Die Autoren erkennen die Unterstützung des australischen Gesundheits- und Medical Research Council (Projekt Grant 1012409 verbunden mit BHC).

Dieses Protokoll wurde von der South Eastern Sydney menschliche Forschungsethikkommission genehmigt und von der University of New South.Wales menschliche Forschungsethikkommission ratifiziert. Nabelschnurblut aus gesunden Spendern gewonnen wurde durch die Sydney Nabelschnurblutbank (Sydney, New South Wales, Australien) zur Verfügung gestellt. Volumen von ca. 100 mL wurden für dieses Verfahren verwendet.
Hinweis: In einer Klasse II Biosicherheit Schrank mit aseptischen Technik arbeiten. Das äußere des Kabel-Blutbeutel mit 70 % Ethanol zu dekontaminieren. Sterile Instrumente (Schere, Pinzette) für dieses Verfahren zu verwenden.
1. Schnur Blutkörperchen Vorbereitung und Isolierung von CD34 Zellen+
<ol>
	<li>Bereiten Sie sterile Trennung Puffer (SB) mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), bei pH 7,2 und mit 0,5 % bovine Serum Albumin und 2 mM EDTA.</li>
	<li>10 mL SB in ein 50 mL konische Röhrchen (eine Röhre pro 10 mL Blut ist erforderlich) zu verzichten. Mit Hilfe einer G18 stumpfen Nadel montiert auf einer 10 mL Spritze, 10 mL Blut aus der Tasche ziehen und in der 50 mL Röhrchen mit 10 mL SB zu verzichten.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 15 mL Lymphozyten Trennung Medien (siehe Tabelle der Materialien) an der Unterseite des Rohres, enthält das verdünnte Blut, zwei Schichten. Hinweis: Verzichten Sie Medien langsam an der Unterseite des Rohres zu vermeiden, mischen die verschiedenen Schichten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Rohre bei 1.200 × g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) mit keinen Bruch und keine Beschleunigung.</li>
	<li>Übertragen Sie die Schicht nahe der Mitte des Rohres mit mononukleären Zellen (ca. 5-10 mL aus jeder Tube) in eine neue 50 mL-Tube mit einer Pasteurpipette. Jedes Rohr auf ein Gesamtvolumen von 50 mL SB hinzufügen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 10 min bei RT. verwerfen des Überstands.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zelle Pellets sorgfältig mit einer Pasteurpipette in 5-10 mL GBL kombinieren die suspendierten Zellen und bringen Sie Volumen 50 mL mit SB.</li>
	<li>Anzahl Zellen verwenden Trypan blau Färbung und eine Hemocytometer oder automatisierte Zelle entgegen (siehe Tabelle der Materialien). Den Anteil der CD34 bestimmen Zellen+ in der Probe, Aufschwemmen 2,5 × 105 Zellen in 100 µL der SB und Fleck durch Zugabe von 10 µL Anti-CD34-PE Antikörper für 15-30 min bei 4 ° C. Analysieren von Durchflusszytometrie (Abbildung 1A).</li>
	<li>Zentrifuge Rohre bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie überstand. Hinweis: Wenn Sie nicht sofort benötigt, können Mononukleäre Zellen zu diesem Zeitpunkt eingefroren werden.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 300 µL der SB pro 108 Zellen. Hinzufügen von 100 µL der FcR menschliche IgG (blocking Reagenz, siehe Tabelle of Materials) und 100 µL CD34 magnetische Beads pro 108 Zellen. Vorsichtig mischen und bei 4 ° C für 30-40 min inkubieren. Hinweis: Eine einzelne Zelle Suspension ist erforderlich (wenn notwendig, übergeben den Zellen aber 30 µm Filter vor der Zugabe von Reagenzien). Verwenden Sie die Reagenz Bände hier beschrieben für 108 Zellen oder weniger. Für mehr als 108 Zellen, die Reagenzien (SB, blockiert Lösung und CD34 magnetische Beads) werden entsprechend skaliert.</li>
	<li>Bereiten Sie LS-Trennsäule während der Inkubationszeit, indem man die LS-Spalte in einem Magnethalter und waschen mit 3 mL GBL verwerfen das Abwasser. Hinweis: LS Trennsäulen können mit bis zu 2 × 108 total Zellen geladen werden. Kleinere und größere Spalten stehen zur Verfügung.</li>
	<li>Die Zelle Mischung 5-10 mL SB hinzu und Zentrifuge bei 400 × g für 10 min. Überstands verwerfen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 1,5 mL SB und laden Sie die Zellsuspension (1,5 mL) auf die LS-Säule. Sammeln Sie die Strömung durch die unbeschriftete Zellen in einem 15 mL Sammelrohr (negative Bruch #1). Lassen Sie die Flüssigkeit abtropfen und waschen Sie die Spalte mit 1,5 mL SB.</li>
	<li>Die gesammelten Lastfluss durch (3 mL) wieder in die Spalte und die Durchströmung in dem gleichen 15 mL Sammelrohr (negative Bruch #1) sammeln. Waschen Sie die LS-Spalte 3 Mal mit 3 mL SB. Hinweis: Bei Bedarf Zellen in den negativen Anteil (12 mL) können auch gebeizt mit Anti-CD34-Antikörper zu prüfen, Erfassung von CD34+ Zellen, die Spalte "LS".</li>
	<li>Entfernen Sie Spalte aus der Magnetabscheider und leeren Sie Zellen mit einem Spritzenkolben langsam in ein neues 15 mL Röhrchen mit 2 mL SB.</li>
	<li>Setzen Sie Spalte wieder auf Magnetabscheider und laden die 2 mL der Zellen in der Spalte. Die Durchströmung zu sammeln und mit 2 mL SB waschen. Dies ist der negative Teil #2 (4 mL).</li>
	<li>Magnetabscheider LS Spalte entfernen und 2 mL SB Flush Zellen stetig und fest mit einem Spritzenkolben die CD34 sammeln+ Zelle Bruchteil. Zählen Sie die Zellen mit Trypan blau Färbung und einem Hemocytometer oder automatisierte Zelle Zähler.</li>
	<li>Zentrifugenröhrchen mit dem positiven Bruch bei 400 × g für 15 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Zellen in serumfreien Medien für CD34 Aufschwemmen+ Zellen (SFM, siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Wenn Sie nicht sofort benötigt, können Zellen in flüssigem Stickstoff zu diesem Zeitpunkt eingefroren werden.</li>
</ol>
(2) Reinheit Check von isolierten CD34 Zellen+
<ol>
	<li>2 x 104 Zellen aus der positiven Fraktion mit 10 µL Anti-CD34-PE Antikörper und 20 µL Anti-CD45-PerCP Antikörper für 15 min bei 4 ° C (Verwendung eine separaten tube für Isotype Steuerelemente) färben (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL SB zu waschen. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 10 min. Aufschwemmen Pellet in 200 µL des SB.</li>
	<li>Durchflusszytometrischen Analyse durchführen und Tor live Zellpopulation Schutt (Abbildung 1 b) auszuschließen. Das Tor für PE und PerCP positive Populationen mit Steuerelementen für PE und PerCP Isotype (Abbildung 1 b) und bestimmen den Prozentsatz der CD34+/CD45+ Zellen.</li>
</ol>
(3) Megakaryocyte Differenzierung
<ol>
	<li>Samen 5 × 105 Zellen/mL CD34+ Zellen in 2 mL SFM pro Bohrloch in einer 12-Well-Platte mit 50 ng/mL rekombinanten menschlichen Thrombopoetin (RhTPO) ergänzt. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 in eine feuchte Atmosphäre. Wenn Zellen konfluierende sind, bevor sie für die Analyse erforderlich sind, die Zellen zu ernten und in mehrere Brunnen mit frischem Medien- und RhTPO aufgeteilt. Hinweis: Zwei oder drei Brunnen sollte bereit sein, speziell, Differenzierung zu verschiedenen Zeitpunkten (z.B. Tage 7, 9 und 10) zu überwachen.</li>
	<li>Ernten Sie Zellen aus den Brunnen beiseite stellen und Differenzierung zu überwachen, ohne die Zellen in den anderen Brunnen zu stören.</li>
	<li>Fleck-Zellen mit 20 µL Anti-GPIIb/CD41-FITC Antikörper und 10 µL Anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 Antikörper in einem Endvolumen von 100 µL. richten Sie ein Steuerelement Rohr mit den jeweiligen Isotype Kontrolle Antikörper. 15-30 min bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL SB zu waschen.</li></ol>Zentrifugieren bei 400 × g für 10 min. überstand verwerfen und das Pellet in 200-300 µL SB Analyze durch Durchflusszytometrie aufzuwirbeln.
	<li>Analysieren Sie für jede Fluorophor die Isotype-Steuerelemente legen die Anspritzung FITC und Alexa Mehl 647 positiven Bevölkerung. Analysieren Sie die gefärbten Zellproben um den Prozentsatz der CD41 bestimmen+/CD42a+ doppelt positiven Zellen, die Reife MK (Abbildung 1) darstellen.</li>
	<li>Für mikroskopische Darstellung der Zelle färben Oberflächenmarker Zellen wie in 3.3 beschrieben.<ol>
		<li>Fügen Sie 1 mL SB zu waschen. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min. Aufschwemmen das Pellet in 100 µL der SB und Spin auf einem Objektträger bei 1.000 x g für 5 min. Fix Zellen auf der Folie durch Eintauchen in Methanol für 30 S. lufttrocknen hinzufügen 20 µL Medium mit DAPI zu montieren (siehe Tabelle der Materialien) , mit einem Deckglas abdecken und visualisieren mit einem fluoreszierenden Mikroskop (Abb. 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zur Visualisierung der intrazellulären Antigene Aufschwemmen Zellen mit PBS-Puffer und fixieren mit Paraformaldehyd (1 % Endkonzentration) für 15 min bei Raumtemperatur. Um die Zellen permeabilize, fügen Sie Triton-X 100 (0,1 %) und inkubieren Sie für 15 min. Waschen Zellen mit 2 mL PBS/0.1% Triton-X 100. Aufschwemmen in 100 µL der PBS/0.1% Triton-X 100, anti-vWf und Anti CD62p Antikörper (Verdünnung 1: 200) hinzufügen und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.<ol>
		<li>Waschen mit 2 mL PBS/0.1% Triton-X 100 und 400 × g für 10 min Zentrifugieren, in 100 µL des gleichen Puffers Aufschwemmen und Anti-Maus IgG-Alexa 594 und Anti-Kaninchen IgG-Alexa 488 (1: 100) hinzufügen. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, waschen mit 2 mL PBS/0.1% Triton-X 100 in 100 µL des gleichen Puffers Aufschwemmen und fügen Sie 20 µL anti-CD42b-APC. Dann drehen Sie die Zellen auf Glas-Objektträger zu, wie in Schritt 3.6.1 beschrieben und bereiten Sie Proben für mikroskopische Visualisierung vor, wie in Schritt 3.6.1 beschrieben.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zur Bestimmung der Diploidie ernten Sie Zellen am Tage 12 oder 13 der Differenzierung. Fügen Sie 1 mL SB zu waschen. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min und Fleck mit 20 µL Anti-GPIIb/CD41-FITC Antikörper in einem Endvolumen von 100 µL. bei 4 ° C für 30 min inkubieren.<ol>
		<li>Einmal mit 1 mL SB waschen und Aufschwemmen Pellet in 300 µL hypotone Citrat-Puffer (1,25 mM Natriumcitrat, Natriumchlorid 2,5 mM, 3,5 mM Traubenzucker) mit 20 µg/ml Propidium Jodid und 0,05 % Triton X-100. Inkubieren Sie für 15 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Hinzu kommt eine Endkonzentration von 20 µg/mL RNase und inkubieren Sie für 30 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt. Bestimmen Sie die Intensität der Propidium Jodid durch Durchflusszytometrie, durch das Sammeln von 30.000 bis 50.000 Veranstaltungen der Bevölkerung CD41-FITC+ (Abbildung 2).</li>
	</ol>
	</li>

4. proplatelet zählen, Thrombozyten-Enumeration und Thrombozyten Aktivierung
<ol>
	<li>Ernten Sie Zellen (aus Schritt 3.1) Tage 8 oder 9 von Differenzierung und Saatgut an 1 × 104 Zellen/Brunnen in 48-Well-Platten in 200 µL des frischen SFM mit 50 ng/mL RhTPO ergänzt. Kultur für 5 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2. Hinweis: Quantifizierung Zwecken Samen Sie Brunnen in dreifacher Ausfertigung. Diese geringe Dichte ist erforderlich für die Visualisierung und Zählung des proplatelet-Lagers MK Proplatelets in der Regel starten, erscheinen nach 2 Tagen der Kultur. Der Höhepunkt ist zwischen 4 und 5 Tage.</li>
	<li>Die Anzahl der proplatelet tragenden MK in der ganze Brunnen auf einem inversen Licht Mikroskop mit 10 X oder 20 X Ziele. Hinweis: Ein beheiztes (37 ° C) Mikroskoptisch ist vorzuziehen, da halten die Zellen bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum bewirkt, Schrumpfung der proplatelet Erweiterungen dass. Proplatelets sind als lange Erweiterungen aus dem MK-Körper beobachtet. Jeder MK möglicherweise mehrere proplatelet Vorsprünge. Als Proplatelets zu entwickeln, sinkt der Körper des MK in der Größe.</li>
	<li>Zellen zu ernten und Zentrifugieren bei 400 X g für 10 min bei Raumtemperatur. Färben Sie Zellen mit 20 µL Anti-Human CD41-FITC Antikörper, wie in 3.3 und 3.4 beschrieben. Berechnung des Prozentsatzes der proplatelet tragenden MK (PbMK): PbMK (%) = [(Proplatelet-Lager MKs/gut) / (Total CD41+ Zellen / gut)] X 100</li>
	<li>Plättchen in das Kulturmedium abgegeben zu zählen, sanft mischen Sie die Zellen mit einer Pasteurpipette und sammeln Sie 100 µL Tage 14 oder 15 Kultur.<ol>
		<li>Färben Sie mit 20 µL Anti-Human CD41-FITC Antikörper für 20-30 min bei 4 ° C. Richten Sie ein Steuerrohr mit der jeweiligen Isotype Kontrolle Antikörper.</li>
		<li>Fügen Sie SB 150 µL und 50 µL Perlen zu zählen.</li>
		<li>Stellen Sie für durchflusszytometrischen Analyse FSC und SSC Skala anmelden. Einsatz normaler menschlicher Blutplättchen von Platelet-Rich Plasma mit CD41-FITC befleckt, wie beschrieben in Abschnitt 4.4.1 festzulegende gating für Thrombozyten (Abb. 3A).</li>
		<li>Analysieren Sie die gefärbten Plättchen mit Perlen von Durchflusszytometrie zählen. Sammeln Sie 1.000 Veranstaltungen zählen Perlen mit der FSC gegen SSC Streudiagramm (Abb. 3A). Berechnen Sie die Anzahl der Thrombozyten basierend auf CD41-FITC positive Ereignisse (Abb. 3 b) mit der Formel: Thrombozyten pro Mikroliter = [(Anzahl positiver Ereignisse CD41-FITC)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/sample Volume)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Um Thrombozyten Aktivierung zu analysieren, vorsichtig mischen Sie die Zellen mit einer Pasteurpipette und sammeln Sie 100 µL Tage 14 oder 15 Kultur. Fügen Sie 1 mL Tyrode Puffer (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12 mM Nahco33, 5,5 mM D-Glucose, pH 6,5) und Zentrifuge bei 200 X g für 5 min zum pellet-Zellen.<ol>
		<li>Sammeln Sie die überstand und Zentrifuge bei 800 X g für 10 min bis zum pellet-Thrombozyten-Partikel.</li>
		<li>Überstand verwerfen und in 100 µL Tyrode Puffer aufzuwirbeln. Hinzufügen einer Endkonzentration von 20 µM. 20 µL PAC1-FITC Antikörper und Adenosin-diphosphat (ADP) Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min. Analyze durch Durchflusszytometrie den Anteil positiver Ereignisse FITC bestimmen. Verwenden Sie frische menschlichen Thrombozyten auf die gleiche Weise als Positivkontrolle (Abbildung 3) behandelt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nakeff, A., Maat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+megakaryocytes+from+mouse+bone+marrow+by+velocity+sedimentation.">Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation.</a> Blood. 43 (4), 591-595 (1974).</li><li>Zeigler, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+megakaryocytopoietic+and+thrombopoietic+activity+of+c-mpl+ligand+(TPO)+on+purified+murine+hematopoietic+stem+cells.">In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells.</a> Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).</li><li>Reems, J. -. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das hier beschriebene Protokoll eignet sich für konsequente Produktion von MK und Thrombozyten in Kultur aus Nabelschnurblut. Diese Zellen können verwendet werden, um verschiedene Prozesse wie die Wirkung von Drogen oder biologischen Aktivitäten auf MK-Proliferation, Differenzierung, proplatelet Bildung und Produktion der Thrombozyten zu studieren.
Eine Vielzahl von Kultur, Medien und Zytokin-Kombinationen sind in der Literatur vorgestellt worden. Addition von Zytokinen wie Stammzellen Fakt...

Isolierung von ausreichender Anzahl der primären menschlichen Megakaryozyten (MK) für regelmäßige Laboreinsatz ist nicht möglich aufgrund ihrer niedrigen Frequenz im Knochenmark, wo sie ~0.01% von kernhaltigen Zellen1entfallen. Eine bequeme Alternative ist die ex-Vivo -Erweiterung und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen in Anwesenheit von bestimmten Wachstumsfaktoren. Eine Reihe von Zytokinen einschließlich Stammzell-Faktor (SCF; c-Kit-Ligand) und Interleukin (IL)-3 und IL-11 wurden ist in Kultur-Systeme eingesetzt, um MKs Thrombopoietin (TPO) produzieren der effektivste Wachstum und Differenzierung Faktor für Megakaryopoese Kulturen und ist effektiv, allein oder mit anderen Zytokinen, z. B. SCF und IL-3-2. TPO wirken auf Stammzell-Populationen, die Verbreitung und die Reifung der MKs2führen.
MK produzieren Thrombozyten aus zytoplasmatischen Vorsprünge genannt Proplatelets und in-vivo, ca. 1 x 1011 Thrombozyten sind entsteht täglich um Thrombozytenwerte von 150-400 x 109/L. Thrombozyten Produktion in Vitro aufrecht zu erhalten bis zu 1000 -Falten Sie niedriger als die in Vivo 3 schätzt, und dies hat Anlass zu zahlreichen Kulturbedingungen CD34 mit+ hämatopoetischen Vorläuferzellen, MK und Thrombozyten Produktion in Vitrozu verbessern. Die ursprüngliche Quelle der CD34+ für MK Differenzierung verwendete Zellen war menschlichen peripheren Blut4. Andere Zelle Quellen schließen Knochenmark5,6, embryonale Stammzellen/induzierte pluripotente Stammzellen (ESC/iPSC)7und Nabelschnur Blut (UCB)8,9,10 . Menschlichen Knochenmark CD34+ 11 und Maus Linie negative Knochenmark Zellen5 produzieren MK und Blutplättchen in Vitro; Dennoch, die mangelnde Verfügbarkeit von menschlichen Knochenmark schränkt seine Verwendung als eine Quelle von CD34+ Zellen. Im Gegensatz dazu stehen für ESC und iPSC eine unbegrenzte Quelle von Zellen für in-vitro- Thrombozyten-Produktion. Thrombozyten-Produktion aus diesen Zellen erfordert Feeder-Zellen wie murinen OP9 Zellen und längere Kultur. Thrombozyten im Feeder-freien Bedingungen abgeleitet scheinen weniger funktional12sein. iPSC-abgeleitete Plättchen werden voraussichtlich von Einsatz in klinischen Einrichtungen sein, da sie auf einer großen Skala erweitert werden können. Dieser Prozess erfordert Lentivirale vermittelte Transduktion von Transkriptionsfaktoren und langfristige Zelle Kultur13.
UCB ist eine zugängliche Quelle von CD34+ Zellen, die leicht einsetzbare Forschung Einstellungen. TPO allein kann Förderung der Differenzierung der Schnur Blut stammenden CD34+ Zellen, und dies gibt Anlass zu hochreinen, Reife MKs ohne die Notwendigkeit für Serum-Supplementierung oder Kokultur mit Feeder-Zellen. Andere Zytokine wie z. B. SCF Differenzierung von UCB CD34 verringern kann+ Zellen, während Flt-3 Ligand und IL-11 die Produktion von unreifen Megakaryozyten14 fördern. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von hochreinen MK Kulturen aus Nabelschnurblut CD34+ Zellen in serumfreien Bedingungen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TPO</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM II</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td>Serum-free media for CD34+ cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Isolation Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead kit ultrapure</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-453</td>
			<td>This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies</td>
			<td>1114545</td>
			<td>Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile separation buffer (SB)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry and Cell Staining Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340669</td>
			<td>Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP mouse anti-human CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347464</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349044</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-Human CD41a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340929</td>
			<td>Final antibody concentration 1:5 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse anti-Human CD42b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551061</td>
			<td>This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA1227A647T</td>
			<td>Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA928A647</td>
			<td>Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6994</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 mouse anti-humna CD41a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>58425</td>
			<td>1: 20 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>580373</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAC1-FITC antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340507</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti CD62p mouse monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6632</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11020</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ig Isotype Control cocktail-C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558659</td>
			<td>Isotype control antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td>Counting beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Smaller and larger columns are also commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile</td>
			<td>In Vitro technologies</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J3800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIRB inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Vert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyser</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Cytospin 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyser software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Diva Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell analysis software</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 2 blue edition</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

megakaryocyte differentiation and platelet formation from human cord blood-derived cd34+ cells

Thrombozyten-Produktion erfolgt hauptsächlich im Knochenmark in einem Prozeß bekannt als Thrombopoiesis. Während Thrombopoiesis differenzieren hämatopoetischen Vorläuferzellen zu Form Thrombozyten Vorläufern genannt Megakaryozyten, die unheilbar unterscheiden, Thrombozyten aus langen zytoplasmatischen Prozesse bezeichnet Proplatelets freizugeben. Megakaryozyten sind seltene Zellen beschränkt sich auf das Knochenmark und sind daher schwer zu ernten, in ausreichender Zahl für den Laboreinsatz. Effiziente Produktion von menschlichen Megakaryozyten kann erreicht in Vitro durch Kultivierung CD34+ Zellen unter geeigneten Bedingungen. Das Protokoll hier detailliert beschreibt Isolierung von CD34+ Zellen durch magnetische Zellen aus Nabelschnurblut Blutproben sortieren. Die notwendigen Schritte um hochreines, Reifen Megakaryozyten serumfreien Bedingungen zu produzieren sind beschrieben. Details der phänotypische Analyse der Megakaryocyte Differenzierung und Bestimmung der proplatelet Bildung und Thrombozyten sind ebenfalls vorhanden. Effektoren, die Megakaryocyte Differenzierung und/oder proplatelet Bildung, wie z. B. Anti-Thrombozyten-Antikörper oder Thrombopoietin Mimetika beeinflussen können hinzugefügt werden kultivierten Zellen, biologische Funktion zu prüfen.

Dieses Protokoll ermöglicht die Zubereitung von MK hoch Reinkulturen von Schnur Blut stammenden CD34+ Zellen. Der Anteil der CD34+ Zellen in Schnur Blut ist etwa 1,3 %15 (Abbildung 1A) und die Gesamtzahl der mononukleären Zellen (Schritt 1,8) reicht von 90-300 x 106 Stück UCB. Die Reinheit von CD34 + / CD45 + Zellen nach Isolierung reicht von 90 bis 99 % (Abbildung 1 b)....

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Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Eine hochreine Bevölkerung von Megakaryozyten erhalten Sie bei Kabel Blut stammenden CD34+ Zellen. Eine Methode für die CD34+ Isolation und Megakaryocyte Zelldifferenzierung wird hier beschrieben.

Megakaryocyte Differenzierung und Thrombozyten-Formation von Human Cord Blood abgeleitet CD34 Zellen+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

19.5K Aufrufe.  University of New South Wales. Eine hochreine Bevölkerung von Megakaryozyten erhalten Sie bei Kabel Blut stammenden CD34+ Zellen. Eine Methode für die CD34+ Isolation und Megakaryocyte Zelldifferenzierung wird hier beschrieben.

Serie: Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...