Diese Methode befasst sich mit der Analyse von Entwicklungsprozessen wie Muskelkontraktionen und Rollieren, die im Drosophila-Embryo auftreten. Einige Vorteile dieser Technik sind, dass es nicht invasiv und ziemlich detailliert ist, aber es ist relativ einfach durchzuführen. Unsere Methode kann für das risikoreiche, analysebasierte Screening weiterentwickelt werden, um neue Mutationen zu isolieren und zu analysieren, die embryonale Muskelkontraktionen und andere Entwicklungsprozesse beeinflussen.
Bei der Visualisierung von Muskelkontraktionen ist es wichtig, Embryo-Sammlungen richtig zu terminieren, da Kontraktionen erst in einem bestimmten Entwicklungsstadium beginnen. Die visuelle Demonstration kann Schritt für Schritt bei der quantitativen Analyse der Entwicklungsprozesse erheblich helfen. Zur Live-Bildgebung von montierten Drosophila-Embryonen legen Sie die Embryonen auf das Stadium eines Epifluoreszenzmikroskops mit Zeitrafferfunktion und einer Digitalkamera mit geeigneten Emissionsfiltern und wählen Sie eine 10-fache Wasser-Tauchobjektivlinse aus.
Anschließend zeichnen Live-Videos die Embryonen mit der entsprechenden Mikroskop-Aufnahmesoftware für etwa ein bis zwei Stunden mit einer Erfassungsrate von vier Bildern pro Sekunde auf. Exportieren Sie das aufgenommene Video am Ende des Experiments direkt in ImageJ. Wählen Sie Bild und Zuschneiden aus, um eine Box um jeden einzelnen Embryo zu zeichnen, um die Videoaufzeichnungen auf die Größe jedes Embryos zuschneiden.
Klicken Sie auf Bild, Transformieren und Drehen, um die zugeschnittenen Bilder zu drehen, um eine vertikale Position der Embryo-Mittellinie relativ zum Bildschirm zu erreichen. Um Entfernungsmessungen auf Mikrometer festzulegen, klicken Sie auf Analysieren und Skalieren festlegen, und geben Sie dann den bekannten Umwandlungsfaktor für das Verhältnis Pixel zu Mikrometer für Ihr Mikroskop-Setup ein. Alle nachfolgenden Messungen werden dann in Mikrometern gemeldet.
Um das Walzen des Embryos zu analysieren, markieren Sie zuerst die Position einer oder beider Luftröhren eines Embryos im ersten Frame des Videos auf halbem Weg zwischen den hinteren und vorderen Enden, und klicken Sie auf Analysieren, Tools und Region of Interest Manager. Zeichnen Sie eine ungefähre Sieben-Mikrometer-x-Sieben-Mikrometer-Box um die Luftröhre und klicken Sie auf die T-Taste auf der Tastatur, um diese Position als XY-Koordinate aufzuzeichnen. Markieren Sie die Position des gleichen Bereichs der Luftröhre nach peristaltischen Kontraktionen von Interesse und zeichnen Sie eine Linie, die die Mitten jedes Feldes verbindet, indem Sie auf m auf der Tastatur klicken, um den Abstand von der Position vor der Kontraktion zur Position nach der Kontraktion zu messen.
Um embryonale Muskelkontraktionen mit Embryonen zu analysieren, die fluoreszierende Muskelmarker exdrücken, verwenden Sie die Aufzeichnung der fluoreszierenden Auslesung, um einen Bereich von Interesse zu zeichnen, der um die fluoreszierenden Muskeln eines bestimmten Körpersegments von Interesse zentriert ist. Wählen Sie die Registerkarte T hinzufügen im Bereichs-Interessen-Manager aus, um die Position der Interessenregion aufzuzeichnen. Klicken Sie auf "Bereichs-Interessen-Manager" und "Messen", um die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der einzelnen Interessensgebiete aufzuzeichnen, die für jeden Frame des Videos ausgewählt wurden.
Verschieben Sie das Feld in die Zentren anderer Körpersegmente von Interesse, und klicken Sie auf T hinzufügen, um ihre Positionen aufzuzeichnen, um Bereiche gleicher Größe in allen zu analysierenden Körpersegmenten zu erhalten. Halten Sie im Bereichs-Interessen-Manager die Steuertaste, während Sie alle Interessenbereiche auswählen, die als XY-Koordinaten aufgezeichnet sind. Klicken Sie auf Mehr und Mehrfachmaß, um die mittlere fluoreszierende Intensität jeder Region zu messen, die für alle Frames des Videos von Interesse ist.
Dadurch wird jede Messung in einer Tabelle mit jedem Interessenbereich als Spalte der Tabelle und jedem Frame als Zeile gemeldet. Übertragen Sie die Tabelle dann zur weiteren Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Zeichnen Sie ein Diagramm mit der Bildnummer auf der x-Achse und der mittleren Fluoreszenzintensität auf der y-Achse und konvertieren Sie die Framezahl mithilfe der Bildrate von vier Bildern pro Sekunde in Zeit.
Die Muskelkontraktionen erhöhen die GFP-Intensität, da sie mehr GFP in die Nähe des Brennbereichs bringen, da mehr Muskeln während dieser Kontraktionen eingezogen werden. Um die Amplitude der Muskelkontraktion zu bestimmen, schätzen Sie die GFP-Basisintensität als die durchschnittliche Intensität der Regionen zwischen Denspitzen. Bewerten Sie dann den Anstieg der GFP-Fluoreszenzintensität im Verhältnis zu dieser Basislinie.
Dividieren Sie dann jeden Bereich mit der Intensität des Interesses durch die Basisintensität, um die GFP-Intensität auf die Basislinie zu normalisieren. Vergleichen Sie die normalisierten GFP-Intensitäten an hinteren, medialen und vorderen Segmenten während der Muskelkontraktionswelle, um die Veränderungen im Ausmaß der Muskelkontraktion zu untersuchen, wenn sich die Welle ausbreitet, und um die Richtung der Welle zu bestimmen. Um die Muskelkontraktionen auf der linken und rechten Seite des Embryos zu vergleichen, analysieren Sie die Spitzenintensitäten für die gleichen Segmente auf beiden Seiten des Embryos.
Verwenden Sie die Kontraktionsamplitude und das Timing der Peaks, um die Unterschiede, falls vorhanden, und das Ausmaß und das Timing der peristaltischen Muskelkontraktionswellen aufzuzeigen. Hier werden normale peristaltische Muskelkontraktionen in einem wilden Drosophila-Embryo gezeigt. Beachten Sie in diesem Video, in dem ein embryonaler Wilder-Embryo gerollt wird, dass sich das dorsale Anhängsivnichte nicht bewegt, während die Luftröhre darauf hinweist, dass der Embryo in seiner Schale gerollt ist.
In dieser repräsentativen Analyse stellen die Muskelkontraktionen während des Zeitraums von 165 bis 178 Sekunden eine einzelne Vorwärtswelle dar. Für diesen Embryo wurde kein Unterschied in der Amplitude und der Zeit der Muskelkontraktionen auf der rechten und linken Seite des Embryos gemessen. Eine peristaltische Kontraktion wird als Vorwärtstyp-1-Welle bezeichnet, wenn ihr Profil einen Gipfel hat, der zuerst in der hinteren Region entsteht, gefolgt von Spitzen in der mittleren und vorderen Region.
Eine rückwärts gerichtete Welle typ ist ein Peak, der zuerst an vorderen Segmenten entsteht und sich dann in richtungsträge Regionen ausbreitet. Typ zwei Wellen beginnen an einem Ende des Embryos und gehen in Richtung der mittleren Regionen, bevor sie zu ihrem Ursprung zurückkehren, als eine schwungvolle Welle am entgegengesetzten Ende wieder angestoßen wird. Körperhaltung mutierte Embryonen zeigen eine abnormale relative Häufigkeit von Typ eins bis Typ zwei Wellengeneration, die zu einer Körperhaltung Anomalie bezeichnet als KörperTorsion oder Rotation Phänotyp führt.
Um Fluoreszenz als Auslese für die Parameter der Muskelkontraktion zu verwenden, ist es wichtig, Embryonen mit einem Reporter im Muskelgewebe zu verwenden. Diese Methode kann für die gleichzeitige Aufzeichnung der Muskelkontraktionen vieler Embryonen und für die Beurteilung der Reaktionen auf verschiedene Reize, Medikamente oder Umweltveränderungen verwendet werden.
