Die finanzielle Unterstützung für diese Studie wurde durch das National Key Research and Development Program (2016YFC1200601) und die National Natural Science Foundation von China (31390421) zur Verfügung gestellt.

1. Whitefly Aufzucht und kryptische Arten Identifizierung <ol><li> Halten Sie die Whitefly- Spezies auf Baumwolle Gossypium Hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) in Käfigen unter Standardbedingungen von 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% Feuchtigkeit und 14 h Licht: 10 h dunkles Regime. </li><li> Sammeln Sie einen einzelnen erwachsenen Weißfarbstoff und homogenisieren Sie in 30 μl Lysepuffer (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt / vol] Tween-20, 0,2% [wt / vol] Gelatine, 0,45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 g / ml Proteinase K). </li><li> Inkubieren des Homogenats bei 65 ° C für 1 h und dann 100 ° C für 10 min. HINWEIS: Die Inkubationszeit bei 65 ° C kann bei Bedarf erhöht werden. Die Inkubationszeit bei 100 ° C sollte kritisch kontrolliert werden, um Proteinase K ausreichend zu inaktivieren und DNA-Schäden zu vermeiden. </li><li> Führen Sie die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Whitefly-DNA (gewonnen in Abschnitt 1.3) auf der Basis von mitochondrialen Cytochromoxidase I-Primern durch. COI-F: 5&#39;-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 &#39; COI-R: 5&#39;-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 &#39; <ol><li> Führen Sie die PCR-Reaktionen in einem Endvolumen von 25 μl mit 1 U Taq- DNA-Polymerase, 2,5 μl 10x Puffer, 0,2 mM dNTP, 0,2 mM jedes Primers und 2 μl Whitefly-DNA durch. </li><li> Verwenden Sie die folgenden PCR-Verfahrensbedingungen: anfängliche Denaturierung 95 ° C für 3 min, gefolgt von 35 Zyklen von 95 ° C für 45 s (Denaturierung), 50 ° C für 45 s (Glühen) und 72 ° C für 1 min (Verlängerung) und Weitere 10 min bei 72 ° C für weitere verlängerung </li></ol></li><li> Reinigen Sie das PCR-amplifizierte Produkt mit einem DNA-Gel-Extraktionskit mit dem empfohlenen Protokoll. </li><li> Sequenzieren Sie die gereinigten DNA-Proben mit einem DNA-Proben-Sequenzierungssystem nach der Anweisungen des Herstellers. </li><li> Analysieren Sie die Sequenzen mit dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), um die kryptischen Arten von Whitefly zu identifizieren und eine Kontamination anderer Spezies zu vermeidenEs </li></ol> 2. Endosymbiont Identifizierung und Lokalisierung <ol><li> Führen Sie die PCR auf der Whitefly-DNA aus (in Schritt 1.3 erworben), um die spezifischen Gene jedes Endosymbionts innerhalb des Whitefly zu amplifizieren (das PCR-Rezept ist in Abschnitt 1.4 beschrieben und PCR-Verfahren und Primer sind in Tabelle 1 aufgelistet). </li><li> Bezeichnen Sie die amplifizierte Probe einer Agarose-Gelelektrophorese gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll 20 (1% Agarosegel, Tris-Acetat-EDTA als Laufpuffer, Spannung 5 V / cm), um das spezifische Gen jedes Bakteriums zu identifizieren. </li><li> Wiederholen und Sequenz jedes Bandes, um die Bakterienarten innerhalb von whitefly zu bestimmen (siehe Abschnitte 1.5-1.7). </li><li> Führen Sie Fluoreszenz in situ Hybridisierungen (FISH) auf Whiteflies durch, um den Ort der Endosymbionten gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll zu identifizieren. HINWEIS: Erhöhung der Konzentration der fluoreszierenden Sonden bei Bedarf. </li></oL&gt; 3. Transmission Electron Microscopy (TEM) <ol><li> In Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0), enthaltend 2,5% [vol / vol] Glutaraldehyd, für 4 h einwischen und fixieren. </li><li> Waschen Sie die Proben in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) dreimal, jeweils 15 min. </li><li> Tauchen Sie ein und fixieren Sie die Proben erneut in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0), enthaltend 1% [wt / vol] OsO 4 für 2 h. </li><li> Dehydrieren Sie die Proben mit einer abgestuften Reihe von Ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% und 100%), jeweils 15 min. </li><li> Übertragen und die Proben 20 Minuten in 100% Aceton eintauchen. </li><li> Legen Sie die Proben in Mischung aus 100% Aceton und 100% Spurr Harz (1: 1) für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Sie die Proben 3 Minuten lang bei Raumtemperatur auf Mischung aus 100% Aceton und 100% Spurrharz (1: 3). </li><li> Übertragen und tauchen die Proben in 100% Spurr-Harz (inkubiert bei 70 ° C) für mehr als 9 h. </li><li> Sektion der Whitefly-Proben mit einem Mikromir. </li><li> Färben Sie die ultradünnen Filme (gewonnen in Abschnitt 3.9) durch Eintauchen in absolutes Uranylacetat für 5-10 min, gefolgt von Eintauchen in 50% iges alkalisches Bleibitrat für weitere 5-10 min. HINWEIS: Die in Abschnitt 3.1-3.10 genutzten Reagenzienmengen reichen von den Proben ab. Stellen Sie sicher, dass die Proben in die Reagenzien eingetaucht sind. </li><li> Beobachten Sie Proben unter Transmissionselektronenmikroskopie (15.000X), um die Lokalisierung, Form und Größe der Bakterien zur weiteren Verwendung zu bestimmen (siehe Abschnitt 4.6). </li></ol> 4. Whitefly Bakteriome Dissektion und Reinigung <ol><li> 100 μl 1x PBS-Lösung auf einen Objektträger geben. Wählen Sie aus den Baumwollblättern die 3. oder 4. Instanz-Nymphen und tauchen sie in die PBS-Lösung ein. </li><li> Verwenden Sie feine entomologische Nadeln unter einem Stereomikroskop und ziehen Sie die Bakterien aus dem Whitefly-Körper. <ol><li> Schon mal ein Loch auf die eine Seite der Nymphe schneiden und das andere leicht drückenSeite, um die Bakterien auszulassen. </li></ol></li><li> Montieren Sie einen 20 μL Mikroloader (mit dem führenden Endschnitt, um die Größe des Bakterioms zu erfüllen) auf einer 0,5-10 μl Pipette. Extrahieren Sie das einzelne Bakteriom aus der PBS-Lösung in den Mikroloader. </li><li> Waschen Sie das Bakteriom, um die Kontamination von anderen Whitefly-Geweben zu eliminieren, indem Sie das Bakteriom in die PBS-Lösung pipettieren und das Bakteriom extrahieren. Wiederholen Sie dreimal. </li><li> Das gewaschene Bakteriom sofort in ein Zentrifugenröhrchen pipettieren, das 60 μl 1x PBS-Lösung enthält. </li><li> Spritzen Sie das zusammengesetzte Bakteriom durch eine 5 μm Filtermembran (bestimmt durch Größen von Bakterien und Kern von Bakteriocyten in Whitefly). Wiederholen Sie mehrmals, um die gemischte Flüssigkeit durch die Filtermembran gründlich zu bewegen. HINWEIS: Um ein besseres Ergebnis der Amplifikation und Sequenzierung zu erreichen, montieren Sie über 100 Bakterien. Netzen Sie die Filtermembran zuerst durch die Verwendung von 1x PBS-Lösung, um den Verlust von Bakterien zu verringernBindung an die Membran. </li></ol> 5. Verstärkung von Endosymbiont-Genomen <ol><li> Verstärken Sie das Filtrat (hauptsächlich enthaltende Endosymbionten der Whitefly) mit einem DNA-Amplifikations-Kit durch das empfohlene Protokoll mit einigen Modifikationen. <ol><li> Wählen Sie das empfohlene Protokoll der Amplifikation von genomischer DNA aus Blut oder Zellen und bereiten Puffer D2 für nachfolgendes Experiment vor. </li><li> Direkt zu 1,5 μl Filtrat (siehe Abschnitt 4.6) zum Zentrifugenröhrchen geben, gefolgt von 1,5 μl des Puffers D2 und gut vermischen. </li><li> Inkubieren auf Eis für 10 min und füge 1,5 μl der Stopplösung hinzu. </li><li> Fügen Sie 15 μl des Reaktionspuffers und 1 μl der DNA-Polymerase hinzu und mischen Sie vorsichtig. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung bei 30 ° C für 16 h, gefolgt von 3 min bei 65 ° C. </li></ol></li><li> Führen Sie PCR direkt auf dem amplifizierten Filtrat aus (verdünnen Sie die amplifizierten Proben, falls erforderlich), indem Sie spezifische Primer verwenden, die für bac entworfen sindUm die Bakterienarten zu bestätigen (siehe Abschnitt 2.1). </li><li> Durchführen von PCR, um zu bestätigen, ob eine Kontamination des Wirtsgenoms durch die Verwendung von Whitefly-Gen- Beta- Actin- und EF1- Primern gemäß der zuvor veröffentlichten Methode 21 vorliegt (das PCR-Rezept ist in Abschnitt 1.4 beschrieben). </li></ol> 6. Endosymbiont Metagenome Sequenzierung <ol><li> Das amplifizierte Filtrat einem Spektrophotometer und einem Fluorometer (gemäß den Anweisungen des Herstellers) vor der Sequenzierung zur Prüfung der Probenqualität und ob die Proben die Kriterien für die Sequenzierung erfüllen. </li><li> Betreff der Verstärker zu einem Genom-Sequenzer gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga...

Bakterien, die eine intime symbiotische Beziehung mit relativen Wirten bilden, sind bei Arthropoden weit verbreitet 1 . Es wurde gezeigt, dass die Endosymbionten in fast allen Entwicklungsstadien die Aspekte von Wirten, wie den Stoffwechsel, die Reproduktion, die Reaktionen auf die Umweltbelastungen 2 , 3 , 4 usw. beeinflussen. Der Mechanismus, der die Verbände untermauert, bleibt jedoch weitgehend unbekannt. Genomik ist von Priorität und Bedeutung beim Studium der möglichen Funktionen und Rollen von Bakterien. Über die Genomsequenzen, die den potentiellen Rollen der Symbionten in der Symbiose beleuchten, können einige fundamentale Informationen, dh der taxonomische Status, funktionale Gene, Stoffwechselwege, Sekretionssysteme, abgeleitet werden. Mit der Entwicklung der Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde eine große Anzahl von bakteriellen Genomen sequenziertMit diversen Funktionen zeigte sich 6 . Endosymbionten sind von entscheidender Bedeutung bei Hämipteren, wie Blattläuse 7 , Wanzen 8 , Psyllids 9 , braune Pflanzenpflege 10 und Zikaden 11 . So wurde zum Beispiel Buchnera in Blattläuse als obligates symbiont gezeigt, dass es in die essentielle Aminosäurebiosynthese involviert ist, zusammen mit den Genen aus Blattlausgenom 12 . Darüber hinaus zeigt sich auch die Transkriptionsregulation von Buchnera 13 . In Psylliden wird Carsonella sequenziert und rangiert das kleinste bakterielle Genom, das jemals gefunden wurde 14 . Alle diese Kennzeichen von Endosymbionten basieren und werden aus den Genomsequenzen abgeleitet. Da diese Endosymbionten nicht in vitro kultiviert werden können, wurden mehrere Ansätze angewendet, um adäquate Bakterien für seq. Zu isolierenUning Bei Blattläusen werden Endosymbionten durch Zentrifugation und Filtration extrahiert und einer weiteren genomischen und transkriptomischen Analyse unterzogen. In braunen Pflanzern werden Endosymbionten zusammen mit dem ganzen Insektengenom 10 sequenziert. Whitefly B. tabaci ist ein Spezieskomplex mit mehr als 35 morphologisch nicht unterscheidbaren Spezies (kryptische Spezies), unter denen zwei invasive Arten auf der ganzen Welt eingedrungen sind und der landwirtschaftlichen Produktion enorme Schäden verursacht haben 15 . Bemerkenswert, Endosymbionten innerhalb der B. tabaci- Arten haben bei der Entwicklung der Schädlinge Bedeutung geweckt 16 . Bisher wurden acht Endosymbionten in der Whitefly identifiziert, darunter der obligatorische Symbiont, Candidatus Portiera aleyrodidarum und sieben sekundäre Symbionten Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , &lt;Em&gt; Wolbachia, Fritschea und Hemipteriphilus definiert 17 , 18 . Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Hemipterern ist die Whitefly B. Tabaci ein äußerst winziges Insekt, das nur 1 mm lang ist. Die meisten Endosymbionten beschränken sich auf Bakteriozyten 19 (spezialisierte Zellen, die Symbionten enthalten, die Bakterien in B. tabaci weiter bilden). Darüber hinaus können diese Endosymbionten nicht in vitro kultiviert werden. Der einzige Weg, um Endosymbionten von B. tabaci zu erhalten, besteht darin, das Bakteriom zu sezieren. Allerdings gibt es Schwierigkeiten in der Sektion. Zuerst verbindet sich das zerbrechliche Bakteriom immer mit anderen Geweben der Whitefly, die schwer zu trennen ist. Zweitens begrenzt die winzige Größe der Whitefly die Isolierung von genügend Bakterien. Drittens gruppieren sich Endosymbionten im Bakteriom, was es äußerst kompliziert macht, eine einzige Bakterienart zu erwerben. <p clAss = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier berichten wir über ein einfaches und kostengünstiges Protokoll, um Whitefly Endosymbionten für die anschließende Metagenomsequenzierung zu isolieren. Durch Dissektion, Reinigung und Amplifikation konnte adäquate Endosymbiont-DNA erhalten und die Bakterienarten bestätigt werden. Das beschriebene Protokoll kann in anderen Arthropoden ähnlich verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="775">
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:107px;">Takara</td>
			<td style="width:129px;">R001A</td>
			<td style="width:296px;">including rTaq, 10&#215;Buffer and dNTP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Gel DNA extraction kit</td>
			<td style="width:107px;">Qiagen</td>
			<td style="width:129px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">DNA sample sequencing system</td>
			<td style="width:107px;">ABI</td>
			<td style="width:129px;">ABI-3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Microtome</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:129px;">EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:107px;">Hitachi</td>
			<td style="width:129px;">H-7650 TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:129px;">Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">20 &#956;L microloader</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">F2771951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Filter holder</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:129px;">SX0001300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Filter membrane filter</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:129px;">SMWP001300</td>
			<td>5.0 &#956;m SMWP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">REPLI-g UltraFast Mini Kit</td>
			<td style="width:107px;">Qiagen</td>
			<td style="width:129px;">150033</td>
			<td>DNA amlification kit</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">NanoDrop</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">NanoDrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Genome Sequencer</td>
			<td style="width:107px;">Illumina</td>
			<td style="width:129px;">Hiseq 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the extraction of endosymbionts from the whitefly bemisia tabaci

Bakterielle Symbionten bilden eine intime Beziehung zu ihren Gastgebern und verleihen den Gastgebern in den meisten Fällen Vorteile. Genomische Informationen sind entscheidend, um die Funktionen und die Entwicklung von bakteriellen Symbionten in ihrem Wirt zu studieren. Da die meisten Symbionten nicht in vitro kultiviert werden können, sind Methoden zur Isolierung einer adäquaten Menge an Bakterien für die Genomsequenzierung sehr wichtig. In der Whitefly Bemisia tabaci wurde eine Anzahl von Endosymbionten identifiziert und vorausgesetzt, dass sie bei der Entwicklung und Reproduktion der Schädlinge durch mehrere Ansätze von Bedeutung sind. Der Mechanismus, der die Verbände untermauert, bleibt jedoch weitgehend unbekannt. Das Hindernis kommt teilweise aus der Tatsache, dass die Endosymbionten in whitefly, meist in Bakteriocyten zurückgehalten, schwer von den Wirtszellen zu trennen sind. Hier berichten wir ein schrittweises Protokoll zur Identifizierung, Extraktion und Reinigung von Endosymbionten aus dem Whitefly B. Tabaci vorwiegend durch DissectiAuf und filtration. Endosymbiont-Proben, die nach dieser Methode hergestellt wurden, obwohl immer noch eine Mischung aus verschiedenen Endosymbiont-Spezies, eignen sich für die anschließende Genomsequenzierung und die Analyse der möglichen Rollen von Endosymbionten in B. tabaci . Diese Methode kann auch verwendet werden, um Endosymbionten von anderen Insekten zu isolieren.

Im Nahen Osten Kleinasien 1 (MEAM1) Spezies des B. tabaci- Komplexes wurde als Beispiel für die Beschreibung genommen. Baumwolle für die Aufzucht von Weißfliegen und mehrere Entwicklungsstadien von Weißfliegen sind in Abbildung 1 gezeigt, darunter eine Baumwollpflanze, eine erwachsene Whitefly und die 1., 2. und 4. Instar-Nymphe von Whitefly (die 3. Instar-Nymphe sieht ähnlich wie die 4. Instar-Nymphe aus ). Es ...

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Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von Endosymbionten aus der Whitefly Bemisia tabaci durch Dissektion und Filtration. Nach der Amplifikation eignen sich die DNA-Proben für die anschließende Sequenzierung und Untersuchung des Mutualismus zwischen Endosymbionten und Whitefly.

Methoden zur Extraktion von Endosymbionten aus der Whitefly<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

methods-for-extraction-endosymbionts-from-whitefly-bemisia

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

9.8K Aufrufe.  Zhejiang University.  Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von Endosymbionten aus der Whitefly Bemisia tabaci durch Dissektion und Filtration. Nach der Amplifikation eignen sich die DNA-Proben für die anschließende Sequenzierung und Untersuchung des Mutualismus zwischen Endosymbionten und Whitefly. 

Serie: Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Forschung

Biologie

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-Dissektion Rattenhirns RNA oder Protein Extraction von bestimmten Hirnregion

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

RNA Extraktion aus Neuroprecursor Zellen unter Verwendung des Bio-Rad Total RNA Kit

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Methoden zur Untersuchung des Zebrafisch Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component which can be extracted with an appropriate signal filter. Two factors are important: the EMG must be recorded in monopolar fashion, and the recording must be done so the low frequency signal corresponding the EPP is not eliminated. This report explains how to extract the EPP component from the EMG of the masseter muscle in a human subject. The surface EMG is recorded from eight sites using traditional disc electrodes aligned along over the muscle, with equal inter-electrode distance from the zygomatic arch to the angle of mandible in response to quick gum clenching. A reference electrode is placed on the tip of the nose. The EPP component is extracted from the raw EMGs by applying a high-cut digital filter (2nd dimension Butterworth filter) with a range of 10-35 Hz. When the filter is set to 10 Hz, the extracted EPP wave deflects either negative or positive depending on the recording site. The difference in the polarity reflects the sink-source relation of the end plate current, with the site showing the most negative deflection corresponding to the neuromuscular junction. In the case of the masseter muscle, the neuromuscular junction is estimated to be located in the inferior portion close to the angle of mandible. The EPP component exhibits an interesting oscillation when the cut-off frequency of the high-cut digital filter is set to 30 Hz. The EPP oscillation indicates that muscle contraction is adjusted in an intermittent manner. Abnormal tremors accompanying various sorts of diseases may be substantially due to this EPP oscillation, which becomes slower and is difficult to cease.

The endplate potential (EPP) component can be extracted from the surface EMG using a digital filter. The extracted EPP shows oscillation with a frequency of about 30 Hz.

Extraction der EVP-Komponente aus dem Oberflächen-EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Die Infiltration-Zentrifugation Technik zur Gewinnung von apoplastischen Flüssigkeit aus Pflanzenblättern verwenden<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Als Beispiel

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

Verfahren zur Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung von Sinoatrialknoten Myozyten aus erwachsenen Mäusen

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...