Dieses Protokoll kann in den meisten Labors für Entwicklungsbiologie der Speiseröhre implementiert werden, so dass Forscher, die keinen Zugang zu hochauflösenden Mikroskopen haben, hochauflösende Bilder erstellen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es den Forschern ermöglicht, die Beugungsgrenze der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie zu umgehen, ohne dass ein hochauflösendes Mikroskop erforderlich ist, indem sie die Probe selbst erweitern. Dieses Protokoll wird für diejenigen von Vorteil sein, die untersuchen, wie sich die Lokalisierung von Proteinen auf die Zellmorphologie oder -funktion in intakten Embryonen auswirkt, insbesondere wenn diese Proteine in komplexen subzellulären Strukturen oder Netzwerken organisiert sind.
Das häufigste Problem, auf das Menschen stoßen, ist der Verlust von Embryonen während des gesamten Protokolls. Es ist ratsam, mehrere Schichten Poly-L-Lysin aufzutragen, um die Embryonen fest zu kleben. Nach den Embryonen nehmen Sie eine sechs Zentimeter lange Petrischale aus Kunststoff, die zur Hälfte mit 3%igem Agar gefüllt ist.
Ein fünf mal drei Zentimeter großes Rechteck mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell in den Agar ritzen. Entfernen Sie die Agarplatte mit einem kleinen Laborspatel. Drehen Sie dann den Boden der Petrischale um, stellen Sie sie auf die Bank und legen Sie die Agarplatte auf die umgedrehte Schale.
Nehmen Sie den Deckel von der Petrischale ab und stellen Sie sicher, dass sie trocken ist. Kleben Sie mit Handschuhen ein Stück doppelseitiges Klebeband auf die Innenseite des Deckels. Nehmen Sie die Fläschchen mit den beschichteten und fixierten Embryonen aus dem Schüttler und stellen Sie sie senkrecht auf die Werkbank.
Lassen Sie die organische und die wässrige Phase trennen. Richtig fixierte Embryonen sollten an ihrer Schnittstelle verbleiben. Entfernen Sie die untere wässrige Phase mit einer Pasteurpipette und einer P200-Pipette vollständig.
Verwenden Sie eine Pasteurpipette aus Glas, die mit einem Latexkolben ausgestattet ist, um die fixierten Embryonen in mehreren kleinen Chargen auf eine Agarplatte zu übertragen, damit sie nicht an der Innenseite der Pipette haften. Sobald sich die Embryonen auf der Agarplatte befinden, verwenden Sie eine P200-Pipette, um das verbleibende Heptan in der Nähe der Embryonen zu entfernen. Lassen Sie nun den doppelseitigen Klebebanddeckel aus einer Höhe von zwei Zentimetern auf die Agarplatte fallen, um die Embryonen auf das Klebeband zu kleben.
Nehmen Sie vorsichtig den Deckel von der Agarplatte ab, legen Sie ihn kopfüber auf die Bank und fügen Sie genügend PBS Tween hinzu, um die Embryonen im Deckel zu bedecken. Um die gewünschten Embryonen zu entnehmen, verwenden Sie ein Stereo-Präpariermikroskop mit 100-facher Vergrößerung und indirekter Beleuchtung. Stechen Sie mit einer feinen Glasnadel in die Vitellinmembran in der Nähe des vorderen oder hinteren Endes des Embryos, um sie zu entleeren und den Druck abzulassen.
Verwenden Sie eine feine Pinzette oder eine Metallsonde, um den Embryo vorsichtig durch das Loch zu drücken, während die Vitelline-Membran noch auf dem doppelseitigen Klebeband klebt. Lassen Sie unerwünschte Embryonen auf dem Band. Verwenden Sie regelmäßig eine Pasteurpipette aus Glas, um schwimmende devitellinisierte Embryonen aufzufangen und in ein 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen zu bringen.
Bereiten Sie die PDMS-Lösung in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen vor und erstellen Sie ein ausgeglichenes Röhrchen, indem Sie eine geeignete Menge Wasser in ein zweites konisches 50-Milliliter-Röhrchen geben. Zentrifugieren Sie die PDMS-Lösung bei 500 G drei Minuten lang bei 15 Grad Celsius. Anschließend gießen Sie es in eine 10 Zentimeter lange Petrischale bis zu einer Tiefe von einem Millimeter.
Lassen Sie die PDMS-Lösung über Nacht bei 55 Grad Celsius erstarren. Sobald die PDMS-Platte erstarrt ist, ritzen Sie quadratische Bereiche, die etwas kleiner als ein 22 x 22 Millimeter großes Deckglas sind, mit einem Skalpell ein. In jedem Quadrat eine acht Millimeter breite quadratische Mulde einritzen und entfernen.
Übertragen Sie jede quadratische PDMS-Mulde auf ein 22 x 22 Millimeter großes Deckglas und kleben Sie es fest. Um die Embryonen auf die Deckgläser zu kleben, tragen Sie genügend 0,1%Poly-L-Lysin auf, um die Deckglasoberfläche in jeder Vertiefung zu bedecken, und legen Sie sie zum Trocknen in einen 55 Grad Celsius heißen Inkubator. Spülen Sie die Embryonen und PBS kurz ab, um das Tween-Reinigungsmittel zu entfernen.
Übertragen Sie dann mehr als 10 Embryonen in jede mit Poly-L-Lysin beschichtete Vertiefung. Lassen Sie die Embryonen sich auf dem Boden der Vertiefungen niederlassen. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einer Pasteurpipette aus den verklebten Embryonen und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
Während die Embryonen in der Monomerlösung sitzen, bereiten Sie eine Gelierungslösung vor, um die PDMS-Vertiefungen zu bedecken. Verdünnen Sie das katalytische Oxidationsmittel frisch aus dem Pulver. Kombinieren Sie 3.920 Mikroliter Monomerlösung mit 60 Mikrolitern 10 % TEMED und 20 Mikrolitern 1 % TEMPO.
Teilen Sie die Gelierlösung in 125-Mikroliter-Aliquoten in mehrere PCR-Röhrchen auf. Entfernen Sie die Monomerlösung mit einem Vakuum oder einer Pipette aus den PDMS-Vertiefungen, wobei Sie darauf achten müssen, die Embryonen nicht zu stören. Geben Sie fünf Mikroliter APS in eines der PCR-Röhrchen mit der Gelierlösung, um die Polymerisation einzuleiten.
Verteilen Sie die polymerisierende Gelierungslösung schnell auf die drei Vertiefungen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Vertiefungen und Embryonen bedeckt sind. Lassen Sie die Proben 1,5 bis 2,5 Stunden bei 37 Grad Celsius gelieren.
Dickere Hydrogele brauchen länger, um die Polymerisation abzuschließen und sich zu verfestigen. Rühren Sie die Hydrogele häufig um, um die Polymerisation zu überwachen. Einmal erstarrt, wackeln Hydrogele nicht mehr.
Ziehen Sie nach der Gelierung die PDMS-Vertiefungen aus dem Deckglas ab, ohne die Hydrogele zu stören. Übertragen Sie die Hydrogele einzeln in die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte. Die Hydrogele können sich während der Verdauung leicht ausdehnen.
Bedecken Sie die Gele vollständig mit Verdauungspuffer. 30 Milliliter Aufschlusspuffer reichen aus, um sie in eine Sechs-Well-Platte zu hüllen und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius zu inkubieren. Nach dem Aufschluss werden die Hydrogele in eine sechs Zentimeter lange Petrischale gegeben und mit deionisiertem Wasser gefüllt, um sich auszudehnen.
Die Hydrogele können sich an dieser Stelle von den Deckgläsern lösen und sich in linearer Dimension um vier Faltungen ausdehnen. Entfernen Sie mit einer Pasteurpipette so viel überschüssiges Wasser wie möglich aus der Petrischale, um die Bewegung der Gele bei der Handhabung zu minimieren. Manövrieren Sie die expandierten Gele mit den Embryonen auf der Unterseite auf ein großes Deckglas für die Bildgebung.
Montieren Sie jedes Deckglas mit Gel über das Objektiv eines inversen konfokalen Laserscanning-Mikroskops. Nach der Lokalisierung der richtig inszenierten und ausgerichteten Proben wurde auf ein Öl- oder Wasserimmersionsobjektiv mit hoher Vergrößerung umgestellt, um Bilder mit hoher Auflösung zu erhalten. Die Messung der Embryonenlänge entlang der Kopf-Schwanz-Achse unter einem 10-fachen Objektiv zeigte, dass nicht expandierte Embryonen etwa die Hälfte eines Gesichtsfeldes umfassten, während die expandierten Embryonen etwa zwei volle Gesichtsfelder umfassten.
Die durchschnittliche Kopf-zu-Schwanz-Länge der unexpandierten Kontrollembryonen betrug 398,8 Mikrometer. Für die Experimente eins, zwei und drei betrugen die durchschnittlichen Embryolängen Expansionsfaktoren um das 4,0-fache, 4,7-fache bzw. 4,9-fache. In der Kontrollprobe wiesen die Zellen im Oberkiefersegment eine durchschnittliche Breite von 4,76 Mikrometern auf.
In den expandierten Proben wiesen die Zellen im Oberkiefersegment eine durchschnittliche Breite von 19,10 Mikrometern auf, was einer 4,0-fachen Ausdehnung entspricht. Das Actomyosin-Zytoskelett wurde in unexpandierter Kontrolle im Vergleich zu expandierten Embryonen mit konvergenter Extension abgebildet. Sie erschienen als eine einzige Linie, in der benachbarte Zellen aufeinandertrafen.
Im Gegensatz dazu konnten bei Embryonen im erweiterten Stadium sieben parallele Linien von Myosin zwei an Zellübergängen beobachtet werden, die kortikale Proteinpools in benachbarten Zellen darstellen. In den nicht expandierten Embryonen des sechsten Stadiums erschienen die mit Streptavidin markierten Mitochondrien als heterogener zytoplasmatischer Schleier ohne klare subzelluläre Details. In den expandierten Embryonen waren jedoch zahlreiche Punkte im Zytoplasma auflösbar, die wahrscheinlich fragmentierte Mitochondrien oder Teile des mitochondrialen Netzwerks darstellten.
Eine wichtige Sache, die Sie bei diesem Verfahren beachten sollten, ist, die Embryonen nach der Inkubation der sekundären Antikörper vor übermäßiger Lichtexposition zu schützen.
