Diese Studien wurden von CIHR und CBCRA gewährt DWL finanziert. IP wurde durch Stipendien aus CIHR-STP, FRSQ und CIHR finanziert. MKGS wurde von OGS und CIHR-STP Stipendien finanziert. Die Autoren danken Kevin Barr für seine Unterstützung bei der Maus Zucht.

1. Brustdrüse Dissektion <ol><li> Euthanize der Maus unter Verwendung von CO 2-Inhalation. Vermeiden Sie Genickbruch, wenn möglich, da es große Blutgefäße im Hals und führen zu einer Akkumulation von Blut durch Brustdrüsen beschädigt werden kann, wodurch die Dissektion erschweren. Wenn jedoch andere Kriterien in die gleiche Maus, wie die Blutspiegel von Oxytocin ausgewertet werden sollen, können alternative Methoden Euthanasie notwendig sein, obwohl dies von Ihrem IACUC ausgewertet werden müssen. </li><li> Auf einer Polystyrol-Hartschaum in Folie verpackt, die Maus auf den Rücken und breitete die vier Gliedmaßen. Pin fest aller vier Gliedmaßen mit 16 bis 20 Gauge-Nadeln (Abbildung 1A). </li><li> Sprühen Sie die Maus großzügig mit 70% Ethanol. </li><li> Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Bauchhaut an der Mittellinie und machen einen kleinen Schnitt mit einer scharfen Schere. </li><li> Ausgehend von der Schnittführung, schneiden Sie die Haut bis zum Hals des Tieres unter Vermeidung Punktion der Bauch-oder Brusthöhle (Abbildung 1B). </li><li> Schneiden Sie die Haut an den Vorderbeinen auf die Mittellinienschnitt, was zu einem &quot;Y-Form&quot; (Abbildung 1B). Schneiden Sie die Haut an den hinteren Gliedmaßen die gleiche Weise (Abbildung 1B). </li><li> Mit hämostatischen Zange vorsichtig schälen die Bauch-und Brust-Haut auf die Seite der Maus. Wenn nötig, vorsichtig schneiden Bindegewebe. </li><li> Fix die Haut um die Polystyrol-Hartschaum mit 16 bis 20 Gauge-Nadeln, Freilegung der Milchdrüsen an der Unterseite der Haut. Fahren und vollständige einseitig zu einer Zeit (Abbildung 1C). </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig aus der Brustdrüse von Interesse und zwischen der Drüse und die Haut mit kleinen, scharfen Schere, beginnend von außen auf die Wirbelsäule des Tieres. Stellen Sie sicher, schneiden sorgfältig, so dass kein Stück Haut oder Muskeln bleiben auf der Drüse. Alle Brustdrüsen (Abbildung 1) kann mit Hilfe dieses Protokolls werden, aber Bauchschmerzen Brustdrüsen (# 4) sind am besten für die ganze Montage. Die 2. und 3. Drüsen haben einige verzahnte Muskeln und während sie für den ganzen Berg und Histologie verwendet werden können, könnten sie nicht angemessen für alle Analysen. </li></ol> 2. Whole mount <ol><li> Mindestens einen Tag vor der Präparation vorzubereiten carmine Alaun-Lösung durch Auflösen von 1 g Karmin und 2,5 g Aluminiumkaliumsulfat in 500 ml destilliertem Wasser und kochen für 20 Minuten in einem 1-Liter-Erlenmeyerkolben. Passen Sie das endgültige Volumen auf 500 ml mit Wasser. Filter durch ein Whatman-Papier und eine kleine Menge von Thymol (einige Körner) als Konservierungsmittel. Kühlschrank. Nach der Färbung kann carmine Alaun-Lösung zurück zum Lager Flasche gegossen und wiederverwendet werden oft über mehrere Wochen. Machen Sie eine frische Lösung, wenn Farbe blass. </li><li> Nach Auslösen der Brustdrüse der Maus (Schritt 1), breitete sie direkt auf einen Objektträger. Versuchen Sie es so viel wie möglich glätten, unter Beibehaltung der ursprünglichen Form in situ. Die Drüse wird auf der Folie schön bleiben, wenn sie richtig gespannt. </li><li> Fix die Drüse durch Eintauchen, auf der Folie, in Carnoy Fixativ (100% EtOH, Chloroform, Eisessig; 6:3:1) für 4 Stunden im Abzug bei Raumtemperatur in einem Glas. Beachten Sie, dass andere haben 2 Stunden, die ausreichen zu sein scheint. Alternativ können Drüsen auch bei 4 ° C über Nacht behoben werden. </li><li> Wash in 70% Ethanol für 15 min. Dann, allmählich rehydrieren in Wasser, indem die Hälfte der Ethanol-Lösung aus dem Glas und ersetzt sie durch ddH 2 O. Inkubieren für 5 min. Wiederholen Sie die 3-fache. Alternativ können Sie 70% - 35% - 15% - Ethanol und Wasser Bäder für jeweils 5 Minuten. </li><li> Spülen in destilliertem Wasser für 5 Minuten. </li><li> Färben in Carmin Alaun über Nacht bei Raumtemperatur. Anzumerken ist, dass Färbung könnte länger dauern, abhängig von der Dicke der Drüse sein. </li><li> Nehmen Sie carmine Alaun Flecken die Wiederverwendung und allmählich austrocknen gefärbten Gewebeschnitten durch serielle Ethanol Bäder (50%, 70%, 95%, 100%) für jeweils 5 min und klar in Xylol oder in eine ungiftige Alternative wie Histo-clear, Übernachtung. Beide Entwässerung und Clearing kann auch eine längere Inkubationen mit dickeren Proben. </li><li> Tauchen Brustdrüse in Methylsalicylat. Brustdrüsen kann in Methylsalicylat in einem Abzug aufbewahrt werden, bis Bilder bereit zu fassen sind. </li><li> Bilder können in einem Abzug mit einer normalen Digitalkamera auf einem Stativ (verwenden Sie &quot;Makro&quot;-Funktion, wenn verfügbar), indem Sie die Dias auf einem Leuchttisch positioniert genommen werden. Verwenden Sie ein Binokular für höhere Vergrößerung. Alternativ können Milchdrüsen in Medien wie Permount montiert werden (nach Schritt 2,7) ermöglicht für Bilder außerhalb einer chemischen Abzugshaube auf jedem Imaging-Plattform bietet den Halterungen genommen werden sind ausreichend dünn. </li><li> Um Brustdrüse Entwicklung mit whole mount, Messungen wie die Anzahl der Verzweigungen (oder Seite-Filialen) sowie Teile der Kanäle, die Länge des primären Kanälen, oder ein Verhältnis von Epithelzellen an Fettgewebe Bereich beurteilt werden zu quantifizieren. Endlich, nach fotografischen Dokumentationzung, Brustdrüse gesamte Halterung kann in Paraffin zum Schneiden und konventionellen histologischen Färbung eingebettet werden. </li></ol> 3. Oxytocin-induzierte Milchspendereflex <ol><li> Trennen Sie die Welpen von der Mutter nur, wenn sie gefüttert wurden. Warten Sie 1 Stunde vor dem Test. </li><li> Sacrifice der Mutter und setzen die Brustdrüsen, wie zuvor beschrieben (Schritte von 1,1 bis 1,8), ohne sie aus dem Tier. </li><li> Starten Sie den Test durch gleichmäßiges Ablegen entweder PBS oder der Oxytocin-Lösung direkt auf die Brustdrüse von Interesse, mit einem Transferpipette. Ein großes Spektrum von Dosen verwendet werden können; ~ 8 pg / ml (physiologische Dosis) wird in der Regel eingesetzt. Allerdings können hohe nicht-physiologischen Dosen (bis zu 1 mg / ml) verwendet werden, um das Fehlen der Reaktion in genetisch veränderter Mausmodelle zu gewährleisten. Für dieses Verfahren ist es empfehlenswert, Thorax (# 2-3) Drüsen zu benutzen, mit der einen Seite als Kontrolle (ausgesetzt PBS) und die andere Seite zu Milchspendereflex (Oxytocin Belichtung) zu testen. </li><li> Inkubation für 1 Minute und entfernen Sie die Lösung durch vorsichtiges Absaugen mit einer Transferpipette. Milk Einstieg in die Kanäle kann durch Videoband oder durch Aufnahme von Bildern vor und nach der PBS oder Oxytocin Exposition überwacht werden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: In einem guten ganze Berg ist der Brustdrüse schön ausbreiten und das Epithel Kanäle sind leicht zu beobachten (Abbildung 2A). Wenn die Drüse ist nicht gut verteilt, kann es heben zum Teil oder ganz von der Folie, wenn in der Fixierlösung gelegt. Die Drüse wird dann hart und unbrauchbar (Abbildung 2B). Ebenso wird, wenn die Drüse nicht gut präpariert, entweder einen Teil des Epithels können fehlen (Abbildung 2C) bzw. der übrigen Teile der Haut oder der Bauchmuskel mit der Analyse der Drüse (Abbildung 2D) stören. Für die Oxytocin-Assay, ist es wichtig, den Säugling Welpen aus der Talsperre für die gleiche Menge an Zeit bei jeder Gelegenheit zu trennen. Auf diese Weise werden Sie sicherstellen, dass keine Milch oder kleine Mengen von Milch in den Kanälen vor der Oxytocin-Exposition ist, sondern auch, dass genügend Milch vorhanden ist in den Alveolen, die in den Kanälen von myoepithelialen Kontraktionen (Abbildung 3A) ausgeworfen werden kann . Wenn Welpen zu früh entfernt werden, kann Milch in den Alveolen und in den Kanälen machen die Wirkung von Oxytocin schwer zu überwachen (Abbildung 3B) zu akkumulieren. Alternativ, wenn das Experiment ist zu früh, nach pup Entfernung durchgeführt wird Milch keine Zeit, um in die Alveolen und Oxytocin-induzierte Kontraktionen der Myoepithelzellen ansammeln wird nicht ausgelöst genug Milch Freisetzung in die Kanäle zu beobachten (Abbildung 3C) werden. <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Maus Brustdrüse Dissektion. Pin mit der Maus auf dem Rücken durch die vier Gliedmaßen (A). Schneiden Sie die Haut zunächst aus dem Bauch bis zum Hals. Dann machen Sie senkrecht Einschnitte von der Mitte des Bauches, um jedes Glied, wie durch die gestrichelte Linie (B) dargestellt. Vorsichtig schälen die Haut auf der Seite des Tieres und stecken Sie es, Freilegung der Brustdrüse (C). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Maus Brustdrüse ganze Berg. Epithel Kanälen (Pfeile) und der Lymphknoten (Pfeilspitze) sind leicht in einem schön verteilt Brustdrüse ganzen Berg Drüse # 4 beobachtet (A). Ein schlecht verteilt Brustdrüse kann von der Folie ablösen und zusammengebrochen, wodurch es unbrauchbar (B). Ein falsch ausgeschnitten Brustdrüse kann entweder fehlende Teile (C) oder Stücke von Muskel oder Haut verbleibenden (D). Beachten Sie, dass die 2 nd und 3 rd Drüsen Muskel verzahnt, kann aber immer noch für ganze Berg oder Histologie verwendet werden. <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Oxytocin-induzierte Milchspendereflex kann in Epithel Kanälen beobachtet werden (Pfeile) nach Oxytocin-Exposition (A). Allerdings, wenn Kanäle sind bereits mit Milch (Pfeile) am Anfang des Tests wegen einer unangemessen langen Latenzzeit nach der letzten Säugen der Welpen, weitere Akkumulation von Milch in den Kanälen (Pfeile) nach Oxytocin Exposition gefüllt ist schwer zu zu beobachten (B). Alternativ wird eine kurze Latenzzeit nach Welpen säugt nicht genug Ansammlung von Milch ermöglichen in die Alveolen richtig in die Gänge (Pfeile) werden nach Oxytocin-Exposition (C) beobachtet. Die Bilder wurden vor und nach Oxytocin-Exposition mit Hilfe eines numerischen Kamera (Cybershot, Sony) aufgenommen. <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Schematische Darstellungen von ganzen Montage und Oxytocin Behandlung Assays.

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Brustdrüse Entwicklung und Funktion sind eng orchestriert. Mutant Mäuse können Hafen-Gen-Mutationen, die Brustdrüse Entwicklung und Funktion Hervorhebung der Notwendigkeit, Drüse Architektur 13,12 bewerten beeinträchtigen können. Whole Montage kann wie in diesem Artikel auf allen Stufen der Brustdrüse Entwicklung beschrieben werden. Typischerweise wird die Entwicklung des Epithels zu Beginn der Pubertät (~ 4 Wochen alt) beurteilt, in der Mitte der Pubertät (~ 6 Wochen alt) und nach der Pubertät (~ ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Karminrot </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C1022 </td></tr><tr><td> Aluminiumkaliumsulfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6435 </td></tr><tr><td> Thymol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0501 </td></tr><tr><td> Methylsalicylat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M6752 </td></tr><tr><td> Oxytocin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3251 </td></tr></tbody></table>

evaluation of mammary gland development and function in mouse models

Der menschliche Brustdrüse von 15-20 Lappen zusammengesetzt, die Sekretion von Milch in eine Verzweigung Kanalsystem Öffnung an der Brustwarze. Die Lappen selbst sind eine Reihe von Terminal Kanal lobulären Einheiten der sekretorischen Alveolen und konvergierenden Kanäle 1 zusammengesetzt. Bei Mäusen ist eine ähnliche Architektur an der Schwangerschaft in die Gänge und Alveolen in das bindegewebige Stroma eingestreut werden eingehalten. Die Maus Brustdrüse Epithel ist ein Baum wie Gangsystem aus zwei Schichten von Zellen, eine innere Schicht aus luminalen Zellen, die durch eine äußere Schicht aus Myoepithelzellen durch die Grenzen eines Basalmembran 2 bezeichnet umgeben ist. Bei der Geburt ist nur eine rudimentäre duktale Baum vorhanden ist, besteht aus einem primären Kanal und 15-20 Filialen. Niederlassung Dehnung und Verstärkung beginnen am Anfang der Pubertät, ca. 4 Wochen alt, unter dem Einfluss von Hormonen 3,4,5. Bei 10 Wochen, wird der Großteil des Stroma durch ein komplexes System von Kanälen, die Zyklen der Verzweigung und Regression in jeder Läufigkeit bis Schwangerschaft 2 wird zu unterziehen eingedrungen. Zu Beginn der Schwangerschaft, beginnt eine zweite Phase der Entwicklung, mit der Proliferation und Differenzierung des Epithels auf Trauben-förmige Milch sekretorischen Strukturen, so genannte Alveolen 6,7 bilden. Nach der Geburt und während der Stillzeit wird die Milch durch luminale sekretorische Zellen produziert und gelagert im Lumen der Alveolen. Oxytocin, ein neuronales Reflex Säugen der Welpen induzierte stimulierte, induziert synchronisiert Kontraktionen der Myoepithelzellen um die Alveolen und entlang der Kanäle, so dass Milch durch die Milchgänge zur Brustwarze, wo es verfügbar wird, um die Welpen 8 transportiert werden. Brustdrüse Entwicklung, Differenzierung und Funktion sind eng orchestriert und erfordern nicht nur Interaktionen zwischen Stroma und Epithel, sondern auch zwischen myoepithelialen und luminalen Zellen innerhalb des Epithels 9,10,11. Dabei können Mutationen in vielen Genen in diesen Interaktionen verwickelt beeinträchtigen entweder duktalen Dehnung während der Pubertät oder Alveolen Bildung in der frühen Schwangerschaft, Differenzierung während der späten Schwangerschaft und sekretorischen Aktivierung führt zu Laktation 12,13. In diesem Artikel beschreiben wir, wie man mit der Maus Milchdrüsen sezieren und beurteilen ihre Entwicklung mit ganzen mounts. Wir zeigen auch, wie man myoepithelialen Kontraktionen und Milchspendereflex mit einem ex-vivo Oxytocin-basierten funktionellen Assays zu bewerten. Der Effekt einer Genmutation auf Brustdrüse Entwicklung und Funktion kann also in situ, indem diese beiden Techniken in der Mutante und Wildtyp-Mäusen der Kontrollgruppe festgestellt werden.

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Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

Diese Methode beschreibt, wie zu sezieren und zu bewerten Brustdrüse Entwicklung und Funktion von Mäusen. Abgeschnittene Milchdrüsen sind für den Grad der Entwicklung mit whole mount beurteilt, während Milchspendereflex wird ausgewertet, wobei Oxytocin-basierte myoepithelialen Zelle Kontraktion Assay.

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

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Research

JoVE Journal

Biology

36.9K Aufrufe.  University of Western Ontario. Diese Methode beschreibt, wie zu sezieren und zu bewerten Brustdrüse Entwicklung und Funktion von Mäusen. Abgeschnittene Milchdrüsen sind für den Grad der Entwicklung mit whole mount beurteilt, während Milchspendereflex wird ausgewertet, wobei Oxytocin-basierte myoepithelialen Zelle Kontraktion Assay.

Serie: Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Biolumineszenz Imaging von Brusttumoren mit IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Forschung

Biologie

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Maus Brustepithelzellen Form Mammospheres Während lactogenic Differenzierung

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Änderungen der Brustdrüsen Morphologie und Breast Cancer Risk in Ratten

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Intraduktale Injection für Lokalisierte Drug Delivery auf die Maus Milchdrüse

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...