lt;4&gt;をクリックして、（&lt;1a&gt;をクリックした後にGUIウィンドウ＃1で生成された）重ね合わされたセル本体のマスクを生成します。また、マスクの境界線が生成され、頂点を得るために凸包が実装されます。 </li><li>クリckボタン&lt;5&gt;;カーソルが表示されます。カーソルを使用して、ベースを選択します（ここからフィリポダイアルの先端の距離が測定されます）。最初に現れたフレーム内のフィリポディアの先端が続きます。これを行うには、ウィンドウ＃2のスライダーを動かします）。 注記：データ出力のエラーを最小限に抑えるには、ベースポイントを軸に沿ってフィリピン先端の下に垂直に配置します。基点を他の場所に配置する（ 例えば横方向にシフトさせる）ことにより、細胞体内の蛍光値に指向性バイアスを導入することができる。 </li><li> &lt;6c&gt;を使用して閾値の長さを選択します（これを超えると、フィロポディアは曲がります）。 注：この長さは、（&lt;5&gt;を使用して選択された）基点と細胞体の境界（ すなわち 、糸状仮足が成長し始める領域）との間の距離として定義される。測定距離はピクセル単位です。 </li><li> &lt;6a&gt;のフィロポディアの形状を近似するために使用するセグメントの数を指定します。 注：m最も多くのセグメントの数は、フィロポジウムによって到達される最大長に依存するが、フィロポジウムがどのように曲がるかにも依存する。ベースとチップの間のピクセル数（ つまり 、スレッショルド長）よりも大きなセグメント数を選択しないでください。手順5.4で定義したしきい値の長さよりも多くのセグメントを選択する。 （ すなわち 、基部と先端との間のピクセル数）は、フィロポジウムの長さを過大評価する結果となる。 </li><li> &lt;6b&gt;にノードを配置する水平スキャナとして機能するスキャン幅を指定します。 注記：これらのノードは、基盤と先端をフィロソームの本体に結合する線（ すなわち 、バックボーンを作成する線）に適合させるためにプログラムによって使用されます。開始点として、最大長に係数を掛けた値に等しいピクセル値を入力します<img alt="式" src="/files/ftp_upload/55653/55653eq1.jpg" /> 。 </li><li>ボックス&lt;6d&gt;にスキャン半径（ピクセル単位）を指定します。 obより約50％大きい値を使用するインターフレーム先端変位を提供した。 注：非常に大きなスキャン半径を使用すると、実際の糸状裂先端が存在しないフレーム（ たとえば 、平面外の動きまたは低いSNR）で、不要な凸包点を取得する可能性があります。 </li><li>ボックス&lt;6e&gt;に曲げ角度を指定します。 注：角度閾値は、全解析中にフィリピンが曲がる最大角度によって決定されます。角の閾値を指定することにより、フィロポディアが細胞体に向かって曲がるときに、フィロポディアの側面から成長する望ましくない構造の追跡をソフトウェアが排除するのに役立つ。このプログラムは、垂直軸から45度未満の傾斜角を有する糸門のために確実に機能する。 </li><li>トラッキングを開始するには、GUIウィンドウ＃2の&lt;Track＆Analyze&gt;ボタンをクリックします。 GUIウインドウ＃2の「履歴トレース」ボックスをクリックして、将来の参照のために追跡プロトコル全体を保存します。 注記：追跡手順が完了した後、各フレームのフィロポジウムの長さが将来の参考のために &#39;dynamics.xlsx&#39;の &#39;length_vel&#39;という名前のシート。同様に、他のすべてのトラッキングパラメータは、 &#39;dynamics.xlsx&#39;の &#39;parameters&#39;という名前のシートに保存されます。 </li><li> 必要に応じて、フィロポディアがすべてのフレームで自動的に検出されない場合は、次の手順を実行して手動で修正します。 <ol><li>ウィンドウ＃2のスライダを使用してそれぞれのフレームにアクセスし、フィリピンの先端を手動で選択します。 注：凸包点が検出されないフレームは、GUIウィンドウ＃2のトラッキングウィンドウで青色の領域で表されます。そのフレームの節座標にアクセスするために追跡プログラムが開始される前に、「履歴トレース」ボタンをチェックすることが必須です。 </li><li> GUIウィンドウ＃2で&lt;6f&gt;を使用して基準点（ベースに続いて先端）を選択します。 「スキャン長さ」、「正確な測定後」、「最大曲げ角度」などの他のパラメータを指定します。;ステップ5.4-5.8で説明したようにそのフレームに対して</li><li>ボタン&lt;6i&gt;をクリックして、新しいパラメータ（その1つのフレームに固有）を保存します。このステップは、青色領域によって示されるすべてのフレームについて繰り返される。 </li><li>終了したら、&lt;7&gt;を使用してトラッキング手順を再初期化します。 注記：この修正は、映画の中で突然1つの留学生から別の留学生に切り替える場合にも使用できます。代わりに、複数の糸状仮足を含むムービーのクロッピングを検討してください。 </li></ol></li></ol>画像解析 - ステップ3：時空間タンパク質分析<ol><li>時空間解析のために、&lt;8b&gt;で表されるボックスを選択し、続いて目的のタンパク質チャネル（&lt;8c&gt;および/または&lt;8d&gt;および/または&lt;8e&gt;）を選択する。 注：プロテインAを参照として使用するので、レシオメトリック分析（&lt;9a&gt;、&lt;9b&gt;および/または&lt;9c&gt;）の前にプロテインAを選択することが必須です。 </li><li> &lt;8a&gt;をクリックします。ステップ5.9で生成されたトレースを使用して、糸道長に沿ってタンパク質の追跡を開始する。 </li></ol> 7.画像解析 - ステップ4：比率測定タンパク質分析<ol><li>チェックボックス&lt;9b&gt;または&lt;9c&gt;を選択し、ボタン&lt;9a&gt;をクリックして時空間レシオメトリックプロットを取得します。 注：相対タンパク質濃度の誤った表現を避けるために、レシオメトリック画像はX / Yとしてプロットされず、log（X / Y）としてプロットされます。将来の使用のために、レシオメトリックプロットは &#39;.png&#39;および &#39;.fig&#39;形式のファイルでエクスポートされ、生のプロットデータは &#39;dynamics.xlsx&#39;ファイル内に保存されます。 </li></ol> 8.画像解析 - ステップ5：口腔先端解析<ol><li>チェックボックス&lt;8f&gt;を選択し、&lt;8g&gt;と&lt;8h&gt;を使用してベースからチップの長さとしきい値の長さを指定します。 &lt;押しボタン&gt;をクリックして、データを「dynamics.xlsx」ファイルに保存します。 &lt;Protein Intensity&gt;をクリックすると、線維先端チップのタンパク質強度の痕跡を測定し、レシオメトリック分析のために保存する。 注：チップの長さは、分析に使用されるチップのピクセル数を決定します。ソフトウェアは、各フレームの先端のピクセルの平均強度値を返します。閾値長さは、基底部から先端までの最短距離を決定します（フィリポダイアル先端部が成長を開始する（そして、プログラムが先端部の強度値を追跡するとき）。したがって、チップの長さはしきい値の長さよりも小さくなければなりません。 </li><li> &lt;9d&gt;または&lt;9e&gt;を使用して分析する希望の比率をクリックします。 </li><li>比較ボタン&lt;9a&gt;をクリックしてレシオメトリックデータを生成します。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

ここでは、凸包アルゴリズムを用いて、これらの動的構造における糸球体成長ダイナミクスおよび相対タンパク質濃度の分析のための詳細なプロトコルを提示する。このソフトウェアを使用すると、1回の操作で最大3つのチャネルをペアワイズで比較することができます。これにより、2つのチャネル（タンパク質）の相対濃度が伸長/収縮サイクルを通じて決定され、画像ファイルとデータフ...

アクチン調節タンパク質の時空間制御は、フィロポジウムダイナミクス1,2に関連している。したがって、これらの動的構造の開始、伸長、安定化または崩壊の根底にある機構の理解を促進するためには、時間の経過とともに糸状体の長さに沿って空間的に分解されたタンパク質濃度を追跡することが重要である 3,4 。線維柱は、絶えず5つ折りになって屈曲する動的な微細構造であり、したがって、ラインスキャンのような単純なアプローチを用いた分析が不可能である細胞質ゾルにおけるタンパク質分析とは異なり、 人工肛門形状を追跡するためのさまざまなソフトウェアソリューションが利用可能です（6,7,8,9）。類似細胞体内のタンパク質動態をレシオメトリックに追跡するソフトウェアが開発されました10,11 。我々は、有形形状の自動追跡と時空間タンパク質解析を組み合わせるために、最近、凸包アルゴリズム12に基づく画像解析ソフトウェアを開発した。この新しい分析方法は、グラフィカルユーザーインターフェース（GUI） を介して操作され、初めて、繊維口径および成長速度に沿った相対的なタンパク質濃度を組み合わせることにより、これらの動きに関係なく時空間タンパク質分布の正確な測定を可能にする動的構造12 。 ソフトウェアの背後にある考え方（ソースコードは自由に利用可能です、以下を参照）は、凸包の頂点の1つがフィリピンの先端と一致することです（ 図1A ）。次のフレームfoを見ることによってrは凸包の最も近い頂点であり、ムービングチップは映画全体を通して追跡することができる。先端が各フレームで検出されると、フィリピンの基底の基準点（ 図1B ）と先端を結合することによって、その位置を軸の描画に使用します。最後に、軸に直交する線に沿った最大強度を有する中央値画素によって位置が決定される等距離節点を使用して、骨棘形状に従う骨格を決定する。この適応性のあるバックボーンを利用して、キモグラフを作成して、糸状体の長さに沿って最大3チャンネルの糸球体の成長およびタンパク質濃度を追跡する（ 図1C ）。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> 図1：イメージ解析ソフトウェアの動作原理 （ A ）後ろのアルゴリズムソフトウェア。ステップ1では、ユーザは、フィロポジウムの基準（ベース）および頂点（先端）を指定する。ステップ2-1では、最大輝度値を有する中央値ピクセルを用いてフィリピンのバックボーンが得られる。ステップ3では、バックボーンを空間タンパク質強度プロファイルに使用する。ステップ2-2では、ソフトウェアは次のフレームの先端を自動的に追跡する。全体の手順が繰り返されます。 （ B ）追跡に使用されている凸包のような重要な要素を導入している実在極を持つアルゴリズムのスナップショット。 （ C ）アルゴリズムで測定可能なパラメータの概要。この数字は参考文献12から変更されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 画像解析ソフトウェアは、グラフィカルな使用によってMatlab（プログラミングソフトウェアと呼ばれる）で操作されますrインターフェース。特定の実験設定の柔軟性と堅牢性を最大限にするために、ユーザーは一連のトラッキングパラメータ（許容される曲げ角度やフレーム間移動など）を調整したり、ムービーの一部の修正（クロッピング、回転、 （ 図2Aおよび表1） 。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GUI </td><td> いいえ。 </td><td> 必須 </td><td colspan="5"> 説明 </td><td> 名前（GUI内） </td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 1a </td><td> Y </td><td colspan="5"> （ボックスをチェックインして）セル本体を表す積み上げられた.tiffファイルをロードするか、チャンネルからスーパーインポーズされたセル本体を作成する</td><td> CellBody </td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 1b </td><td> Y </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt;タンパク質1に対応する積み上げ画像ファイルを読み込む</td><td>タンパク質1 </td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 1c </td><td> Y </td><td colspan="5">タンパク質2に対応する積み重ね画像ファイルを読み込む</td><td>プロテイン2 </td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 1d </td><td> Y </td><td colspan="5">タンパク質3に対応する積み重ねられた画像ファイルを読み込む</td><td>プロテイン3 </td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 1e </td><td> N </td><td colspan="5">プリロードされた積み重ねられた画像ファイルにすべてをリセットします。 </td><td>リセット</td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 2a </td><td> Y </td><td colspan="5">スクロールバーを使用して、GUIウィンドウ＃2での分析の初期フレームを決定します。 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 2b </td><td> Y </td><td colspan="5">スクロールバーを使用して、GUIウィンドウ＃2で解析するための最終フレームを決定します</td><td> NA </td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 2c </td><td> Y </td><td colspan="5"> curreを表すスクロールバーNTフレーム</td><td> NA </td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 2d </td><td> N </td><td colspan="5">すべてのピクセルがゼロに設定されるピクセルのグレー値</td><td> NA </td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 2e </td><td> N </td><td colspan="5">すべてのピクセルが最大値に設定されるピクセルのグレー値</td><td> NA </td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 2f </td><td> N </td><td colspan="5"> &lt;2e&gt;＆&lt;2f&gt;で指定されたピクセルの輝度値を設定します。 </td><td>セット</td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 2g </td><td> N </td><td colspan="5">強度調整されたムービーを再生する</td><td>遊びます</td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 2時間</td><td> N </td><td colspan="5">クロップ画像</td><td>作物</td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 2i </td><td> N </td><td colspan="5">イメージを回転する</td><td>回転する</td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 2j </td><td> N </td><td colspan="5">スタック全体の領域を削除する</td><td>リージョンを削除する</td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 3a </td><td> Y </td><td colspan="5">クリックすると「解析ウィンドウ」（GUIウィンドウ＃2）が開きます。 </td><td>追跡ウィンドウ</td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 3b </td><td> Y </td><td colspan="5">ピクセルのサイズをミクロン単位で入力します</td><td>ピクセルサイズを入力してください</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 4 </td><td> Y </td><td colspan="5">クリックすると、重ね合わされたセル本体の境界/エッジ画像が生成されます</td><td>境界</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 5 </td><td> Y </td><td colspan="5">クリックして、糸状虫の基部と先端を選択します</td><td> Referernce </td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 6a </td><td> Y </td><td colspan="5">セグメントまたはノードの数を入力してください</td><td>セグメント数</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 6b </td><td> Y </td><td colspan="5">スキャンの長さを入力します（軸に垂直） </td><td>スキャン幅</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 6c </td><td> Y </td><td colspan="5">フィロポディアが曲がり始める長さを入力してください</td><td>後の正確な測定</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 6d </td><td> Y </td><td colspan="5">先端検出円の半径（すなわち、次のフレームで頂点が局在化できる領域）を入力します。 </td><td>先端検出の半径</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 6e </td><td> Y </td><td colspan="5">フィリピンが垂直軸から曲げることができる最大角度を入力します</td><td>角度の閾値</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 6f </td><td> N </td><td colspan="5">その特定のフレームのベースとチップの参照点を追加する</td><td>リファレンスを選択</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 6g </td><td> N </td><td colspan="5">特定のフレームの曲がり始める長さを入力します</td><td>後の正確な測定</td></tr><tr><td> ＃2 </td> &lt;td&gt; 6h </td><td> N </td><td colspan="5">特定のフレームの検出円の半径を入力します</td><td>先端検出の半径</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 6i </td><td> N </td><td colspan="5">特定のフレームのすべてのパラメータを入力した後、その値をメモリおよびファイルに保存して参照する</td><td>追加</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 6j </td><td> N </td><td colspan="5">クリックすると、そのフレームの手動パラメータが削除されます。 </td><td>削除</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 6k </td><td> N </td><td colspan="5">クリックすると、すべてのフレームで &#39;オプション機能パネル&#39;を使用して手動で保存されたすべてのパラメータが削除されます</td><td>リセット</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 6l </td><td> N </td><td colspan="5">追跡する前にチェックインして、すべての追跡結果を将来の参照のためにメモリに格納する</td><td>履歴トレース</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 7 </td><td> Y </td><td colspan="5">トラッキングを開始するにはクリックしてください</td><td>トラックと分析</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 8a </td><td> N </td><td colspan="5">クリックしてタンパク質チャネル強度の追跡を開始する</td><td>タンパク質の強度を分析する</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 8b </td><td> N </td><td colspan="5">チェックインして、糸状体の長さに沿ったタンパク質チャネルの強度を追跡する</td><td>完全な糸状仮足</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 8c </td><td> N </td><td colspan="5">リファレンスタンパク質またはプロテインAを追跡するためにチェックイン</td><td>プロテインA </td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 8d </td><td> N </td><td colspan="5">タンパク質Bを追跡するためにチェックイン</td><td> ProteinB </td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 8e </td><td> N </td><td colspan="5">タンパク質Cを追跡するためにチェックイン</td><td> ProteinC </td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 8f </td><td> N </td><td colspan="5">タンパク質の平均強度を追跡するためにチェックインする電子チップ</td><td>リーディングチップ</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 8g </td><td> N </td><td colspan="5">先端の長さを入力してください</td><td>先端の長さ</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 8時間</td><td> N </td><td colspan="5">チップが形成を開始するベースからの最小距離を入力します</td><td>閾値</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 8i </td><td> N </td><td colspan="5">先頭のチップ解析結果をファイルに保存する場合にクリックします</td><td>ボタンを押す</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 9a </td><td> N </td><td colspan="5">レシオメトリックなタンパク質分析を開始するにはクリックしてください</td><td>比較</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 9b </td><td> N </td><td colspan="5">タンパク質BをAと比較するためにチェックインする</td><td> log10（B / A） </td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 9c </td><td> N </td><td colspan="5">チェックインして、プロテインCとAを比較する</td><td> log10（C / A） </td></tr><tr><td> ＃2 </td> &lt;td&gt; 9d </td><td> N </td><td colspan="5">先端のAに関してプロテインBを比較するためにチェックインする</td><td> log10（B / A） </td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 9e </td><td> N </td><td colspan="5">先端のAに関してプロテインCを比較するためにチェックインする</td><td> log10（C / A） </td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 10a </td><td> N </td><td colspan="5">他のカラーマップを選択してください（デフォルト：Jetplot） </td><td>カラーマップ</td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 10b </td><td> N </td><td colspan="5">カラーマップを編集する</td><td>カラーマップを編集</td></tr></tbody></table> 表1：GUIに存在するすべての機能の概要Windows＃1および＃2。 これが完了すると、プログラムは凸包を作成し、ムービー全体で自動的にヒントを追跡します。レシオメトリックなキモグラフ、成長速度、およびフィリピンの長さなど、映画から抽出されたパラメータa表示され、画像として、またデータファイルとして作業フォルダに保存されます。その後、生存期間、成長速度および収縮速度などの他のパラメータを抽出し、格納されたデータファイルからさらに分析することができる（ 図2B ）。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> 図2：イメージ解析ソフトウェアを使用するためのグラフィカルユーザーインターフェイス （ A ）GUIウィンドウ＃1は画像の読み込みと処理に使用されます。プログラムは最大3つのタンパク質チャネルをロードすることができ、それによって2つのチャネルが対に比較される。 （ B ）GUIウィンドウ＃2は、フィロポジウムと時空間および比率メトリックタンパク質分析を追跡するために使用されます。ここでも、オプション機能は緑色でマークされています。この数字は変更されています参考文献12から編集されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> ここでは、サンプルの準備とソフトウェア処理のための詳細なプロトコールを示します。細胞の培養と画像分析に最適化されたムービーの取得に関する詳細な手順から始めます。このデータ取得セクションに続いて、画像分析ソフトウェアを操作するための詳細な説明が続きます。プロトコル全体を通して、データの収集と処理の際に考慮する必要がある重要なステップとオプション機能を紹介します。最後に、我々は画像解析ソフトウエアを用いて様々なモデルシステムからの糸状仮説を解析し、記述された画像解析ソフトウェアと、有棘線量定量化のための他のプログラムとの比較および制限および将来の方向性に関する議論を終了する。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>10% Fetal bovine serum</td><td>Biochrom AG</td><td>L11-044</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>1% penicillin/streptomycin</td><td>Biochrom AG</td><td>12212</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M stock solution)</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Citrine-N1</td><td>Addgene</td><td>54593</td><td></td></tr><tr><td>Labtech</td><td>Thermo</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Thermo</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hela</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>COS 7</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-60</td><td></td></tr><tr><td>3T3 cells</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-59</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nicon Eclipse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor</td><td>DU888 Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Unit</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr></tbody></table>

a graphical user interface for software-assisted tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions

フィロポディアは、移動および細胞 - 細胞通信に関連する動的で指様の細胞突起である。糸球体の開始、伸長、その後の安定化または収縮の基礎となる複雑なシグナル伝達機構をよりよく理解するためには、これらの動的構造における時空間タンパク質活性を決定することが重要である。フィロポディアのタンパク質機能を解析するために、我々は最近、フィロポードの形状変化に適応する半自動追跡アルゴリズムを開発した。ここでは、最適化された細胞操作、画像取得およびソフトウェア分析のための詳細な段階的プロトコールを提示する。また、画像解析やデータ表示の際にオプション機能を使用するための手順や、重要なステップすべてに関するトラブルシューティングのガイドラインを提供します。最後に、dの比較フィロポディア定量化のために利用可能な他のプログラムと共に、エスケープされた画像分析ソフトウェア。一緒に、提示されたプロトコルは、画像分析ソフトウェアを用いて糸状突起におけるタンパク質動態の正確な分析のためのフレームワークを提供する。

線維性アクチン（f-トラクチン18 、赤色）および細胞質ゾル基準（緑色）のマーカーでトランスフェクトしたCOS細胞を用いて、アクチンに富む糸状突起を見出した（ 図3A 、上部パネル）。時系列は、糸状仮足が急速に伸び縮みすることを示した（ 図3A 、中央パネル）。画像解析ソフトウェアを使用して、...

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A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

我々は、動的細胞突起の長さに沿った相対的なタンパク質濃度の半自動追跡のためのソフトウェアソリューションを提示する。

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

a-graphical-user-interface-for-software-assisted-tracking-protein

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K ビュー.  University of Muenster. 我々は、動的細胞突起の長さに沿った相対的なタンパク質濃度の半自動追跡のためのソフトウェアソリューションを提示する。 

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A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

生化学

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

生物工学

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

免疫・感染学

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living cells in real time. In this protocol, we cover the fundamental steps to realize an iSCAT microscope and complement it with additional imaging channels to monitor the viability of a cell under study. Following this, we use the method for real-time detection of single proteins as they are secreted from a living cell which we demonstrate with an immortalized B-cell line (Laz388). Necessary steps concerning the preparation of microscope and sample as well as the analysis of the recorded data are discussed. The video protocol demonstrates that iSCAT microscopy offers a straightforward method to study secretion at the single-molecule level.

We present a protocol for the real-time optical detection of single unlabeled proteins as they are secreted from living cells. This is based on interferometric scattering (iSCAT) microscopy, which can be applied to a variety of different biological systems and configurations.

無料のラベル画像の単一蛋白質細胞から分泌される生活 iSCAT 顕微鏡を介して

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

工学

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

生物学

Probing Structural and Dynamic Properties of Trafficking Subcellular Nanostructures by Spatiotemporal Fluctuation Spectroscopy

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) is used to address the structural and dynamic properties of subcellular nanostructures, such as vesicles involved in the endo/exocytotic trafficking of solutes and biomolecules. iMSD relies on standard time-lapse imaging, is compatible with any optical setup, and does not need to dwell on single objects to extract trajectories. From each iMSD trace, a unique triplet of average structural and dynamic parameters (i.e., size, local diffusivity, anomalous coefficient) is calculated and combined to build the "iMSD signature" of the nanostructure under study. 
The potency of this approach is proved here with the exemplary case of macropinosomes. These vesicles evolve in time, changing their average size, number, and dynamic properties passing from early to late stages of intracellular trafficking. As a control, insulin secretory granules (ISGs) are used as a reference for subcellular structures that live in a stationary state in which the average structural and dynamic properties of the whole population of objects are invariant in time. The iMSD analysis highlights these peculiar features quantitatively and paves the way to similar applications at the sub-cellular level, both in the physiological and pathological states.

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) analysis is applied to macropinosomes to highlight their intrinsic time-evolving nature in terms of structural and dynamic properties. Macropinosomes are then compared to insulin secretory granules (ISGs) as a reference for subcellular structures with time-invariant average structural/dynamic properties.

時空間変動分光法による細胞内ナノ構造のトラッキングの構造と動特性のプロービング

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) is used to address the structural and dynamic properties of subcellular nanostructures, such as vesicles ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the construction and regeneration of tissues, and is critical in embryonic development, immunological responses, and wound healing. Dysregulation of cell motility contributes to pathological disorders, such as chronic inflammation and cancer metastasis. Cell migration, tissue invasion, axon, and dendrite outgrowth all initiate with actin polymerization-mediated cell-edge protrusions. Here, we describe a simple, efficient, time-saving method for the imaging and quantitative analysis of cell-edge protrusion dynamics during spreading. This method measures discrete features of cell-edge membrane dynamics, such as protrusions, retractions, and ruffles, and can be used to assess how manipulations of key actin regulators impact cell-edge protrusions in diverse contexts.

This protocol aims to measure the dynamic parameters (protrusions, retractions, ruffles) of protrusions at the edge of spreading cells.

生細胞顕微鏡による拡散時の細胞端突出ダイナミクスの測定

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

要約

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細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

無料のラベル画像の単一蛋白質細胞から分泌される生活 iSCAT 顕微鏡を介して

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスターサイズ

マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

時空間変動分光法による細胞内ナノ構造のトラッキングの構造と動特性のプロービング

生細胞顕微鏡による拡散時の細胞端突出ダイナミクスの測定

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

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細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

無料のラベル画像の単一蛋白質細胞から分泌される生活 iSCAT 顕微鏡を介して

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

時空間変動分光法による細胞内ナノ構造のトラッキングの構造と動特性のプロービング

生細胞顕微鏡による拡散時の細胞端突出ダイナミクスの測定

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスターサイズ