Unser Protokoll kann verwendet werden, um räumliche und zeitliche dynamische Ereignisse während der Mitose zu bestimmen, und kann auch verwendet werden, um die Auswirkungen von mytotischen Reglern in Echtzeit zu visualisieren. Die Verwendung von Dual Color Imaging ermöglicht eine gleichzeitige Analyse von zwei molekularen Markern. Zum Beispiel können wir die Mikrotubuli der mytotischen Spindel und die kinetische Kernstruktur replizierter Chromosomen visualisieren.
Um die fluoreszierende Proteinexpression zu induzieren, setzen sie vier Tage nach der Behandlung von RNA-Interferenz induzierbare metallo-thyanin-promotorizierte Zellen für 24 bis 36 Stunden einer Endkonzentration von 500 mikromolarem Kupfersulfat aus. Um die fluoreszierenden Protein-exzierenden Zellen für die Bildgebung vorzubereiten, übertragen Sie die Zellen in eine sterile 15-Milliliter-Röhre und sedimentieren Sie die Zellen nach dem Zählen durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in frischer, 25 Grad Celsius erwärmter SIM, ergänzt mit 10%FBS, bei zwei Mal 10 bis zu den 6 Zellen pro Milliliter Konzentration wieder auf und behandeln Sie die Zellen mit zusätzlichem 500 Mikromolar-Kupfersulfat.
Dann fügen Sie 200 bis 500 Mikroliter Zellen in einen Brunnen einer Multi-Well-Live-Zellkammer, und legen Sie die Kammer auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop-Stadium. Während sich die Zellen in der Kammer niederlassen, öffnen Sie die Live-Zell-Bildgebungssoftware und klicken Sie auf neu und experimentieren Sie. Um eine Zeitrafferschleife einzufügen, über die die Bilder aufgenommen werden, klicken Sie auf das Zeitrafferschleifensymbol.
Legen Sie das Intervall auf Sekunden fest, und teilen Sie die gewünschte Gesamtversuchslänge in Sekunden durch das Intervall, um die Anzahl der Zyklen festzulegen. Lassen Sie die Schleife über den gewünschten Gesamtzeitraum wiederholen. Um eine Infrarotfokusprüfung einzufügen, um den Fokus des Ziels beizubehalten, klicken Sie auf das XY-Symbol verschieben, und wählen Sie Z-Drift-Kompensation aus, um einen Z-Drift-Kompensationsschritt innerhalb der Zeitrafferschleifenschicht hinzuzufügen.
Um die Erfassung eines Mehrkanalbilds zu ermöglichen, klicken Sie auf das Symbol für die Mehrkanalgruppe, um einen Gruppen-Layer mit mehreren Kanälen hinzuzufügen, und klicken Sie auf das Symbol "Z-Stack-Schleife hinzufügen", um einen Z-Stack-Loop-Layer hinzuzufügen. Legen Sie dann die gewünschte Schrittgröße und Anzahl der Slices fest, und stellen Sie die Belichtung jedes Kanals auf so niedrig wie möglich ein, um die Fotobleiche zu minimieren. Um eine Zellteilung abzubilden, wählen Sie ein 40- oder 60-mal Öl-Eintauchen-Objektiv und den mCherry-Blütenkanal aus, und richten Sie das Objektiv entlang der Ober- oder Unterseite des Brunnens aus.
Dann bewegen Sie sich vom vertikalen Brunnenteiler weg, um Interferenzen mit dem Z-Drift-Kompensationsschritt zu vermeiden. Suchen Sie eine Zelle oder Zellen in der späten G2- oder frühen M-Phase, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Liveansicht", um mit der Anzeige von Zellen im Softwarebildschirm zu beginnen. Die Suche nach geeigneten Zellen am Übergang G2 nach M ist der Schlüssel zur Abbildung einer Zellteilung.
Suchen Sie eine Zelle mit einem intakten Kern und genau zwei Zentrosomen für beste Ergebnisse. Konzentrieren Sie sich mit dem Feinfokusknopf des Mikroskops auf die von Interesse interessierten Zellen und klicken Sie auf Offset, um die Infrarotfokusprüfung einzustellen. Klicken Sie auf Start, um das Zeitraffer-Bildgebungsprogramm zu initiieren, und wählen Sie den gewünschten Kanal aus, und passen Sie die mittleren Pixelintensitäten an, um die Histogramme bei Bedarf anzupassen, um die gefährdeten Zellen klar zu visualisieren.
Überprüfen Sie die Zellen nach 15 bis 20 Minuten, um zu bestätigen, dass der Nukleare-Hüllkurven-Zusammenbruch eingetreten ist, wie durch das Verschwinden des runden, dunklen bruchenden Flecks in der Nähe des Zellzentrums bestimmt wird. Überprüfen Sie nach weiteren 15 bis 20 Minuten, ob ein Anaphase-Beginn aufgetreten ist. Beenden Sie dann das Programm und speichern Sie die Datei.
Um den Kernhüllenausfall auf den Anaphasenbeginn zu bestimmen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Frame-up", um den Zeitpunkt des Zusammenbruchs der Kernhülle und den Zeitpunkt der anfänglichen Chromosomentrennung in Minuten zu bestimmen, und subtrahieren Sie die Ausfallzeit von der Anfangszeit, um den Kernhüllenausfall auf die Anaphase-Beginnzeit für eine bestimmte Zelle zu erhalten. Fahren Sie dann mit dem Scannen nach vorteilenden Zellen fort, um mehrere Enden für eine bestimmte Bedingung für bis zu 12 Stunden ab der ersten Setzung zu erhalten. Zellen, die sich teilen wollen, können durch das Vorhandensein von zwei Zentrosomen und einem intakten Kern ins Visier genommen werden, wie durch gebrochenes Licht und einen dunkleren Fleck innerhalb der Zelle angezeigt wird, wenn sie im Alpha-Tubulin-Kanal betrachtet werden.
Der Kernhüllenabbau kann durch das Verschwinden dieses dunklen Flecks visualisiert werden, was zu einer gleichmäßigen Färbung des Zytoplasmas führt. Nach dem Zusammenbruch der Kernhülle kann die Zeit, die jede Zelle benötigt, um die Spindel zu bilden und die Chromosomen zu trennen und zu trennen, gemessen werden, indem die Zeitpunkte dieser Ereignisse im Verhältnis zum Kernhüllenabbau notiert werden. Die Behandlung mit doppelsträngiger RNA, die gegen Shortstop, ein Actin-Mikrotubuli-Vernetzungsprotein, das im Verdacht steht, die Zellzyklusdynamik zu beeinflussen, führt zu einer signifikanten mytotischen Verzögerung.
Diese Behandlung führt zu einer erheblichen Verzögerung, wobei viele Zellen in der Metaphase verhaften und während des gesamten zwei- bis dreistündigen Bildgebungsexperiments nie in eine Anaphase übergehen. Die Ko-Behandlung mit doppelsträngiger RNA gegen Schuss und grobe sekharte Sendezeit, ein wichtiger Bestandteil dieses Checkpoints, führt zu einer Unterdrückung des Verhaftungsphänotyps, was zu einem Zusammenbruch der nuklearen Hülle in Anaphasenzeiten führt, die kontrollierten, unbehandelten Zellen ähneln. Achten Sie darauf, die entsprechenden Zellen auszuwählen, und verschwenden Sie keine Zeit mit der Bildgebung von Zellen, die nicht mit der Teilung beginnen.
Wenn eine Zelle nicht innerhalb von 20 Minuten zu teilen beginnt, suchen Sie eine andere Zelle. Forscher können dieses Verfahren befolgen, um neue mytotische Regulatoren oder möglicherweise neuartige trockene Verbindungen zu identifizieren, die bestimmte Ereignisse in der Zellteilung beeinflussen.
