Wir danken Drs. Arata Tabuchi und Wolfgang Kübler (University of Toronto) für den Unterricht über Intravitalmikroskopie. Wir danken Andrew Cahill (Nikon Instruments) für die Unterstützung in der Mikroskopie Design und Implementierung. Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI Zuschüsse P30 HL101295 und K08 HL105538 (auf EPS) finanziert.

Ein. Vorbereitung der Surgical Tubing, Gefäßkathetern, Brust Wand Fenster <ol><li> Intravitalmikroskopie Bühne. Wir maßgeschneiderte eine Plexiglas Bühne, auf der die narkotisierten Maus liegt in der Mikroskopie. Diese Phase nimmt sowohl ein 15 cm x 10 cm flexible Kunststoff-Schneidebrett (auf dem die Maus liegt bei der Induktion der Anästhesie, Tracheotomie Platzierung und Katheterisierung) sowie einer ähnlich großen Heizelement (unter der Schneidebrett). </li><li> Maus Thorakostomie Rohrvorbereitung (Abbildung 1). Ein 10 cm langes Stück PE 50-Schlauch (Intramedic, Innendurchmesser 0,58 mm, Außendurchmesser 0,965 mm) geschnitten. Ein Ende ist mit dem stumpfen Ende eines gekrümmten 23 Gauge-Nadel angebracht ist; diese Nadel wird verwendet, um das Rohr durch die Brustwand (innen → außen) übergeben vor dem Verschluss der thorakalen Fenster werden. Das distale Ende des Schlauches (1,5 cm in der Länge, entgegengesetzt zu der angehängten 23 GaugeNadel) wird immer wieder von einer 30-Gauge-Nadel punktiert, die Schaffung von &quot;seitlichen Anschlüssen&quot; wirksame Absaugung des intrathorakalen Luft zu erleichtern. Diese gefensterten Abschnitt wird dann von dem Rest des Rohrs durch mehrere umlaufende Schleifen von 4:0 Seidennaht getrennt; diese Schleifen wird als &quot;Stopper&quot; zu dienen, die Verankerung letztendlich 1,5 cm gefensterte Abschnitt innerhalb der Brusthöhle. </li><li> Jugularvenöse Kathetern. Zwei 15 cm Längen PE 10-Schlauch (Intramedic, Innendurchmesser 0,28 mm, Außendurchmesser 0,61 mm) geschnitten werden. Ein Skalpell wird zur Abschrägung der Enden des Rohres, wodurch die Leichtigkeit der Venenpunktion. Der Schlauch wird über eine 1 ml Spritze, die 6% 150 kDa Dextranlösung (in PBS), die an den nicht abgeschrägten Ende des Schlauchs gespült. </li><li> Chest wand Vorbereitung (Abbildung 2). Transparent Polyvinylidenfluorid-Membran (New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) wird in eine ovale Form (Hauptachse 6 cm, Nebenachse 4 cm) geschnitten. Ein kreisförmiger 5 mm # 1 Deckglas (Bellco) mit der Membran unter Verwendung α-Cyanacrylat-Klebstoff (Pattex flüssig, Fa. Henkel, Düsseldorf) befestigt ist. </li><li> . Rohr für Pneumothorax Induktion (&quot;Blasrohr&quot;) Ein 10 cm Länge Rohr (Innendurchmesser 3 mm, Außendurchmesser 5 mm) wird auf eine 5-ml-Spritze befestigt ist; das entgegengesetzte Ende wird verwendet, um Luft in das Tier einzuführen Brustkorb vor der Brust wand Transplantation. </li><li> Spritze für Wasser Eintauchen Ziel. A 23-Gauge-Nadel auf eine 30 ml Spritze mit destilliertem Wasser angebracht. Die Spitze der Nadel abgestumpft ist (unter Verwendung eines Metall-Datei), um Schäden an dem Ziel zu verhindern. </li></ol> 2. Maus Anesthesia <ol><li> Eine Maus ist anästhesiert mit einer Mischung aus Ketamin (10 mg / ml) und Xylazin (2 mg / ml) intraperitoneal in einer Dosis von 8 ul pro Gramm Körpergewicht Maus. Sedierung erfolgt innerhalb von 3 - 6 min und sollten kein Hindernis Spontanatmung. </li><li> Mit einem elektrischen Rasierer, Rasurder Hals-, Brust-, Bauch und rechten Seite der Maus. </li><li> Mit Klebeband sichern Sie die Maus auf einer dünnen Kunststoff-Schneidebrett. Der Kopf der Maus sollte in Richtung des Bedieners (Abbildung 3) zeigen. Gentle Spannung durch eine Schlaufe des Fadens Weitergabe unter den oberen Zähnen dient Kopf-Erweiterung zu erhalten. Das Schneidebrett ist auf einem Heizkissen gelegt, die Aufrechterhaltung der Maus euthermia während Tracheostomie und Venenkatheter Platzierung. </li><li> Wet rasiert Bereiche mit 100% Ethanol. </li><li> Bestätigen adäquate Anästhesie mit einem Schwanz / paw Prise. Gehen Sie, wenn minimale Reaktion, bieten eine zusätzliche Bolus von Ketamin / Xylazin, wenn nicht ausreichend betäubt. </li></ol> 3. Tracheostomie <ol><li> Ein 1 cm lange Inzision über der Kehle vorgenommen. Darunterliegende Bindegewebe wird seziert, und die Speicheldrüsen getrennt und reflektiert seitlich. Der M. sternohyoideus sofort anterior der Trachea reseziert. </li><li> Eine Schleife von 4:0 Naht wird unter th fortgeschrittene Trachea (Abbildung 4). Die Schleife wird dann geschnitten, wodurch zwei getrennte Stränge der Naht zugrunde liegenden Luftröhre. Die kaudale Nahtmaterial wird verwendet, um die Tracheostomiekanüle zu befestigen; der kraniale Nahtmaterial verwendet wird, um Spannung auf die Luftröhre während Tracheostomie Platzierung bereitzustellen. </li><li> Mit zwei Fingern wird der obere Faden ergriffen und schonende Spannung auf die Luftröhre aufgebracht. Ein horizontaler Einschnitt in die Luftröhre zwischen oberen und unteren Nähten hergestellt. Dieser Schnitt sollte überqueren etwa zwei Drittel der trachealen Umfang. Ein Flansch Trachealkanüle (Harvard Apparatus, 1,22 mm Außendurchmesser) in das distale Luftröhre eingeführt und an seinem Platz mit der Schwanzflosse trachealen Naht. </li><li> Die Tracheotomie wird auf ein Volumen-kontrollierte kleines Tier Ventilator (Inspira, Harvard Apparatus) verbunden ist, und die Maus ist mit 40% eingeatmeten Sauerstoffs und 9 ml / kg Tidalvolumen (Einstellungen optimiert, um eine adäquate Oxygenierung / Lüftung in unserem Labor erhalten) belüftet. Positive endexspiratorischen Druck (PEEP) wird an dieser Stelle nicht begonnen. Zu beachten ist, sollten die Einstellungen des Beatmungsgerätes besondere Bedingungen innerhalb der einzelnen Labors optimiert werden. Unterschiedliche Längen von redundanten Schlauch (der zwischen dem Schlauchsystem Y-Anschluss und Tracheotomie) kann zum Totraum einzustellen, eine stabile Alveolarventilation für jeden gewählten Atemzugvolumen. </li></ol> 4. Katheterisierung <ol><li> Die Verbindung der inneren und äußeren Jugularvene kann durch Verfolgen distalen Venenäste proximal identifiziert werden. Die externe Vena befindet sich unterhalb der reflektierten Speicheldrüsen gefunden, dies kann proximal verfolgt werden, um die externe-interne jugulare Kreuzung zu finden. </li><li> Verwenden Sie sanfte stumpf, um die Vena Übergang von umgebenden Bindegewebe trennen. </li><li> Mit 4.00 Nähten, binden Sie die externen Halsschlagader und interne Jugularvenen distalen (kraniale) an die Gurgel Kreuzung. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Carinader Vena Kreuzung, Blutungen sollte minimal sein. </li><li> Zwei Katheter können schrittweise durch den Schnitt und in die Vena trunk vorangetrieben werden. Nach leichtes Ansaugen von Blut Rückkehr zu gewährleisten, werden Katheter in der Vene mit 4.00 Nähte gesichert. </li><li> Band Kathetern auf das Schneidebrett gegen unbeabsichtigtes Herausfallen zu verhindern. </li></ol> 5. Intravital Maus Lung Microscopy Surgery (adaptiert aus Tabuchi et al. 18) <ol><li> Das Schneidbrett (enthaltend das zurückhaltend, narkotisierten Maus sowie abgeklebt Venenkathetern) mit dem Intravitalmikroskopie Stufe übergegangen, bei denen die verbleibenden chirurgische Eingriffe durchgeführt. Rektale Temperatursonde angeordnet ist; dieses Schnittstellen mit einem adaptiven Heizsystem (unter dem Schneidebrett), so dass Wartung der Maus euthermia. </li><li> Ein jugularvenöse Katheter mit einer Spritze, die eine Pumpe Ketamin (10 mg / ml)-Xylazin (2 mg / ml) liefert befestigtMischung bei 200 ul pro Stunde. Eine adäquate Anästhesie wird erneut bestätigt, mit tail / paw Prise. </li><li> Die Mittellinieneinschnitt vom Hals zum Xyphoid ausgefahren, dann Fortfahren seitlich an der rechten Seite (Fig. 5). </li><li> Mit Elektrokauter wird die Brustmuskulatur entfernt, so dass den Brustkorb. Es wird darauf geachtet, um eine vollständige Blutstillung gewährleisten. </li><li> Überqueren Sie die Maus rechten Hinterbein über die linke Seite und Klebeband ab. Die daraus resultierende Bauch Torsion dreht den Brustkorb leicht, durch Erleichterung der Operation. </li><li> Legen Sie die Stufe bei einem Winkel von 45 Grad (Abb. 6); diese Positionierung ermöglicht die Lunge fallen weg von der Brustwand, sobald der Pneumothorax induziert wird. </li><li> Die 1. Rippe (am unteren Rippe) wird mit einer Pinzette ergriffen und angehoben; eine gekrümmte Pinzette wird stumpf unterhalb der Rippe gedrückt. Diese trennt Pleura parietalis von der Brustwand. Die Pleura bleiben sollte unpunktierten. </li><li> Mit dem Blasrohr undeine Spritze, wird die Luft gewaltsam gegen die Pleura parietalis eingeführt. Dies führt zum Bruch der Pleuraoberfläche und Pneumothorax, ohne die zugrunde liegenden Lunge. Die zugrunde liegende Lunge fallen weg von der Brustwand, so dass Einführung eines Elektrokauter Pinzette ohne Beschädigung der Lunge. Eine Abnahme der Beatmungsgerät Atemvolumen wird typischerweise nicht während dieses Schrittes notwendig. </li><li> Mit Elektrokauter Pinzette, sezieren die Brustwand Muskulatur und schneiden Sie über den 5 th und 6 th Rippen / Pleura parietalis, so dass ein ~ 8 mm kreisförmigen Loch in der Brustwand. Wesentlich ist, daß eine vollständige Hämostase aufrechterhalten werden, da das Vorhandensein von Blutungen Mikroskopie (Abbildung 7) verdeckt wird. </li><li> Mit einer Nadel Fahrer, legen Sie die Thorakostomie Rohr in der Brustwand Loch. Die Nadel sollte Punktion der Brustwand und verlassen die Brusthöhle unterhalb und seitlich des Thorax (Abbildung 7). Achten Sie darauf, zu vermeiden Punktion der Membran. DieSchlauch wird dann vorsichtig aus der Brustwand gezogen, bis er auf Widerstand tritt aus der Naht &quot;Stopper&quot; an der Kante des gefensterten Abschnitt des Rohres befindet. </li><li> Zeigen die Bühne flach. </li><li> Hinzufügen 3 cm H 2 O PEEP an das Beatmungsgerät zu helfen unterstützen Lungenkrebs reexpansion. </li><li> Kleber (Pattex Gel, Henkel) in Umfangsrichtung um die Brust Fenster platziert. Die Membran gebunden ist, mit dem Deckglas zugewandten außerhalb der Brusthöhle. Vorsichtig (und umfangsmäßig) annähernd der Membran zu der Leim mit einem Baumwoll-Applikator. </li><li> Während der Durchführung einer Lunge Rekrutierungsmanöver (3 Tidalvolumen während der die PEEP Lüfter-Anschluss verstopft ist), wird -3 mm Hg Saugen an der Brust Rohr aufgebracht. Die Lunge sollte anhaltend ungefähre die Membran, während sich frei bewegenden während Gezeiten Lüftung (Abbildung 8). </li><li> Die rechte Vorderbein des Maus über die linke Seite durchquert, wodurch eine linke Seitenlage der Maus.Sponge Keile können verwendet werden, um richtig zu positionieren mit der Maus, so dass die Brust-Fenster mit der Mikroskopie Wasser Immersionsobjektiv ausgerichtet ist. </li><li> Destilliertes Wasser wird auf dem Deckplättchen vor Mikroskopie platziert, so dass für die Visualisierung der Lunge unter Verwendung eines Wasser Immersionsobjektiv. Wasser müssen zeitweise ganz Bildgebung ergänzt werden. </li></ol> 6. Die Messung der Lungenfunktion Endothelial Oberflächenschichtdicke <ol><li> Unmittelbar nach Brustwand Verschlusses werden 500 ul FITC-markiertem Dextran 150 kDa (6% ige Lösung in PBS) über die zweite (nicht-Narkose) jugularis Venenkatheter verabreicht. Dieser dient als Bolus Volumengabe sowie das Gefäßsystem Tracer für ESL-Messung. Das Dextran Bolus hat keinen Einfluss auf neutrophilen Haftung oder Lungenödem Bildung 2. </li><li> Das Wasser Immersionsobjektiv über das Deckglas zentriert. Die Wahl des Ziels ist wichtig zu kleinen Unterschieden in ESL Dicke eine hohe numeri visualisierencal Blende benötigt wird (&gt; 0,8) unter Beibehaltung einer 2 - 3 mm Arbeitsabstand (ermöglicht das Eindringen durch die Lunge Fenster und Pleuraoberfläche). Wir verwenden die Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) und CFI 75 LWD 25x (NA 1,1) Ziele für diesen Zweck. </li><li> Um genau messen ESL Dicke in einem sich bewegenden Organ, ist es wesentlich, dass Hell-und fluoreszierende vaskulären Breiten gleichzeitig durchgeführt werden. Dies kann unter Verwendung eines Bildes Splitter (Dual View, Photometrics), die für die gleichzeitige Erfassung des reflektierten Lichts Differential-Interferenz-Kontrast (DIC, Hellfeld) und FITC Bilder (Abbildung 9) ermöglicht werden. </li><li> Während eines 5 sec inspiratorische Pause ist eine kontinuierliche Bildgebung durchgeführt und aufgezeichnet. Später können diese Bilder überprüft werden, um in-Messfeld zu identifizieren. </li><li> Verwendung eines In-Fokus-Rahmen, subpleuralen Mikrogefäßen (&lt;20 Mikrometer Durchmesser) werden identifiziert; mindestens 3 Mikrogefäßen werden typischerweise auf einem einzigen Rahmen vorhanden. Nach Beendigung des Versuchs, DICund FITC-Dextran vaskulären Breiten gemessen werden (durch eine Blindbeobachter) durch Mitteln der Längen der drei senkrechten Abschnitte pro Mikrogefäßzellen. Annahme gleicher ESL Dicke an beiden Rändern des Schiffes kann die ESL Größe um die Hälfte der Differenz zwischen DIC und FITC-Dextran vaskulären Breiten, wie in der Repräsentative Ergebnisse Abschnitt definiert werden. </li><li> Typischerweise kann Intravitalmikroskopie für&gt; 90 min ohne jeden Beweis der Lungenschädigung oder Hypotonie 2 durchgeführt werden. Vorläufige Experimente durchgeführt werden, um mit der Maus Stabilität (Blutdruck, Sauerstoffsättigung, Lüftung, Lungenschädigung) während des Beobachtungszeitraums zu bestätigen. Experimentelle Medikamente können durch den zweiten (nicht-Narkose) Jugularkatheter an irgendeinem Punkt während des Verfahrens eingebracht werden. </li></ol> 7. Alternative Messung der Lungenfunktion Endothelial Surface Layer Integrität Die intakten Endothelzellen Oberflächenschicht Funktionen (teilweise) auszuschließen circulatten Elemente aus der endothelialen Oberfläche 2. ESL Integrität kann daher durch die Fähigkeit einer Umlaufelement (zB eine fluoreszierende Mikrokugel) für den Zugriff und die Interaktion mit Zelloberflächen-Adhäsionsmolekülen (wie ICAM-1) gemessen werden. <ol><li> Anti-ICAM-1 markierten fluoreszierenden Mikrosphären vor der Operation vorbereitet. Streptavidin-beschichtete 0,97 um fluoreszierenden Mikrosphären werden mit biotinyliertem Anti-ICAM-1 (Klon YN1/1.7.4, 1:50, eBioscience) Antikörper oder Isotyp-Kontrolle für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mikrokugeln werden dreimal gewaschen und in PBS suspendiert bei 1 x 10 9 pro ml Mikrokügelchen. </li><li> Während Intravitalmikroskopie wird die Mikrosphären Suspension (100 ul) in die Vena Katheter injiziert. Nach 15 min der Zirkulation, sind fluoreszierende Bilder über 5 min erfasst. Microspheres unbeweglich&gt; 5 min gelten als Anhänger und quantifiziert mit Bildverarbeitungs-Software. </li></ol> 8. Sterbehilfe &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Nach Abschluss des Verfahrens werden narkotisierten Mäusen durch Ausbluten über direkte Herzpunktion eingeschläfert. Sterbehilfe wird über bilaterale Pneumothoraces, nach denen Lungen geerntet und schockgefroren zur späteren Analyse bestätigt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Koinzident mit dem expandierenden Verwendung von in vivo-Mikroskopie, gibt es zunehmende Wertschätzung sowohl für die beträchtliche Größe der ESL sowie dessen zahlreichen Beiträge Gefäßfunktion. Diese neuen Daten werden jedoch vor allem aus Studien der systemische Gefäßsystem abgeleitet. In der Tat, der in vivo-Mikroskopie in der Lunge zu verwenden ist technisch anspruchsvoll, da signifikante pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte. Mehrere neuere technische For...

Die endotheliale Glykokalyx ist ein extrazelluläres Schicht aus Proteoglycanen und zugehörige Glycosaminoglycane Auskleiden der vaskulären Intima. In vivo die Glykocalix hochhydratisierten ist, Bilden einer Oberflächenschicht wesentlichen endothelialen (ESL), die eine Vielzahl von Funktionen einschließlich Endothelzellen Fluiddurchlässigkeit 1, Neutrophilen-Endothel reguliert Haftung 2 und die Mechanotransduktion von Fluid Scherbeanspruchung 3. Historisch gesehen hat die Glykokalyx war underappreciated aufgrund seiner aberrance in kultivierten Zellpräparationen 4, 5 und seine Abbauprodukte während der üblichen Gewebefixierung und Verarbeitung 6. Der zunehmende Einsatz 7 von Intravitalmikroskopie (in vivo Mikroskopie, IVM) hat mit erhöhter wissenschaftliche Interesse an der Bedeutung der ESL auf vaskuläre Funktion bei Gesundheit und Krankheit zusammenfiel. Die ESL ist unsichtbar für Lichtmikroskopie und kann nicht einfach in beschriftbarvivo, da die Neigung der fluoreszierenden Glykokalyx-bindenden Lektine RBC Agglutination 8 und tödlichen Lungenembolien (unveröffentlichte Beobachtungen) verursachen. Mehrere indirekte Ansätze wurden daher entwickelt, um ESL Dicke (und durch Erweiterung, Glykokalyx Integrität) in unbewegten Gefäßbetten wie die cremasterica und mesenterialen microcirculations abzuleiten. Diese Techniken umfassen die Messung der Differenzen der zirkulierenden Mikropartikel Geschwindigkeit als eine Funktion des Abstands von der endothelialen Membran (Mikropartikel Bild velocimetry 9) sowie die Messung der Ausschluss von sperrigen, fluoreszenzmarkierten vaskulären Markern (zB Dextrane) von der endothelialen Oberfläche (Dextran Exklusionstechnik 10, 11). Von diesen Techniken ist nur Dextran Ausschluss fähig Schätzen ESL Dicke aus Messungen an einem einzigen Zeitpunkt hergestellt. Durch die gleichzeitige Messung vaskulärer Breiten mit Hellfeldmikroskopie (a Breite inclusive der &quot;unsichtbaren&quot; ESL) und Fluoreszenz-Mikroskopie eines vaskulären Tracer vom ESL ausgeschlossen, kann ESL Dicke wie die Hälfte der Differenz zwischen vaskulären Breiten 2 berechnet werden. Die Verwendung von einem momentanen Maß für ESL Dicke für Studium des pulmonalen Glykocalix gut geeignet. Intravitalmikroskopie der Lunge ist eine Herausforderung, da signifikante pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte. Während jüngsten Fortschritte zur Immobilisierung Mauslungen ermöglichen in vivo 12, 13, bestehen Bedenken hinsichtlich der physiologischen Auswirkungen von Lungen Stasis. Lung Immobilität wird mit einer verminderten endothelialen Stickstoffmonoxid Signalisierung 14, ein Signalweg, der sowohl Neutrophilen Adhäsion 15 und Lungenschädigung 16 Auswirkungen verbunden. Weiterhin Immobilisierung eines Bereichs von Lungen freilegt umgebenden mobilen Alveolen zu schädigenden Scherkräften (sogenannte &quot;Atelektrauma&quot;), in Übereinstimmung mit den Konzepten der klassischen physiologischenalveolären Interdependenz 17. Im Jahre 2008 entwickelte Arata Tabuchi, Wolfgang Kübler und Kollegen eine chirurgische Technik die es erlaubt Intravitalmikroskopie einer frei beweglichen Mauslunge 18. Respiratorischen Artefakt aus diesem Verfahren kann durch die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Abbildungssystem, einschließlich gleichzeitige Messung von Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie negiert werden. In diesem Bericht ausführlich wir, wie momentane Dextran Ausschluss Bildgebung eingesetzt werden, um ESL Dicke im subpleural Mikrozirkulation einer frei beweglichen, in vivo Mauslunge messen. Diese Technik kann leicht modifiziert werden, um zu bestimmen Glykokalyx-Funktion Insbesondere die Fähigkeit eines intakten ESL auszuschließen zirkulierenden Elemente aus der endothelialen Oberfläche. Wir haben kürzlich diese Techniken verwendet werden, um die Bedeutung der pulmonalen ESL Integrität zur Entwicklung von akutem Lungenversagen während systemische entzündliche Erkrankungen wie Sepsis 2 zu bestimmen.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Name des Reagenz </td></tr><tr><td> FITC-Dextran (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> FD150S </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-Dextran (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> T1287 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-beschichtete fluoreszierenden Mikrosphären </td><td> Bangs Laboratories </td><td> CP01F/10428 </td><td> Dragon Green Fluoreszenz (ähnlich FITC) </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Moore Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Moore Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-ICAM-1-Antikörper biotinylierter </td><td> eBioscience </td><td> Klonen YN1/1.7.4 </td><td> 1:50 Verdünnung </td></tr><tr><td> Isotyp biotinylierten Antikörper </td><td> eBioscience </td><td> IgG2b eB149/10H5 </td><td> 1:50 Verdünnung </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> Beatmungsgerät </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Inspira </td><td></td></tr><tr><td> Tracheostomie Katheters </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 730028 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrokauter Gerät </td><td> DRE Medical </td><td> Valleylab SSE-2L </td><td></td></tr><tr><td> Bipolar Kauter Pinzette </td><td> Olsen Medical </td><td> 10-1200i </td><td> 9.9cm McPherson </td></tr><tr><td> Temperatur control-System </td><td> World Precision Instruments </td><td> ATC1000 </td><td></td></tr><tr><td> Spritzenpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Pumpe 11 Elite </td><td></td></tr><tr><td> Microscope (Weitfeld) </td><td> Nikon </td><td> LV-150 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope (konfokalen) </td><td> Nikon </td><td> A1R </td><td></td></tr><tr><td> Bild Splitter </td><td> Photometrics </td><td> DV2 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Photometrics </td><td> CoolSNAP HQ2 </td><td></td></tr><tr><td> Bildverarbeitungs-Software </td><td> Nikon </td><td> NIS Elements </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylidenfluorid-Membran </td><td> Kure Wrap </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Circular Deckglas </td><td> Bellco </td><td> 5CIR-1-BEL </td><td> 5 mm, Nr. 1 Dicke </td></tr><tr><td> Glue (Deckglas zur Membran) </td><td> Pattex </td><td> Flüssig (liquid) </td><td> Zum Aufkleben Deckglas zur Membran </td></tr><tr><td> Glue (Deckglas zur Maus) </td><td> Pattex </td><td> Gel </td><td> Membran zum Anbringen an Maus </td></tr><tr><td> Chirurgische Schläuche </td><td> Intramedic </td><td> PE50, PE10 </td><td></td></tr><tr><td> Naht </td><td> Fischer </td><td></td><td> 04.00 Seide </td></tr><tr><td> Trockenrasierer </td><td> Oster </td><td> 78997 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Zange gekrümmten </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gerade chirurgische Pinzette </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Schere </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Mikroschere </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Nadeltreiber </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Surgical tape </td><td> Fischer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kitchen sponges (Schnitt in Keile) </td><td> verschiedene </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo measurement of the mouse pulmonary endothelial surface layer

Die endotheliale Glykokalyx ist eine Schicht aus Proteoglycanen und zugehörige Glycosaminoglycane Auskleiden des Gefäßlumens. In vivo die Glykocalix hochhydratisierten ist, Bilden einer erheblichen endothelialen Oberflächenschicht (ESL), die zur Aufrechterhaltung der endothelialen Funktion beiträgt. Als die endotheliale Glykokalyx ist oft aberrante in vitro und ist während der normalen Gewebe Fixationstechniken verloren, benötigt Studie der ESL Verwendung von Intravitalmikroskopie. Um die beste Annäherung an die komplexen Physiologie des alveolären Mikrovaskulatur wird pulmonalen intravital Bildgebung ideal auf einem frei beweglichen Lungenkrebs durchgeführt. Diese Zubereitungen jedoch typischerweise unter umfangreichen Bewegungsartefakt. Wir zeigen, wie mit geschlossenem Brustkorb Intravitalmikroskopie einer frei beweglichen Mauslunge verwendet werden, um Glykocalix Integrität mittels ESL Ausschluss von fluoreszenzmarkierten hochmolekularen Dextrane aus der endothelialen Oberfläche zu messen. Diese Nichtwiedereinziehung chirurgische Technik, die benötigtgleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenz-Bildgebung der Maus Lunge, ermöglicht Längs Beobachtung des subpleural Mikrovaskulatur ohne Beweise zu induzieren confounding Lungenschädigung.

Der experimentelle Ansatz in den Schritten 1-6 beschrieben ermöglichen Erfassung von mehreren Frames gleichzeitiger DIC (Hellfeld) und fluoreszierende Bilder. Um ESL Dicke zu bestimmen, werden aufgenommene Bilder mit einer Blindbeobachter nach Beendigung des experimentellen Protokolls bewertet. Mit Hilfe eines in-Fokussierrahmen subpleural Mikrogefäßen (&lt;20 Mikrometer Durchmesser) identifiziert; mindestens 3 Mikrogefäßen sind in der Regel auf einem einzigen Rahmen (Abbildung 10). Mit Bildanalyse...

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In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

Die endotheliale Glykokalyx / endothelial Oberflächenschicht ist ideal studiert mit Intravitalmikroskopie. Intravitalmikroskopie ist technisch anspruchsvoll in einem sich bewegenden Organ wie der Lunge. Wir zeigen, wie die gleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um Endotheloberfläche Schichtdicke in einem frei beweglichen abzuschätzen<em&gt; In vivo</em&gt; Maus Lunge.

In vivo Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

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Research

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Medicine

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

14.5K Aufrufe.  University of Colorado School of Medicine. Die endotheliale Glykokalyx / endothelial Oberflächenschicht ist ideal studiert mit Intravitalmikroskopie. Intravitalmikroskopie ist technisch anspruchsvoll in einem sich bewegenden Organ wie der Lunge. Wir zeigen, wie die gleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um Endotheloberfläche Schichtdicke in einem frei beweglichen abzuschätzen In vivo Maus Lunge.

Serie: In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

Angiogenese im ischämischen Rat Lung

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Forschung

Medizin

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

Automatisierte Messung der Mikrozirkulation Blutflußgeschwindigkeit in Lungenmetastasen von Ratten

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Automatisierte Messung von Lungenemphysem und Klein Airway Remodeling im Zigarettenrauch ausgesetzten Mäuse

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Measurement of the Pressure-volume Curve in Mouse Lungs

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential phenotypic changes are best assessed by measurement of the changes in lung elasticity. To best understand specific mechanisms underlying such pathologies in mice, it is essential to make functional measurements that can reflect the developing pathology. Although there are many ways to measure elasticity, the classical method is that of the total lung pressure-volume (PV) curve done over the whole range of lung volumes. This measurement has been made on adult lungs from nearly all mammalian species dating back almost 100 years, and such PV curves also played a major role in the discovery and understanding of the function of pulmonary surfactant in fetal lung development. Unfortunately, such total PV curves have not been widely reported in the mouse, despite the fact that they can provide useful information on the macroscopic effects of structural changes in the lung. Although partial PV curves measuring just the changes in lung volume are sometimes reported, without a measure of absolute volume, the nonlinear nature of the total PV curve makes these partial ones very difficult to interpret. In the present study, we describe a standardized way to measure the total PV curve. We have then tested the ability of these curves to detect changes in mouse lung structure in two common lung pathologies, emphysema and fibrosis. Results showed significant changes in several variables consistent with expected structural changes with these pathologies. This measurement of the lung PV curve in mice thus provides a straightforward means to monitor the progression of the pathophysiologic changes over time and the potential effect of therapeutic procedures.

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung&#8217;s structural changes with developing pathology.

Die Messung der Druck-Volumen-Kurve in der Mäuselunge

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Intrauterine Telemetrie zur Maus Kontraktionsdruck messen<em&gt; In-vivo-</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

Mit Micro-Computertomographie-zur Beurteilung der Tumorentwicklung und Follow-up der Reaktion auf die Behandlung in einem Maus-Modell von Lungenkrebs

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Vorbereitende Schritte für die Messung der Reaktivität in Maus retinalen Arteriolen Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ultimately lead to new knowledge concerning the causes of or new ways to inhibit or treat plasma extravasation. It is important that researchers have the proper tools, including the best methods available, for studying plasma extravasation. In this article, we describe a protocol, using the Evans blue dye method, for assessing plasma extravasation in the organs of FVBN mice. This protocol is intentionally simple, to as great a degree as possible, but provides high quality data. Evans blue dye has been chosen primarily because it is easy for the average laboratory to use. We have used this protocol to provide evidence and support for the hypothesis that the enzyme neprilysin may protect the vasculature against plasma extravasation. However, this protocol may be experimentally used and easily adapted for use in other strains of mice or in other species, in many different organs or tissues, for studies which may involve other factors that are important in understanding, preventing, or treating plasma extravasation. This protocol has been extensively optimized and modified from existing protocols, and combines reliability, ease of use, economy, and general availability of materials and equipment, making this protocol superior for the average laboratory to use in quantifying plasma extravasation from organs.

In this article, an economical, optimized, and simple protocol is described which uses the Evans blue dye method for assessing plasma extravasation in the organs of FVBN mice that can be adapted for use in other strains, species, and other organs or tissues.

Eine optimierte Evans blau Protokoll vaskulären Leck in der Maus bewerten

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

Left Atrial Stenosis Induced Pulmonary Venous Arterialization and Group 2 Pulmonary Hypertension in Rat

The mechanism of mitral stenosis-induced pulmonary venous arterialization and group 2 pulmonary hypertension (PH) is unclear. There is no rodent model of group 2 PH, due to mitral stenosis (MS), to facilitate the investigation of disease mechanisms and potential therapeutic strategies. We present a novel rat model of pulmonary venous congestion-induced pulmonary venous arterialization and group 2 PH caused by left atrial stenosis (LAS). LAS is achieved by constricting the left atrium using a half-closed titanium clip. After the LAS surgery, a rat model with a transmitral inflow velocity greater than or equal to 2.0 m/s on echocardiography gradually develops pulmonary venous arterialization and group 2 PH over an 8- to 10-week period. In this protocol, we provide the step-by-step procedure of how to perform the LAS surgery. The presented LAS rat model mimics MS in humans and is useful for studying the underlying molecular mechanism of pulmonary venous arterialization and for the preclinical evaluation of therapies for group 2 PH.

Left atrial stenosis (LAS) is a novel surgical technique used for studying group 2 pulmonary hypertension (PH) and mechanisms underlying pulmonary venous arterialization. Here, we present a protocol to constrict the left atrium using a titanium clip to cause pulmonary venous arterialization and moderate PH in a rat.

Linken Atrial Stenose induzierten pulmonalen venösen Arterialization und Gruppe 2 pulmonale Hypertonie in der Ratte

The mechanism of mitral stenosis-induced pulmonary venous arterialization and group 2 pulmonary hypertension (PH) is unclear. There is no rodent model of ...