Name: in vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in drosophila pupae
Uploaded: 2018-02-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae at JoVE.com

Wir danken Manuela Weitkunat für den Erwerb von Film S3. Wir sind dankbar für die großzügige Unterstützung Reinhard Fässler. Diese Arbeit wurde unterstützt von EMBO Young Investigator Programm (f.), der Europäische Forschungsrat unter dem siebten Rahmenprogramm der Europäischen Union (FP/2007-2013) / ERC-Grant-310939 (f.), der Max-Planck-Gesellschaft (S.B.L., f.s.), dem Centre National De La Recherche Scientifique (CNRS) (f.), der Exzellenzinitiative Aix-Marseille Universität AMIDEX (f.), die LabEX informieren (f.) und der Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).

1. Etappe-Puppen
<ol><li>Richten Sie ein Kreuz mit 20-40 jungfräulichen Weibchen und ca. 20 Männchen pro Flasche fliegen Essen (Abbildung 1A). Alternativ, wenn Aktien verwendet werden, spiegeln Sie jede Aktie in neuen Flaschen. Um genug Puppen zu erhalten, erwägen Sie, zwei Flaschen pro Genotyp.</li>
	<li>Fünf bis sechs Tage (Abbildung 1 b) die Flaschen bei 25 ° C (oder 27 ° C nach den Versuchsplan) inkubieren. Hinweis: Spiegeln Sie halten Sie die fliegen alle zwei bis drei Tage, um Überfüllung zu vermeiden und gewährleisten eine kontinuierliche Versorgung mit Puppen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen nassen Pinsel, um weiße Prepupae von den Wänden der Flaschen zu sammeln und übertragen Sie sie auf den Objektträger (Abbildung 1). Zeit die Inszenierung, so dass die Puppen die gewünschte erreichen Alter beim live imaging unter die Lupe genommen. Hinweis: Diese Prepupae sehen aus wie ältere Puppen in Bezug auf ihre Form, aber sie sind immer noch weiß wie Larven. Das Auftreten der prepupal Bühne ist definiert als 0 h nach Puppenkammer Bildung (0 h APF).</li>
	<li>Klumpen von fliegen Essen festhalten an die Puppen mit einem nassen Pinsel zu entfernen und der Bauchseite die Puppen auf dem Objektträger mit einem Stereomikroskop (Abbildung 1) zu orientieren. Entsorgen Sie Puppen, die sind noch in Bewegung (zu jung) oder, die inzwischen zu bräunen (zu alt). Dadurch wird sichergestellt, dass alle Puppen im gleiche Alter (0 - 1 h APF) haben.</li>
	<li>Beschriften Sie die Folien mit Genotyp, Datum und Zeit der Sammlung. Übertragen Sie die Glas-Folien auf eine Petrischale und fügen Sie einem feuchten Tuch um die Puppen Austrocknen verhindert wird (Abbildung 1E hinzu).</li>
	<li>Speichern Sie die Puppen in einem Inkubator bei 25 ° C und 27 ° C, bis sie das gewünschte Alter erreichen. Weiter mit den nächsten Schritten 1 h vor Bildgebung, so dass die Puppen das gewünschte Alter beim live Imaging (Schritt 3), zum Beispiel um 13 h APF für den Film gezeigt in der Abbildung 2A-Dstarten. Hinweis: Die frühesten möglich Zeit Ausgangspunkt ist nach Kopf-Eversion der Puppen, die bei 8-10 h APF bei 27 ° C.</li>
</ol>2. bereiten Sie Puppen für die Bildgebung
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die Puppen nun auf den Objektträger kleben, so wie sie natürlich an den Wänden der Flaschen wegen verbleibenden fliegen Essen halten. Kein zusätzlicher Kleber ist erforderlich. Wenn die Puppen nicht gut genug wegen der hohen Luftfeuchtigkeit halten, öffnen Sie die Petrischale für ein paar Minuten trocknen lassen. Alternativ auf doppelseitigem Klebeband auf einen Objektträger übertragen, aber dies ist in der Regel nicht notwendig.</li>
	<li>
Offenes Fenster im pupal Fall für die Darstellung von indirekten Flugmuskeln (Abbildung 1F; Wechseln Sie zum Abschnitt 2.3 für die Bildgebung der Bauchmuskeln.)<ol>
<li>Richten Sie die Puppen auf dem Objektträger mit den vorderen abgewandten des Forschers unter einem Stereomikroskop kleben. Stellen Sie den Zoom, 2 X.</li>
		<li>Mit einem Ende der Biologie Klasse #5 Zange vorsichtig poke ein Loch in den pupal Fall dorsal an den Flügel, wo das Abdomen endet, und Thorax beginnt.</li>
		<li>Um offene pupal Fall schneiden, sanft bewegen Sie die Zange bis zum vorderen Ende des Thorax entlang der Flügel zu, aber nicht zu beschädigen das Gewebe anfällig Flügel. Hinweis: Wenn Flüssigkeit aus der Puppe Austritt, es beschädigt ist; verwerfen und neu zu beginnen mit einer anderen Puppe.</li>
		<li>Abschnitt der pupal Fall über den Brustkorb heben Sie mit der Zange und dann abgeschnitten in diesem Abschnitt wird mit einer feinen, scharfen Schere auf der gegenüberliegenden Seite der dorsalen Mittellinie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Offenes Fenster im pupal Fall für die Bildgebung der Bauchmuskeln (Abbildung 1)<ol>
<li>Richten Sie die Puppen auf dem Objektträger mit der vorderen nach unten in Richtung des Forschers unter einem Stereomikroskop kleben. Stellen Sie den Zoom, 2 X.</li>
		<li>Mit einem Ende der Biologie Klasse #5 Zange vorsichtig poke ein Loch in den pupal Fall dorsal an den Flügel, wo der Thorax endet, und Abdomen beginnt.</li>
		<li>Zum Öffnen den pupal Fall schneiden, sanft bewegen der Zange am hinteren Ende des Bauches. Hinweis: Wenn Flüssigkeit aus der Puppe Austritt, es beschädigt ist; verwerfen und neu zu beginnen mit einer anderen Puppe.</li>
		<li>Abschnitt der pupal Fall über dem Zwerchfell mit der Zange anheben und dann mit feinen, scharfen Schere auf der gegenüberliegenden Seite der dorsalen Mittellinie dieses Abschnitts abgeschnitten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mount-Puppen (Abbildung 1 H)<ol>
<li>Verwenden Sie einen nassen Pinsel um bis zu fünf Puppen auf eine Kunststoff-Folie mit einer Nut (Custom-Built, wiederverwendbar, siehe Diskussion und Materialliste) zu übertragen. Fügen Sie ein oder zwei Abstandhalter Deckgläsern, auf jeder Seite je nach Tiefe der Nut und der Dicke der Puppen. Setzen Sie einen kleinen Tropfen unterhalb jeder Abstandhalter Deckglas zu machen, halten Sie sich an der Folie und lassen Sie etwas Platz zwischen den Groove und die Abstandhalter Deckgläsern auf jeder Seite. Hinweis: Die Abstandhalter Deckgläsern können auch dauerhaft auf die Folie mit Superkleber, vorab befestigt werden.</li>
		<li>Die Puppen zu orientieren, so dass die Öffnung im pupal Fall Gesichter nach oben mit dem Pinsel. Sorgfältige Positionierung der Puppen im richtigen Winkel für gute Bildqualität zu gewährleisten. Optimieren Sie den Winkel für jedes Gewebe und Entwicklungszeit. Hinweis: Eine kleine Menge Wasser in die Nut Positionierung der Puppen einfacher macht. Überschüssiges Wasser mit dem Pinsel danach zu ertrinken zu vermeiden.</li>
		<li>Halten Sie ein Deckglas (18 x 18 mm) über die Puppen, ohne sie zu berühren. Kleine Tröpfchen (ca. 0,5 µL) 50 % Glycerin-Lösung über jedem pupal Fall öffnet sich das Deckglas mit einer 20 µL Pipette zu platzieren. Hinweis: Dieses Verfahren wird sichergestellt, dass die Tropfen den gleichen Abstand wie die Puppen haben.</li>
		<li>Umdrehen Sie das Deckglas und positionieren Sie es über die Puppen von Hand oder mit einer Pinzette (standard #5) beim stillstehen einseitig das Deckglas auf den Abstandhalter Deckgläsern neben der Puppen. Als nächstes fallen Sie sanft das Deckglas auf die Puppen. Sicherstellen Sie, dass die pupal Fall Öffnungen ordnungsgemäß mit 50 % Glycerin für gute Bildqualität und die Puppen vor dem Austrocknen zu verhindern.</li>
		<li>Falten Sie ein Stück Klebeband über ein Ende und greifen sie mit der Pinzette (standard #5) zu diesem Zweck. Legen Sie das Maßband sanft, so dass es eine Kante des oberen Deckglas, die Abstandhalter-Coverslip(s) und die Kunststoff-Folie auf der einen Seite abdeckt. Drücken Sie das Band nicht noch aus. Zuerst die Folie umdrehen und auf der anderen Seite wiederholen.</li>
		<li>Verwenden Sie beide Zeigefinger auf beiden Seiten das Band gleichzeitig drücken. Dieses Verfahren wird sichergestellt, dass die Puppen nicht verdrängt werden.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob die Puppen auch in Kontakt mit dem Deckglas sind. Für optimale Bildqualität sollte die Puppen sanft unter dem Deckglas gedrückt werden. Passen Sie die Anzahl der Spacer Deckgläsern, falls erforderlich.</li>
		<li>Beschriften Sie die Folie durch das Schreiben auf das Klebeband.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. live Imaging von Puppen
<ol><li>Die Montage-Methode ermöglicht Bildgebung die Puppen sowohl auf invertierte Mikroskope (Abbildung 1I) aufrechte Mikroskope (Abbildung 1J). Besonders geeignet für live Imaging Scannen konfokale Mikroskope, zwei-Photonen-Mikroskope und drehenden Scheibe konfokale Mikroskope unabhängig davon, ob sie seitenverkehrt sind oder aufrecht. Verwenden Sie für langfristige Filme eine temperaturgeführte Bühne Falls vorhanden.</li>
	<li>Suchen Sie mit Hilfe des Okulars und eine UV-Lampe oder leichte Übertragung, eine Puppe und konzentrieren sich im Inneren der Puppe.</li>
	<li>Mit der Kamera, finden Sie die gewünschte Struktur zu und passen Sie die Zoom-Stufe.</li>
	<li>Definieren Sie für langfristige Filme einen Z-Stapel, der die Struktur von Interesse gut (z. B. die indirekten Flugmuskeln, ihre Anlage-Websites, der Sehnenzellen oder eine Kombination der oben genannten) umfasst, und wählen Sie ein Zeitintervall. Erwägen Sie für bessere Bildqualität durchschnittlich. Wählen Sie für schnelle, kurzfristige Filme einer Z-Ebene, eine hohe Bildrate zu erreichen.</li>
	<li>Passen Sie die Leistung des Lasers, das bestmögliche Signal aber wenig Sättigung zu geben. Allerdings kann auch hohe Laserleistung die Puppe im Laufe der Zeit beschädigen.</li>
	<li>Starten Sie Imaging und wieder von Zeit zu Zeit überprüfen den Film und die Z-Stapel-Positionierung, ggf. nachjustieren.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig1.jpg"> Abbildung 1: Workflow für live Aufnahmen von Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen. Siehe Protokoll für Details. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die vorgestellte Protokoll beschreibt, wie Muskel-Sehnen-Morphogenese in lebenden Bild Drosophila Puppen mit einer Vielzahl von Eindringmittel tagged Proteine. Dieses in-Vivo imaging-Strategie kann verwendet werden, um Entwicklungsprozesse in ihrer natürlichen Umgebung des gesamten Organismus zu studieren.
Es ist entscheidend für ein gelungenes Experiment, den richtigen Entwicklungszeit zu analysieren Punkt zu finden. Zum Beispiel initiieren Dorsolongitudinal indirekten Flugmuskeln Bindung an ihre Ziele Sehne ≈16 h APF23 während Bauchmuskeln später entwickeln und befestigen Sie an beiden Enden nur zwischen 30 und 40 h APF26. Daher zuvor veröffentlichter Literatur sollte verwendet werden, zu den richtigen Zeitpunkten der Entwicklung zu analysieren, oder wenn das Gewebe oder die Struktur des Interesses nicht vor detailliert untersucht worden ist, hat die gesamte Entwicklung zunächst charakterisiert werden.
Für Montage Puppen erfolgreich auf den speziell angefertigten Kunststoff-Folien, ist es wichtig, dass die Nuten geeignetste Abmessungen haben: die Nuten müssen 1,0-1,5 mm breit und 0,3 - 0,4 mm tief. Dieser Tiefe ermöglicht die genaue Distanz zu den oberen Deckglas mit Abstandhalter Deckgläsern nach Bedarf anpassen. Jedoch sollten mindestens einen Abstandhalter Deckglas verwendet werden, um entladen 50 % Glycerin aus der Probe zu verhindern durch Kapillarkräfte. Die richtige Positionierung der Puppen in der Nut erfordert etwas Erfahrung und sollten optimiert werden, so dass die Struktur des Interesses so nah wie möglich an das Deckglas ist.
Wenn eine große Anzahl von Puppen in einem Mikroskop Sitzung abgebildet werden soll, können sie alle vorher montiert und dann gespeichert im Inkubator bis imaging um richtige Entwicklungsstörungen Timing sicherzustellen. Die Puppen sollten das gesamte Verfahren zu überleben und auch zumindest versuchen, Eclose, wenn auf der Folie nach dem Imaging gehalten. Die Überlebensrate kann als eine Anzeige verwendet werden, um zu überprüfen, ob die bildgebenden Bedingungen die Puppen Schaden.
Die bildgebenden Einstellungen sollte sorgfältig nach den experimentellen Anforderungen gewählt werden. Für kurzfristige Filme muss eine hohe Bildrate gegen ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis ausgeglichen werden, während relativ hohe Laserleistung verwendet werden kann, ohne dass die Puppen zu viel. Für langfristige Filme, die Laserleistung hat jedoch auf einem moderaten Niveau zu halten und die Puppen sollten nicht kontinuierlich sondern zu bestimmten Zeitpunkten, z.B. alle 20 min. abgebildet werden. Um sicherzustellen, dass die Struktur des Interesses nicht aus dem Blickfeld bewegt, könnte es passen Sie die Position der Z-Stapel zwischen Zeitpunkten erforderlich. Nach unserer Kenntnis beeinflusst die Eröffnung der pupal Fall schlechthin nicht Entwicklungsstörungen Timing. Jedoch sollte eine temperaturgeführte Bühne für langfristige Filme verwendet werden, um richtige Entwicklungsstörungen Timing sicherzustellen. Unter Berücksichtigung dieser Überlegungen, können sehr informative Filme erworben werden.
Die vorgestellte Protokoll kann verwendet werden, nicht nur Muskeln und Sehnen Morphogenese, sondern auch andere entwickelnden Gewebe, z. B. die Flügel Epithel29zu visualisieren. Es sind nur drei Änderungen dieses Protokolls erforderlich: (1) Eröffnung der pupal Fall über die Flügel statt den Brustkorb oder Bauch, (2) Positionierung der Puppen mit dem Flügel in Richtung der oberen Deckglas und (3) die Verwendung von verschiedenen fluoreszierenden Marker-Proteine. Mit der Weiterentwicklung der CRISPR/Cas9-Technologie werden mehr und mehr endogen tagged fluoreszierende Proteine verfügbar sein, weil es einfacher zu endogenen Loci in Drosophila30,31 Ziel geworden ist , 32. in Zukunft dadurch Aufklärung die Dynamik von zahlreichen Proteinen, Zellen und ganze Gewebe in ihrer physiologischen Umgebung im Detail.

Der Muskel-Sehnen-Apparat ermöglicht Tieren einschließlich des Menschen um ihre Körperteile bewegen. Die molekularen Bausteine der Muskel-Sehnen-System sind hoch konserviert. Daher können Konzepte der Muskel-Sehnen-Entwicklung für menschliche Muskel Biologie, z. B. Muskel Morphogenese, Muskel-Sehnenansatz und Myofibril Selbstorganisation, studiert werden mit Drosophila Melanogaster als eine leicht zugängliche Modellsystem. Die Drosophila pupal System hat mehrere experimentelle Vorteile. Erstens, wenn die Erwachsenen Muskeln gebildet werden – ist an das Puppenstadium – der Organismus Traubeneichen und daher leicht zu Bild am Mikroskop über einen Zeitraum von Stunden oder sogar Tage. Zweitens: viele Muskeln bilden nahe genug unter der pupal Oberfläche, so dass sie innerhalb des Organismus intakt, teilweise durchscheinenden abgebildet werden können. Drittens können die Muskeln in ihrer natürlichen Umgebung untersucht werden, wo sie die Formung Exoskelett über Sehnenzellen verbunden sind und Gewebespannung wird aufgebaut. Dies ist nicht möglich im Muskel Zellkultursysteme. Und zu guter Letzt gibt es eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen in Drosophila. Dazu gehören viele Eindringmittel tagged Markierungen, die es ermöglichen, Kennzeichnung von bestimmten Zelltypen oder subzellulären Strukturen für in-Vivoimaging.
Tabelle 1 fasst die wichtigsten Marker für das Studium der Muskel-Sehnen-Morphogenese verwendet. Es enthält Marker mit dem GAL4-UAS-System1 überexprimiert und endogen verschlagwortet Protein Marker2,3,4. Der Vorteil des GAL4-UAS-Systems ist, dass die Markierungen in der Regel ausgedrückt werden, auf einem hohen Niveau, wodurch ein starkes Signal, das leicht im ganzen-Mount Puppen abgebildet werden kann. Darüber hinaus kann Gewebespezifität durch Wahl GAL4 Treiber sorgfältig erfolgen. Der Vorteil von Fusionsproteinen ausgedrückt unter endogene Kontrolle ist zum Beispiel, dass die Dynamik der jeweiligen Proteine studierte in Vivo, werden können, während sie auch als Marker für verschiedene Zelltypen oder spezifische subzellulären Strukturen genutzt werden können, ΒPS-Integrin-GLP für Muskel-Anlage-Sites. Zusammen bieten diese Marker hohen Flexibilität bei der Versuchsplanung und Auswahl der Probleme, die jetzt und in Zukunft gelöst werden können.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Beschriftete Struktur</td>
			<td colspan="2">Marker</td>
			<td colspan="2">Ausdruck und Lokalisierung</td>
			<td colspan="2">Klasse</td>
			<td colspan="2">Lagernummer</td>
			<td colspan="2">Kommentar</td>
			<td>Ref.</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="15">Muskel</td>
			<td colspan="2">
Mef2-GAL4</td>
			<td colspan="2">alle Myoblasten und alle Muskeln in allen Phasen</td>
			<td colspan="2">Gal4-Linie</td>
			<td colspan="2">BL 27390</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
1151-GAL4</td>
			<td colspan="2">Erwachsenen Muskel Vorstufen und frühe Myotubes bis ≈24 h APF</td>
			<td colspan="2">Gal4 Linie, Enhancer-trap</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act79B-GAL4</td>
			<td colspan="2">Muskel auf Differenzierung zu springen</td>
			<td colspan="2">Gal4-Linie</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F-GAL4</td>
			<td colspan="2">indirekten Flugmuskeln ab ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">Gal4-Linie</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F- Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">indirekten Flugmuskeln ab ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">Act88F Enhancer / Projektträger driving Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Ca2 + Kennzeichen</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Act88F-GFP</td>
			<td colspan="2">indirekten Flugmuskeln ab ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">GFP-Fusion (TransgeneOme-Fliegenschnur)</td>
			<td colspan="2">fTRG78 und fTRG10028</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Ihn- Nls-GFP</td>
			<td colspan="2">Erwachsenen Muskel Vorstufen, Kernenergie, bis ≈24 h APF in indirekten Flugmuskeln</td>
			<td colspan="2">Enhancer/Promotor mit Nls-GFP-reporter</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">1,5 kb-Enhancer-fragment</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
MHC-Tau-GFP</td>
			<td colspan="2">Mikrotubuli in DLM Vorlagen und bei der Unterscheidung von Muskeln</td>
			<td colspan="2">Enhancer/Promotor mit Tau-GFP-reporter</td>
			<td colspan="2">BL 53739</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ΒTub60D-GFP</td>
			<td colspan="2">Mikrotubuli in Myotubes (z. B. in indirekten Flugmuskeln aus ≈14 h AFP, stark rückläufig, nach ≈48 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-Fusion (TransgeneOme-Fliegenschnur)</td>
			<td colspan="2">fTRG958</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MHC-GLP (weeP26)</td>
			<td colspan="2">Sarkomeren (Dicke Filament) in alle Körpermuskeln (z. B. in indirekten Flugmuskeln ab ≈30 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-Falle</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Verwenden Sie heterozygot, Etiketten eine Isoform Teilmenge</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SLS-GFP</td>
			<td colspan="2">Sarkomeren (Z-Scheibe) in alle Körpermuskeln (z. B. in indirekten Flugmuskeln ab ≈30 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-Trap (FlyTrap Linie)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">G53, Verwendung heterozygot</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp66-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-Scheibe in alle Körpermuskeln</td>
			<td colspan="2">GFP-Trap (FlyTrap Linie)</td>
			<td colspan="2">BL 6824</td>
			<td colspan="2">ZCL0663</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp52-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-Scheibe in alle Körpermuskeln</td>
			<td colspan="2">GFP-Trap (FlyTrap Linie)</td>
			<td colspan="2">BL 6838</td>
			<td colspan="2">G00189</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">HTS-GFP</td>
			<td colspan="2">Aktin Bindung; ausgedrückt in Epithel, Myoblasten und myotubes</td>
			<td colspan="2">GFP-Fusion (TransgeneOme-Fliegenschnur)</td>
			<td colspan="2">fTRG585</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Dlg1-GFP</td>
			<td colspan="2">Epithelzelle Kreuzungen, Myoblasten und Membranen in den Muskeln auf allen Stufen</td>
			<td colspan="2">GFP-Fusion (TransgeneOme-Fliegenschnur)</td>
			<td colspan="2">fTRG502</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="5">Muskel-Anlage-Website</td>
			<td colspan="2">ΒPS-Integrin-GFP</td>
			<td colspan="2" fo:page-break-inside="avoid">Muskel Befestigung Websites (z. B. ab ≈18 h AFP in indirekten Flugmuskeln)</td>
			<td colspan="2">GFP-Knock-in</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP und -mCherry</td>
			<td colspan="2">Muskel Befestigung Websites (z. B. ab ≈18 h AFP in indirekten Flugmuskeln)</td>
			<td colspan="2">GFP-Trap (MiMIC Linie)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP</td>
			<td colspan="2">Muskel Befestigung Websites (z. B. ab ≈18 h AFP in indirekten Flugmuskeln)</td>
			<td colspan="2">GFP-Fusion (TransgeneOme-Fliegenschnur)</td>
			<td colspan="2">fTRG587</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ILK-GFP</td>
			<td colspan="2">Muskel Befestigung Websites (z. B. ab ≈18 h AFP in indirekten Flugmuskeln)</td>
			<td colspan="2">GFP-Trap (FlyTrap Linie)</td>
			<td colspan="2">Kyoto 110951 (ZCL3111)</td>
			<td colspan="2">ZCL3111, ZCL3192</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vinc-GFP und -RFP</td>
			<td colspan="2">Muskel Befestigung Websites (z. B. ab ≈18 h AFP in indirekten Flugmuskeln)</td>
			<td colspan="2">GFP-Fusion (Transgen)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Sehne</td>
			<td colspan="2">
SR-GAL4</td>
			<td colspan="2">Thorax Sehnenzellen im gesamten Puppenstadium</td>
			<td colspan="2">Gal4 Linie, Enhancer-trap</td>
			<td colspan="2">BL 26663</td>
			<td colspan="2">homozygot tödlich</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Muskeln und Sehnen</td>
			<td colspan="2">
DUF-GAL4</td>
			<td colspan="2">Muskeln und Epithelien, früh einsetzende</td>
			<td colspan="2">Gal4-Linie</td>
			<td colspan="2">BL 66682</td>
			<td colspan="2">Kirre-rP298, Gründer Zellmarkierung</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="7">FH-Reporter</td>
			<td colspan="2">
FH- GFP-Gma</td>
			<td colspan="2">Actin-bindende</td>
			<td colspan="2">FH-Linie</td>
			<td colspan="2">BL 31776</td>
			<td colspan="2">Actin-bindende Domäne des Moesin verschmolzen, GLP</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
FH- mCherry-Gma</td>
			<td colspan="2">Actin-bindende</td>
			<td colspan="2">FH-Linie</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">GMA verschmolzen, mCherry</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
FH- Lifeact-GFP</td>
			<td colspan="2">Actin-bindende</td>
			<td colspan="2">FH-Linie</td>
			<td colspan="2">BL 35544</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
FH- Lifeact-Ruby</td>
			<td colspan="2">Actin-bindende</td>
			<td colspan="2">FH-Linie</td>
			<td colspan="2">BL 35545</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
FH-CD8-GFP</td>
			<td colspan="2">Membran-Bindung</td>
			<td colspan="2">FH-Linie</td>
			<td colspan="2">verschiedene Aktien, z. B.: BL 32184</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
FH-CD8-mCherry</td>
			<td colspan="2">Membran-Bindung</td>
			<td colspan="2">FH-Linie</td>
			<td colspan="2">BL 27391 und 27392</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
FH-Palm-mCherry</td>
			<td colspan="2">Membran-Bindung durch palmitoylation</td>
			<td colspan="2">FH-Linie</td>
			<td colspan="2">BL 34514</td>
			<td colspan="2">
FH- brainbow</td>
			<td>21</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Eindringmittel getaggt Protein Marker geeignet für Muskeln und Sehnen Morphogenese in Vivozu studieren.
Hier beschreiben wir im Detail wie Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in lebenden Puppen einfach und erfolgreich durchgeführt werden kann (Abbildung 1). Alternativ können die Puppen befestigt werden, seziert und Immunostained, wodurch mit Antikörpern auch Proteine, für die kein Marker Leben, beschriften sind verfügbar22. In diesem Fall ist die Bildqualität in der Regel höher, da gibt es keine Bewegung und die Struktur von Interesse in unmittelbarer Nähe zu dem Deckglas platziert werden kann. Jedoch Dissektion und Fixierung können führen zu Schäden und molekulare oder Gewebe Dynamik, z. B. Muskelzuckungen, kann nur im lebenden Organismus untersucht werden.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>product has been replaced by Leica M60</td></tr><tr><td>fly food in bottles (or vials)</td><td>-</td><td>-</td><td>standard culture medium</td></tr><tr><td>paint brush</td><td>da Vinci</td><td>1526Y</td><td>size 1</td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>VWR: 631-1303</td><td>76 x 26 mm</td></tr><tr><td>double-sided tape (optional)</td><td>Scotch</td><td>6651263</td><td>12 mm x 6.3 m</td></tr><tr><td>petri dishes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632102</td><td>94 x 16 mm</td></tr><tr><td>paper tissues</td><td>Th.Geyer</td><td>7695251</td><td></td></tr><tr><td>forceps #5 (Dumont, inox, standard)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>0.1 mm x 0.06 mm tip</td></tr><tr><td>forceps #5 (Dumont, inox, biology grade)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>0.05 mm x 0.02 mm tip</td></tr><tr><td>Cohan-Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td>straight tip</td></tr><tr><td>plastic slides with a groove (reusable)</td><td>custom-built</td><td>-</td><td>75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove</td></tr><tr><td>coverslips</td><td>Marienfeld</td><td>107032</td><td>18 x 18 mm, No. 1.5H</td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49781</td><td>dilute to 50 % in water</td></tr><tr><td>adhesive tape</td><td>Tesa</td><td>57370-02</td><td>1.5 mm x 10 m</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in drosophila pupae

Muskeln, Sehnen sowie das Skelett ermöglichen Tieren einschließlich des Menschen um ihre Körperteile bewegen. Muskel Morphogenese ist stark vom Tier auf den Menschen erhalten. Daher kann das leistungsstarke Drosophila -Modell-System verwendet werden, Konzepte der Muskel-Sehnen-Entwicklung zu studieren, auch die menschlichen Muskel Biologie angewendet werden können. Hier beschreiben wir im Detail wie Morphogenese der Erwachsenen Muskel-Sehnen-System im Wohnzimmer, leicht abgebildet werden kann Drosophila Puppen zu entwickeln. Daher kann die Methode, Proteine, Zellen und Gewebe in ihrer physiologischen Umgebung zu untersuchen. Neben einer Schritt für Schritt-Protokoll mit hilfreichen Tipps bieten wir einen umfassenden Überblick über Gewebekulturen tagged Marker-Proteine, die für das Studium der Muskel-Sehnen-System geeignet sind. Um die vielseitigen Anwendungen des Protokolls zu markieren, zeigen wir Beispiel Filme reichen von der Visualisierung des langfristigen morphogenetischen Veranstaltungen – auf der Zeitskala der Stunden und Tage – Visualisierung von kurzfristigen dynamischen Prozessen wie Muskelzuckungen auftreten auf der Zeitskala von Sekunden auftreten. Zusammen genommen, sollte dieses Protokoll den Leser zu entwerfen und zu leben-Bildgebung Experimente durchführen, für die Untersuchung von Muskeln und Sehnen Morphogenese im intakten Organismus ermöglichen.

Verschiedenen Geweben abgebildeten in Vivo bei der Entwicklung von fliegen Puppen, so dass sie ein ideales Modellsystem Morphogenese der Erwachsenen Organe zu studieren kann. Dazu gehören die indirekten Flugmuskeln, den Brustkorb Epithel einschließlich der Sehnenzellen, das Flügel-Epithel, Abdominal-Muskeln und Herz22,23,24,25,26 , 27. hier, wir konzentrieren uns auf live Bildgebung der Muskel und die Sehne Morphogenese. Für eine detaillierte Beschreibung der indirekte Flüge Muskel- und Bauchmuskel Morphogenese und zusätzliche Methoden für das Studium Muskel Biologie in Drosophilaverweisen wir den Leser auf Weitkunat und Schnorrer 201422.
Leben der indirekten Flugmuskeln imaging
Für das Studium äußerte sich die langfristige Entwicklung der indirekten Flugmuskeln, bestehend aus den Dorsolongitudinal Muskeln (DLMs) und die dorsoventral Muskeln (DVMs), kugelige Moesin Aktin-bindende Domäne getaggt mit GFP (FH -GFP-Gma) in allen Muskeln mit der Myozyten Enhancer Faktor 2 (Mef2)-GAL4-Treiber (Abbildung 2A-D, Film S1). Vor Bildgebung, wurde ein Fenster im pupal Fall über den Brustkorb geöffnet, wie in Abbildung 1Fgezeigt. Auf einem zwei-Photonen-Mikroskop wurden Z-Stapel alle 20 min. für 21 h ab ≈11 h nach Puppenkammer Bildung (11 h APF) erworben. In diesem Zeitrahmen, der DLMs (grün Überlagerungen in Abbildung 2A'-D') zunächst Bindung an die Sehnenzellen (Abbildung 2A) zu initiieren und dann aufgeteilt, während die Muskel-Anlagen (Abb. 2 b) Reifen. Als nächstes verkürzen die Myotubes (Abbildung 2), bis sie schließlich die maximal verdichtete Stufe 30 h APF (Abb. 2D) erreichen. Zusammengenommen, zeigt dieser Film die dramatischen Veränderungen im Muskel Morphologie, die in dem Zeitraum von Stunden auftreten.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig2.jpg"> Abbildung 2: Live-Bildgebung der indirekte Flüge Muskel und die Sehne Morphogenese. (A-D) Zeitpunkten aus einem zwei-Photonen-Film (Movie S1) mit Mef2-GAL4, UAS- GFP-Gma als Marker für Actin in der indirekten Flugmuskeln, bestehend aus den Dorsolongitudinal Muskeln (DLMs, Grün in A markiert "-D") und die dorsoventral Muskeln ( DVMs, hervorgehoben in blau in A'-D'). Maßstabsleisten sind 100 µm. (E-H) Zeitpunkten aus einem zwei-Photonen-Film (Movie S2) mit Duf-GAL4UAS-CD8-GFP als Marker für indirekten Flugmuskeln und den Brustkorb Epithel einschließlich Sehnenzellen. Paneele E'-H' zeigen einer Überlagerung mit einem Modell der Muskel-Sehnen-System zu jedem Zeitpunkt, Hervorhebung der lange zellulären Erweiterungen durch die Sehne Epithel (Magenta) in Kontakt mit den Muskeln (grün) gebildet. Maßstabsleisten sind 100 µm (geschätzt von der Größe des abgebildeten Strukturen). (I-L) Zeitpunkten Sie aus einem Zweifarben-drehenden Scheibe konfokale Film (Movie S3) mit Schwerpunkt auf Muskel-Sehnen-Anlage-Einleitung. Die Sehnenzellen werden beschriftet mit sr-GAL4UAS-Palm-mCherry (Magenta) und indirekte Dorsolongitudinal Flug Muskeln mit Mhc -Tau-GLP (grün). Maßstabsleisten sind 10 µm. Zeit wird angegeben als HH: mm nach Puppenkammer Bildung (APF). Beachten Sie, dass nicht alle Filme wurden auf einer Bühne temperaturgeführte erworben, daher Entwicklungsstörungen Timing kann abweichen. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Für die Untersuchung von Sehnen und Muskeln Morphogenese zur gleichen Zeit, Membrane-springen GFP (FH -CD8-GFP) drückte mit Dumbfounded (Duf)-GAL4 als Fahrer, die sowohl in der Sehnenzellen und die indirekten Flugmuskeln (Abbildung 2E zum Ausdruck kommt -H, Film-S2). Ein Z-Stack wurde alle 20 Minuten ab 16 Uhr APF für 20 h auf einem zwei-Photonen-Mikroskop genommen. Während der Myotubes kompakt (grüne Overlay in Abbildung 2E'-H'), die Sehne Zellen Form lange zellulären Erweiterungen, die mit der Zeit zu verlängern (Magenta Overlay in Abbildung 2E"-H"). Zusammen genommen, zeigt dieser Film das enge Zusammenspiel zwischen den Sehnen und Muskel Zellen in Vivo.
Um Muskel-Sehnen-Interaktion näher zu untersuchen, wurde zweifarbig, hoher Vergrößerung Bildgebung durchgeführt. Puppen mit Myosin heavy Chain (Mhc)-Tau-GFP im DLMs und FH -Palmitoylated-mCherry (FH -Palm-mCherry) angetrieben von Streifen (sr)-GAL4 in den Sehnen wurden alle 5 min. ab 12 Uhr APF für 4,5 h auf einer drehenden Scheibe abgebildet confocal Mikroskop (Abb. 2I-L, Film S3). Um 12 Uhr APF migrieren, die Myotubes in Richtung ihrer Sehne-Ziel-Zellen und bilden lange Filopodien an ihren Enden (Abb. 2I). Anschließend den Muskel und die Sehne Gewebe interdigitate (Abbildung 2J, K), eine stabile Befestigung zu bilden. Im Laufe der Zeit die Anlage glättet weniger Filopodien Form und die Muskel-Sehnen-Schnittstelle (Abbildung 2 L). So kann Zweifarben-, hoch-Vergrößerung Bildgebung verwendet werden, um zelluläre Dynamik im Detail im lebenden Organismus zu offenbaren.
Live-imaging der Bauchmuskeln
Für live Aufnahmen von der Bauchmuskulatur (Abbildung 3Film S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP diente als Marker und ein Fenster über dem Zwerchfell im pupal Fall als detaillierte in Abbildung 1. Ähnlich wie bei der indirekten Flug Muskel Film dargestellt in Abbildung 2A-D, die Bildung und das Wachstum der Bauchmuskeln können über viele Stunden der Entwicklung (55 Std. im Film S4) verfolgt werden. Während dieser Zeit verschmelzen die Myoblasten Form wächst Myotubes (Abb. 3A). Myotube Tipps zu ihren Zielen der Sehne zu migrieren, und nach dem Anfügen an der Sehnenzellen, die kontraktilen Einheiten der Muskeln, den Sarkomeren gebildet werden (Abb. 3 b-D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig3.jpg"> Abbildung 3: Live-Bildgebung der Bauchmuskel Morphogenese. (A-D) Zeitpunkten aus einem Film (Movie S4) mit Mef2-GAL4UAS-CD8-GFP als Marker Bauchmuskel Morphogenese folgen. Seitenteile A'-E' zeigen Überlagerungen mit Modellen der Bauchmuskel Fahrgast-/ (grün), die de Novo während das Puppenstadium bildet. Maßstabsleisten sind 100 µm. Zeit als HH: mm APF gekennzeichnet ist. Der Film wurde bei Raumtemperatur erworben. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Live-imaging von zuckenden Muskeln
Im Gegensatz zu Abbildung 2 und Abbildung 3 Abbildung 4 zeigt Muskel Dynamik in dem Zeitraum von Sekunden auftreten: die live-Aufnahme von Muskelkontraktionen. Puppen mit dem Ausdruck βPS-Integrin-GFP unter endogene Kontrolle wurden abgebildet, mit einer zeitlichen Auflösung von 0,65 s in einer Z-Ebene auf einem confocal Mikroskop (Film S5). Im Beispiel in Abbildung 4dargestellt wurden die Anlage Stätten der drei DVMs (Abb. 4A) für 10 min ab 42 h APF abgebildet. Während dieser Zeit wurden fünf zucken Ereignisse beobachtet (Abbildung 4 b-F), zeigt, dass die Sarkomeren bereits gut genug montiert werden, um koordinierte Kontraktionen zu diesem Zeitpunkt in der Entwicklung zu unterstützen. Daher kann Bildgebung von Muskelzuckungen als eine funktionale Auslesung für Sarcomerogenesis bereits während indirekte Flüge Muskel Entwicklung28, im Gegensatz zu z. B. Flugtests herangezogen werden nur nach Bewegungsapparate durchgeführt werden können.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig4.jpg"> Abbildung 4: Live-Darstellung der Muskeln zucken. (A) zuerst Zeit-Punkt aus einem Film (Movie S5) βPS-Integrin-GFP als Marker zeigt Zucken der dorsoventral indirekten Flugmuskeln 42 h mit APF. In das Sichtfeld sind des Muskels Anlage Stätten der DVM II 2, DVM III 1 und DVM III 2. (B-F) Farbe Überlagerungen von fünf einzelnen Twitch Veranstaltungen jeweils zeigt den Rahmen vor das Zucken (Magenta) und den ersten Frame der Twitch-Veranstaltung (grün). Beachten Sie, dass die einzelnen Muskelfasern unabhängig voneinander zucken. Pfeile markieren die zuckende Bewegung. Die zeitliche Auflösung des Films ist 0,65 S. Maßstabsleisten sind 25 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Live-imaging von endogen tagged Proteine
Ähnlich wie βPS-Integrin-GFP, wurde eine große Sammlung von Fusionsproteinen ausgedrückt in Drosophila endogenen kontrolliert generierten2,3,4. Diese Fliegenschnüre können verwendet werden, zum Beispiel die subzelluläre Lokalisation oder der Expressionsprofile interessierender Proteine zu studieren. Die Kollektion ist besonders hilfreich, wenn spezifische Antikörper nicht verfügbar sind oder Proteindynamik untersuchten in Vivo ohne Fixierung sein müssen. Abbildung 5 zeigt drei Beispiele von endogen ausgedrückten Fusionsproteinen aus der Fliege TransgeneOme (fTRG) Bibliothek, Hu li Tai Shao (Hts)-GLP (Abbildung 5A, B), Talin-GLP (Abbildung 5, D) und βTubulin60D-GLP ( Abbildung 5E, F). Die Expression dieser Proteine kann in allen Geweben untersucht werden, die sie natürlich ausdrücken. Hier zeigen wir den Brustkorb Epithel (Abbildung 5AC, E) und die indirekten Flugmuskeln oder verlinkten Anlage (Abbildung 5 bD, F) als Beispiele.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig5.jpg"> Abbildung 5: Live imaging von endogen Proteine markiert. (A, B) Maximale Projektionen der Z-Stapel von Puppen mit dem Ausdruck Hts-GFP genommen. (C, D) Maximale Projektionen der Z-Stapel von Puppen mit dem Ausdruck Talin-GFP genommen. (E, F) Maximale Projektionen der Z-Stapel von Puppen mit dem Ausdruck βTubulin60D-GFP genommen. Paneele A, C und E zeigen die Thorax-Epithel bei 18, 24 und 18 h APF, bzw., und Platten B, D und F zeigen die indirekten Flugmuskeln oder verlinkten Anlage 30 h APF. Maßstabsleisten sind 25 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Hier präsentieren wir eine einfach zu bedienende und vielseitige Methode ausführen live imaging von Entwicklungsprozessen im allgemeinen und Muskel-Sehnen-Morphogenese insbesondere in lebenden Drosophila Puppen.

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

in-vivo-imaging-of-muscle-tendon-morphogenesis-in-drosophila-pupae

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

11.3K Aufrufe.  Max Planck Institute of Biochemistry. Hier präsentieren wir eine einfach zu bedienende und vielseitige Methode ausführen live imaging von Entwicklungsprozessen im allgemeinen und Muskel-Sehnen-Morphogenese insbesondere in lebenden Drosophila Puppen.

Serie: In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissektion von Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetik

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Biologie

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Bildgebung und Analyse der Gewebeorientierung und Wachstumsdynamik in der Entwicklung drosophila Epithelia während der Pupal-Stadien

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

<meta charset="utf8"></head><body>Erweiterte Live-Bildgebung der Morphogenese der Puppenbein von Drosophila ohne Puparium

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Aufdeckung dynamischer Epithelstrukturen während der Entwicklung von Drosophila

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Zusammenfassung

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Live-Bilder aus dem

Langfristige Live-Imaging von

Dissektion von Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila

Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Bildgebung und Analyse der Gewebeorientierung und Wachstumsdynamik in der Entwicklung drosophila Epithelia während der Pupal-Stadien

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen