Wir danken Martin Zinkernagel, MD, PhD und Miriam Reisenhofer, PhD für ihre wissenschaftlichen Beiträge zur Festsetzung von Modell und Federica Bisignani für ihre hervorragenden technischen Betreuung.

alle Experimente der Anweisung für den Einsatz von Tieren in Ophthalmic und Vision Research Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) eingehalten und beachten Sie die damit verbundenen Vorschriften der staatlichen Behörden.
 1. Tiere <ol><li>pflegen TgBAC (Gfap:gfap-GFP) Zebrafisch 167 (AB) Belastung im Alter von 6-9 Monate unter normalen Bedingungen in Wasser mit einer Temperatur von 26,5 ° C und eine 14/10 h hell/dunkel-Zyklus 18.</li>
	<li>Richtlinien der Tierbetreuung der beteiligten Institutionen für die Tierversuche nach Genehmigung durch die staatlichen Behörden.</li>
</ol> 2. Reversible systemische Narkose <ol><li>Vorbereitung der Stammlösung Ethyl-3-Aminobenzoate-Methanesulfonate-Salz (Tricaine) durch Auflösen von 400 mg Tricaine Pulver in 97,9 mL Wassertank und 2,1 mL 1 M Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS). Passen Sie auf pH 7,0 mit 1 M Tris (pH 9) und Store bei 4 ° C in den dunklen bis zu einem Monat. 
	Hinweis: Tricaine sollten bereit sein, im Wasser wie die natürlichen Lebensbedingungen der Tiere, vorzugsweise original Wassertank verwendet werden sollten.</li>
	<li>Der Stammlösung 01:25 im Tank Wasser zu verdünnen und sofort nutzen.</li>
	<li>Setzen der Zebrabärbling in einer 10 cm Petrischale mit 50 mL Anästhesie-Lösung, bis sie unbeweglich und nicht auf äußere Reize (ca. 2-5 min, je nach Gewicht und Alter reagieren).</li>
	<li>Übertragen jeden Fisch von hand auf eine maßgeschneiderte Silikon Stift Halterung für Laser-Behandlung ( Abb. 1A). 
	VORSICHT! Der Fisch kann außerhalb des Behälters für bis zu 10 min nur betäubt bleiben.</li>
	<li>Um die Narkose nach der Behandlung und/oder Bildgebung umzukehren, legen der Zebrabärbling in Behälter, Tank Wasser.</li>
	<li>Zur Unterstützung der Wiederherstellung erstellen einen Wasserfluss frischen Tank über den Kiemen durch Verschieben der Zebrabärbling hin und her im Wasser.</li>
</ol> 3. Laser-fokalen Verletzungen auf Netzhaut Hinweis: A 532 nm Diodenlaser wird verwendet, um fokale leichte Schäden an der Netzhaut der Zebrafisch erstellen. Der Versuchsaufbau des Lasers ermöglicht die Einrichtung einer reproduzierbaren fokale Netzhaut Verletzung im Erwachsenen Zebrafisch.
<ol><li>Eingerichtet, die Ausgangsleistung des Lasers: 70 mW; Antenne Durchmesser: 50 µm, Impulsdauer: 100 Ms. Vorsicht! Die Verwendung von Laserlicht erfordert geeignete persönliche Schutzausrüstung und Kennzeichnung des Gebiets.</li>
	<li>1-2 Tropfen 2 % Hydroxypropylmethylcellulose topisch in die Augen vor der Behandlung und eine 2,0 mm Fundus Laserlinse verwenden, um den mit dem Ziel, Laser Strahl auf die Netzhaut zu konzentrieren. 
	VORSICHT! Hydroxypropylmethylcellulose Tropfen sind zähflüssig und kann Probleme verursachen, wenn es auf den Kiemen geht atmen.</li>
	<li>Platz vier Laser Spots rund um den Sehnerv auf der linken Seite Auge und verwenden Sie das richtige, unbehandelte Auge als interne Kontrolle.</li>
</ol> 4. In vivo Bildgebung der Netzhaut Morphologie <ol><li>am Tag 0, visualisieren die Zebrafisch Netzhaut direkt nach der Laser-Induktion ohne Wiederbelebung sie aus der Narkose. Zu allen anderen Zeitpunkten beschäftigen Vollnarkose (siehe Abschnitt 2: Reversible systemische Anästhesie). Legen Sie die immobilisierten Zebrafisch auf eine maßgeschneiderte Silikon-Pin-Halter ( Abbildung 1 B, b. 1).</li>
	<li>Um optimale Aufnahmen zu schneiden eine handelsübliche Hydrogel-Kontaktlinse Zebrafisch Auge passen (Ø = 5,2 mm, R = 2,70 mm Mittendicke = 0,4 mm) durch einen Locher. Füllen Sie die konkave Oberfläche der Linse mit Methylcellulose und legen Sie es über die Hornhaut.</li>
	<li>Statten das OCT-System mit einem 78D berührungslose Schlitz Lampe Objektiv.</li>
	<li>Konzentrieren sich die Infrarot (IR) Bild in der IR + OCT-Modus ( Abbildung 2A) zu visualisieren den Fundus des Auges die IR Bilder durch Klicken auf die &#34; erwerben &#34; Taste ( Abb. 2 b) zu lokalisieren die Laser-Flecken auf der Netzhaut, die mit dem System &#39; s Software.</li>
	<li>Visualisieren eine dreidimensionale Abschnitt der Netzhaut Schichten in der IR + OCT-Modus und nehmen Sie die Bilder durch Klicken auf die &#34; erwerben &#34; Taste ( Abb. 2 b). Die Schwere der Verletzungen in der nuklearen Außenschicht (ONL) zu beobachten (siehe Abschnitt 3: Laser-fokalen Verletzungen auf Netzhaut) in diesen Bildern.</li>
	<li>, Betäubung rückgängig zu machen, nachdem die Behandlung und/oder Bildgebung der Zebrabärbling in einem Behälter mit Wassertank platziert.</li>
	<li>Zur Unterstützung der Wiederherstellung erstellen einen Wasserfluss frischen Tank über den Kiemen durch Verschieben der Zebrabärbling hin und her im Wasser.</li>
	<li>Führen Sie ähnlich wie in-Vivo Bildgebung der Netzhaut Morphologie an Tag 1, 3, 7, 14 und Woche 6.</li>
</ol> 5. Hämatoxylin &#38; Eosin (H &#38; E) färben <ol><li>einschläfern Zebrafisch durch Eintauchen in kalt (4 ° C) Anästhesie-Lösung auf Eis für mindestens 10 min und Einatmung die Augen sofort mit Hilfe von kleinen gebogenen Pinzette.</li>
	<li>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C für 20 h die ganze Augen in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixieren und dann pausiert die Proben in einer Reihe von abgestuften Alkohol (Xylol, 100 % für 5 min zweimal, Ethanol 100 % für 5 min zweimal, Ethanol 96 % für 3 min zweimal und Ethanol 70 % 3 mi einmal n). 
	VORSICHT! PFA kann reizend auf die Augen, der Nase und der oberen Atemwege. PFA ist ein bekanntes menschliches Karzinogen und eine vermutete Gefahr für die reproduktive.</li>
	<li>Der Proben in Paraffin eingebettet, geschnitten 5 µm-Abschnitte auf der Ebene des Sehnervenkopfes und klebe sie auf Glasobjektträger.</li>
	<li>Fleck in den deparaffinized Abschnitten mit 0,1 % Säure Hämatoxylin Lösung für 5 min und Tauchen Sie die Folien zweimal in destilliertem Wasser nach dem Eintauchen der Folien in Salzsäure-Mix (2 mL 25 % HCl in 250 mL destilliertes Wasser) und Ammoniak (2 mL 25 % Ammoniak in 250 mL mischen destilliertes Wasser). Fleck in den Abschnitten mit Eosin G wässriger Lösung 0,5 % für 3 min nach der Entwicklung der Hämatoxylin-Färbung von Leitungswasser für mindestens 10 min.</li>
	<li>Montieren Sie dehydrierten Folien in Acrylharz Eindeckmittel und beobachten Sie die Folien unter dem Lichtmikroskop.</li>
</ol> 6. Immunohistochemistry für die Aktivierung von MC <ol><li>die deparaffinized Abschnitte in Antigen Abruf Puffer (Tris-EDTA + 0,05 % nicht-ionische Waschmittel, pH 9,0) für 3 min in eine geeignete Dampfgarer oder Mikrowelle für 10-15 min. erhitzen und waschen dreimal mit TBS für 5 min.</li>
	<li>Kreis in den Abschnitten mit einem Silikon Stift und hinzufügen 100 µL blockiert Lösung (TBS + 10 % normalem Ziegenserum + 1 % Rinderserumalbumin, pH 7.6) bei Raumtemperatur für 1 h.</li>
	<li>Fleck mit Anti-glial fibrillary sauren Protein (GFAP) Kaninchen polyklonalen Antikörper und Anti-Glutamin Synthestase (GS) Maus monoklonaler Antikörper, sowohl in einer Verdünnung von 1: 200 (40 µL pro Probe). Über Nacht inkubieren Sie die Folie in eine feuchte Kammer bei 4 ° C. Waschen dreimal mit TBS + 0,1 % Tween 20 für 5 min.</li>
	<li>Finish Visualisierung mit dem entsprechenden Sekundärantikörper. Dieses Protokoll verwendet eine Ziege Anti-Kaninchen IgG H &#38; L grün Sekundärantikörper für GFAP und eine Ziege Anti-Maus IgG H &#38; L leuchtend rot für GS, sowohl in einer Verdünnung von 1: 500 bei Raumtemperatur für 1 h</li>
	<li>Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel mit DAPI und beobachten Sie die Folien unter dem Fluoreszenzmikroskop.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+age-related+macular+degeneration:+a+review+of+progress+to+date.">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li><li>Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+Pigmentosa:+Genes+and+Disease+Mechanisms.">Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms.</a> Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).</li><li>Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa.+The+Friedenwald+Lecture.">Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).</li><li>Strettoi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Retinal+Remodeling.">A Survey of Retinal Remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).</li><li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa.">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li><li>Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+mutations+in+retinitis+pigmentosa+and+their+clinical+implications.">Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications.</a> Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).</li><li>Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+to+photoreceptor+cell+death+in+inherited+retinal+degenerations.">Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations.</a> BioEssays. 23, 605-618 (2001).</li><li>Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muller+cell+activation,+proliferation+and+migration+following+laser+injury.">Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury.</a> Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).</li><li>Newman, E., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M&#252;ller+cell:+a+functional+element+of+the+retina.">The M&#252;ller cell: a functional element of the retina.</a> Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).</li><li>Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+neurogenesis+in+the+retinal+ciliary+marginal+zone+of+homeothermic+vertebrates.">A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates.</a> Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).</li><li>Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+M&#252;ller+cells+occurs+during+retinal+degeneration+in+RCS+rats.">Activation of M&#252;ller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats.</a> Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).</li><li>DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Regeneration+Following+OCT-Guided+Laser+Injury+in+Zebrafish.">Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).</li><li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+visual+system.">The zebrafish as a model visual system.</a> Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).</li><li>Fausett, B. V., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+alpha1+tubulin-expressing+M&#252;ller+glia+in+regeneration+of+the+injured+zebrafish+retina.">A role for alpha1 tubulin-expressing M&#252;ller glia in regeneration of the injured zebrafish retina.</a> J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).</li><li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+M&#252;ller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish.">Responses of M&#252;ller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li><li>Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+neurogenic+potential+of+M&#252;ller+gial+cells+in+the+vertebrate+retina.">Development and neurogenic potential of M&#252;ller gial cells in the vertebrate retina.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).</li><li>Xia, X., Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+Neurogenic+Potential+of+Mammalian+M&#252;ller+Glia.">Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian M&#252;ller Glia.</a> Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C., N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).</li><li>Riepe, R. E., Norenburg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cell+localisation+of+glutamine+synthetase+in+rat+retina.">M&#252;ller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina.</a> Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).</li><li>Derouiche, A., Rauen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coincidence+of+L-glutamate/L-aspartate+transporter+(GLAST)+and+glutamine+synthetase+(GS)+immunoreactions+in+retinal+glia:+evidence+for+coupling+of+GLAST+and+GS+in+transmitter+clearance.">Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance.</a> J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).</li><li>Bignami, A., Dahl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+radial+glia+of+M&#252;ller+in+the+rat+retina+and+their+response+to+injury.+An+immunofluorescence+study+with+antibodies+to+the+glial+fibrillary+acidic+(GFA)+protein.">The radial glia of M&#252;ller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein.</a> Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).</li><li>Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish.">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).</li><li>Cameron, D. A., Carney, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mosaic+patterns+in+the+native+and+regenerated+inner+retina+of+zebrafish:+implications+for+retinal+assembly.">Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly.</a> J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).</li><li>Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral-domain+optical+coherence+tomography+as+a+noninvasive+method+to+assess+damaged+and+regenerating+adult+zebrafish+retinas.">Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).</li><li>Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+with+OCT+and+histology+of+photocoagulation+lesions+in+patients+and+rabbits.">Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits.</a> Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).</li><li>Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+regeneration+of+photoreceptor+from+M&#252;ller+glia+after+retinal+degeneration+in+adult+rat.">Preferential regeneration of photoreceptor from M&#252;ller glia after retinal degeneration in adult rat.</a> Vision Res. (2), 223-234 (2008).</li><li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish.">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (80), e51017 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Regeneration/Degeneration der Netzhaut in der Zebrabärbling wurde durch verschiedene Ansätze wie Zytotoxin-vermittelte Zelle Tod22, mechanische Verletzungen23und thermische Schädigung24untersucht. Wir beschäftigten 532 nm Diodenlaser die Zebrafisch Netzhaut beschädigen. Unser Modell bietet dabei mehrere Vorteile. Zum Beispiel haben wir schnell einen klar umrissenen Bereich der Verletzung in der äußeren Netzhaut, speziell in der PRs-Schicht lok...

Vision ist wahrscheinlich der wichtigste Sinn des Menschen und seiner Beeinträchtigung hat eine hohe sozio-ökonomische Auswirkungen. In der industrialisierten Welt entfallen degenerative Netzhauterkrankungen die Mehrheit der Sehbehinderung und Blindheit bei der erwachsenen Bevölkerung1. Retinitis Pigmentosa (RP) ist die häufigste erbliche Ursache für Erblindung bei Menschen im Alter zwischen 20 und 60, Auswirkungen auf etwa 1,5 Millionen Menschen weltweit2,3. Es ist eine heterogene Familie von retinalen Erbkrankheiten durch fortschreitenden Verlust der Photorezeptoren (PRs), gefolgt von Degeneration des retinalen Pigmentepithels und anschließend Gliosis und Umbau des inneren Neuronen4gekennzeichnet. Der Krankheitsverlauf lässt sich erklären durch den inkrementellen Verlust der PR zwei Zelltypen, Stangen, die sind verantwortlich für achromatische Vision im Dämmerlicht und Zapfen, die für Color Vision und Sehschärfe5sind in der Regel ab. Ein einzelnes Gendefekt reicht für RP. Bisher wurden mehr als 130 Mutationen in mehr als 45 Genen verbunden mit der Krankheit-6. Dies führt zu unterschiedlichen Phänotypen der Krankheit und ist einer der Gründe, die Gentherapie nicht verallgemeinerbare ist und somit eine komplexe therapeutische Ansatz. Daher ist dringend erforderlich, neue allgemeine Therapieansätze zur Behandlung von retinaler Degenerationen in blendenden Krankheiten zu entwickeln.
Netzhautdegeneration oft schließt PR Verlust; Daher ist PR Zelltod ein Markenzeichen für die degenerativen Prozesse in der Netzhaut-7. Es wurde bereits nachgewiesen, dass PR Zelltod Müller Glia Zelle (MC) Aktivierung und Proliferation8stimuliert. MCs, großen glialen Zelltyp in der vertebrate Retina galten einmal als nichts anderes als ein "Klebstoff" zwischen Netzhaut Neuronen. In den letzten Jahren haben viele Studien gezeigt, dass MCs zu handeln, als mehr als bloße strukturelle9unterstützen. Unter den verschiedenen Funktionen MCs beteiligen sich auch an Neurogenese und10zu reparieren. In der Tat, in Reaktion auf diffusiblem Faktoren von der degenerierenden Netzhaut, MCs deutlich erhöhen glial fibrillary sauer (GFAP) Proteinexpression. Daher kann als Marker für MC Aktivierung als sekundäre Reaktion auf Netzhaut Verletzung und Degeneration11GFAP Kennzeichnung verwendet werden.
Vor kurzem haben wir eine neuartige Anpassung der fokalen Verletzungen mit Hilfe eines Lasers induzieren Netzhautdegeneration im Zebrafisch (Danio Rerio) entwickelt. Fokalen Verletzung ist vorteilhaft für das Studium bestimmte biologische Prozesse wie die Wanderung von Zellen auf der verletzten Seite und der genaue Zeitpunkt der Ereignisse, die während der Netzhaut Regeneration12stattfinden. Darüber hinaus ist der Zebrabärbling aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen seine visuellen System und dem von anderen Wirbeltieren in visuelle Forschung wichtig geworden. Grobe morphologischen und histologischen Merkmale des menschlichen und teleost Netzhaut zeigen einige Unterschiede. Dementsprechend enthalten Mensch und Zebrafisch Netzhaut die gleichen großen Zelle Klassen organisiert in dem gleichen geschichteten Muster, wo lichtempfindlichen Photorezeptoren die äußerste Schicht, besetzen, während die Netzhaut Projektion Neuronen, die Ganglienzellen im Innersten wohnen neuronalen Ebene, proximal an der Linse. Die Netzhaut Interneuronen, die amakrinen, bipolar, und horizontalen Zellen zwischen den Photorezeptoren und Ganglienzellen Zelle Schichten13zu lokalisieren. Darüber hinaus ist die Zebrafisch Netzhaut Kegel beherrscht und daher näher an der menschlichen Netzhaut als zum Beispiel intensiv studierte Nagetier Netzhaut. Ein faszinierende Unterschied zwischen teleost und Säugetiere ist die anhaltende Neurogenese in Fisch Netzhaut und Netzhaut Regeneration nach Schaden. Im Zebrafisch können MCs Gewebestammzelle und Regeneration im geschädigte Netzhaut14,15vermitteln. Bei Hühnern haben MCs einige Fähigkeit auch, geben Sie den Zellzyklus und Gewebestammzelle. Nach Netzhaut Verletzung bei Erwachsenen Fischen MCs übernehmen bestimmte Merkmale der Stammvater und Stammzellen, migrieren, die beschädigte Netzhautgewebe und produzieren neue Neuronen16. Gen Expression profiling von Säugetieren MCs offenbart unerwartete Ähnlichkeiten mit retinalen Stammväter, und Beweise für die innewohnende Potenzial neurogenen MCs im Huhn, Nager und auch die menschliche Netzhaut wächst17. Dennoch, warum die regenerative Antwort in Vögel und Säugetiere niedriger, verglichen mit der starke Reaktion in Fisch ist noch nicht geklärt. Daher kann die körpereigene Reparaturmechanismen im Zebrafisch Verständnis Strategien für anregende retinalen Regeneration bei Säugetieren und beim Menschen vorschlagen. Einsatz der körpereigene Reparaturmechanismus der MCs als therapeutisches Werkzeug für die Behandlung von Patienten mit Netzhautdegeneration hervorragend für unsere Gesellschaft auswirken würde.
Hier bieten wir Ihnen die notwendigen Schritte zur Degeneration/Regeneration Modell in Augenheilkunde beschäftigen. Wir konzentrierte sich zunächst auf Induktion fokalen Schäden in der neurosensorischen Netzhaut, dann auf die Darstellung der Ereignisse am Verletzung Aufstellungsort und schließlich visualisieren Beteiligung der benachbarten MCs entwickeln. Das allgemeine Protokoll ist relativ einfach durchzuführen und öffnet eine Vielzahl von Möglichkeiten für die Bewertung der Netzhaut danach.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>2852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>A07030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen</td>
			<td>Dako, Glostrup, Danmark</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI mounting medium</td>
			<td>Vector Labs, Burlingame, CA, USA</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin G aqueous solution 0.5%</td>
			<td>Carl Roth, Arlesheim, Switzerland</td>
			<td>X883.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG H&#38;L Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td>Life Technologies, Zug, Switzerland</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG H&#38;L Alexa Fluor&#174; 594</td>
			<td>Life Technologies, Zug, Switzerland</td>
			<td>A11020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat normal serum</td>
			<td>Dako, Glostrup, Danmark</td>
			<td>X0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel contact lens</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson AG, Zug, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>1-Day Acuvue Moist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxypropylmethylcellulose 2%</td>
			<td>OmniVision, Neuhausen, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Methocel 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>A5040</td>
			<td>Tricaine, MS-222</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visulas 532s</td>
			<td>Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>532 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GS monoclonal antibody</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>MAB302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRA + OCT Imaging System</td>
			<td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Spectralis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg Eye Explorer</td>
			<td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Version 1.9.10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>P5368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>P5368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody</td>
			<td>Invitrogen, Waltham, MA, USA</td>
			<td>180063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone pin holder</td>
			<td>Huco Vision AG Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slit lamp BM900</td>
			<td>Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slit lamp adapter</td>
			<td>Iridex Corp., Mountain View, CA, USA</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus glass slides</td>
			<td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain</td>
			<td>KIT, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>15204</td>
			<td>http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline (TBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>P5912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>78D non-contact slit lamp lens</td>
			<td>Volk Optical, Mentor, OH, USA</td>
			<td>V78C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular fundus laser lens</td>
			<td>Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA</td>
			<td>OFA2-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Retriever</td>
			<td>Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom</td>
			<td>R2100-EU</td>
			<td>Steamer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

m&#252;ller glia cell activation in a laser-induced retinal degeneration and regeneration model in zebrafish

Ein faszinierende Unterschied zwischen teleost und Säugetiere ist das lebenslange Potenzial der teleost Netzhaut Netzhaut Neurogenese und Regeneration nach schweren Schäden. Die Regeneration Wege im Zebrafisch untersucht könnte neue Einblicke in innovative Strategien für die Behandlung von degenerativen Erkrankungen der Netzhaut bei Säugetieren bringen. Hierin, konzentrierten wir uns auf die Induktion einer fokalen Läsion an der äußeren Netzhaut in Erwachsenen Zebrafisch mittels einem 532 nm Diodenlaser. Eine lokalisierte Verletzung ermöglicht die Untersuchung biologischer Prozesse, die während retinalen Degeneration und Regeneration direkt auf dem Gelände des Schadens stattfinden. Verwendung von nicht-invasiven optischen Kohärenztomografie (OCT), konnten wir die Position der beschädigte Bereich und Monitor anschließende Regeneration definieren in-vivo. In der Tat produziert OCT-Bildgebung Cross-sectional hochauflösende Bilder der Zebrafisch Netzhaut, Bereitstellung von Informationen, die zuvor nur mit histologischen Analysen verfügbar war. Um die Daten in Echtzeit OCT bestätigen, histologische Abschnitte wurden durchgeführt und regenerative Reaktion nach der Induktion der Netzhaut Verletzung wurde von Immunohistochemistry untersucht.

Echtzeit-OCT: ein Laser Verletzungen Modell induzieren eine gut abgegrenzte Zone von Schäden in der Netzhaut Zebrafisch verwendet, um die Analyse der Rolle der MCs in retinalen Reparatur. Die Website des Schadens wurde mittels in Vivo OCT zum ersten Mal (Tag 0) innerhalb von 60 Minuten nach der Verletzung (Abbildung 3) abgebildet. Um die Optik des Auges Fisch zu kompensieren, wurde eine maßgeschneiderte Kontaktlinse auf die Hornhau...

Watch this Scientific Journal Video about MÃƒÂ¼ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish at JoVE.com

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Der Zebrabärbling ist eine beliebte Tiermodell, Mechanismen der retinalen Degeneration/Regeneration bei Wirbeltieren zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um lokalisierte Verletzung die äußeren Netzhaut mit minimaler Beschädigung der inneren Retina stören zu induzieren. Anschließend überwachen wir in Vivo die Netzhaut Morphologie und der Müller Gliazellen Antwort in der gesamten Netzhaut Regeneration.

Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

mller-glia-cell-activation-laser-induced-retinal-degeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K Aufrufe.  University of Bern. Der Zebrabärbling ist eine beliebte Tiermodell, Mechanismen der retinalen Degeneration/Regeneration bei Wirbeltieren zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um lokalisierte Verletzung die äußeren Netzhaut mit minimaler Beschädigung der inneren Retina stören zu induzieren. Anschließend überwachen wir in Vivo die Netzhaut Morphologie und der Müller Gliazellen Antwort in der gesamten Netzhaut Regeneration.

Serie: Müller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Larval zebrafish are emerging as a model for describing the development and function of simple neural circuits. Due to their external fertilization, rapid development, and translucency, zebrafish are particularly well suited for optogenetic approaches to investigate neural circuit function. In this approach, light-sensitive ion channels are expressed in specific neurons, enabling the experimenter to activate or inhibit them at will and thus assess their contribution to specific behaviors. Applying these methods in larval zebrafish is conceptually simple but requires the optimization of technical details. Here we demonstrate a procedure for expressing a channelrhodopsin variant in larval zebrafish somatosensory neurons, photo-activating single cells, and recording the resulting behaviors. By introducing a few modifications to previously established methods, this approach could be used to elicit behavioral responses from single neurons activated up to at least 4 days post-fertilization (dpf). Specifically, we created a transgene using a somatosensory neuron enhancer, CREST3, to drive the expression of the tagged channelrhodopsin variant, ChEF-tdTomato. Injecting this transgene into 1-cell stage embryos results in mosaic expression in somatosensory neurons, which can be imaged with confocal microscopy. Illuminating identified cells in these animals with light from a 473 nm DPSS laser, guided through a fiber optic cable, elicits behaviors that can be recorded with a high-speed video camera and analyzed quantitatively. This technique could be adapted to study behaviors elicited by activating any zebrafish neuron. Combining this approach with genetic or pharmacological perturbations will be a powerful way to investigate circuit formation and function.

Optogenetic techniques have made it possible to study the contribution of specific neurons to behavior. We describe a method in larval zebrafish for activating single somatosensory neurons expressing a channelrhodopsin variant (ChEF) with a diode-pumped solid state (DPSS) laser and recording the elicited behaviors with a high-speed video camera.

Optogenetische Aktivierung der Zebrafisch Somatosensory Neuronen mit Chef-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, photoreceptor degeneration triggers M&#252;ller glial cells to re-enter the cell cycle and produce transient-amplifying progenitors. These progenitors continue to proliferate as they migrate to the damaged area, where they ultimately give rise to new photoreceptors. Currently, there are two widely-used LIRD paradigms, each of which results in varying degrees of photoreceptor loss and corresponding differences in the regeneration response. As more genetic and pharmacological tools are available to test the role of individual genes of interest during regeneration, there is a need to develop a robust LIRD paradigm. Here we describe a LIRD protocol that results in widespread and consistent loss of both rod and cone photoreceptors in which we have combined the use of two previously established LIRD techniques. Furthermore, this protocol can be extended for use in pigmented animals, which eliminates the need to maintain transgenic lines of interest on the albino background for LIRD studies.

Multiple light damage protocols have been described to damage photoreceptors and consequently induce a retinal regeneration response in adult zebrafish. This protocol describes an improved method that can be used in pigmented animals and that damages the vast majority of rod and cone photoreceptors across the entire retina.

A Novel leichte Schäden Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafisch

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

In Vivo Multimodale Bildgebung und Analyse der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation Mausmodell

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection is considered a useful and reproducible model. Compared with other optic nerve injury models used commonly for assessing secondary degeneration, e.g. complete optic nerve transection and optic nerve crush models, the partial optic nerve transection model is superior as it distinguishes primary from secondary degeneration in situ. Therefore, it serves as an excellent tool for evaluating secondary degeneration. This study describes a novel operative approach of partial optic nerve transection by directly accessing the area of the retrobulbar optic nerve through the orbital lateral wall of the eyeball. Moreover, we present a newly designed, low cost surgical instrument to assist with transection. As demonstrated by the representative results in distinguishing the boundary of primary and secondary injury areas, the new approach and instrument ensures high efficiency and stability of the model by providing adequate space for surgical operation. This in turn makes it easy to separate the meningeal sheath and ophthalmic vessels from the optic nerve before transection. An additional benefit is that this space-saving operative approach improves the investigators&#39; ability to administer drugs, carriers, or selective RGC tracers to the stump of the partially transected optic nerve, allowing the exploration of mechanisms behind secondary injury in RGCs, in a new way.

Secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. This study describes an innovative operative approach for partial optic nerve transection. The use of this space-saving operative approach extends the model's application range, and allows exploration of secondary injury mechanisms in RGCs in a new way.

Partielle Sehnerv Durchtrennung bei Ratten: ein Modell gegründet mit einem neuen operativen Ansatz zur sekundären Degeneration der retinalen Ganglienzellen bewerten

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent infarction size and location, precipitation of platelet:fibrin intermixed blood clots similar to those in patients, and an adequate sensitivity to fibrinolytic treatment. The rose bengal (RB) dye-based photothrombotic stroke model meets the first two requirements but is highly refractory to tPA-mediated lytic treatment, presumably due to its platelet-rich, but fibrin-poor clot composition. We reason that combination of RB dye (50 mg/kg) and a sub-thrombotic dose of thrombin (80 U/kg) for photoactivation aimed at the proximal branch of middle cerebral artery (MCA) may produce fibrin-enriched and tPA-sensitive clots. Indeed, the thrombin and RB (T+RB)-combined photothrombosis model triggered mixed platelet:fibrin blood clots, as shown by immunostaining and immunoblots, and maintained consistent infarct sizes and locations plus low mortality. Moreover, intravenous injection of tPA (Alteplase, 10 mg/kg) within 2 h post-photoactivation significantly decreased the infarct size in T+RB photothrombosis. Thus, the thrombin-enhanced photothrombotic stroke model may be a useful experimental model to test novel thrombolytic therapies.

Traditional photothrombotic stroke (PTS) models mainly induce dense platelet aggregates of a high resistance to tissue plasminogen activator (tPA)-lytic treatment. Here a modified murine PTS model is introduced by co-injecting thrombin and photosensitive dye for photoactivation. The thrombin-enhanced PTS model produces mixed platelet:fibrin clots and is highly sensitive to tPA-thrombolysis.