Dieses Protokoll schlägt eine einfache Methode zur Gewinnung menschlicher hämatopoetischer Vorläuferzellen und zur Induktion ihrer Differenzierung in Megakaryozyten vor. Es kann als Grundlage für ein besseres Verständnis der Megakaryopoese dienen Diese Technik verwendet eine Quelle, bietet aber den Vorteil, dass sie für die Laborforschung in der Hämatopoese erschwinglich und reichlich vorhanden ist. Diese Methode wird verwendet, um die Megakaryopoese besser zu verstehen, damit die Zelle, die in der Therapie verwendet werden soll, unter den GMP-Bedingungen hergestellt werden muss, was derzeit nicht der Fall ist.
Das Verständnis der Schritte einschließlich der PBMC-Sammlung kann nur mit einer visuellen Demonstration vollständig abgeschlossen werden. Bevor Sie mit einem Experiment beginnen, schließen Sie einen Leukoreduktionsfilter an einen leeren 600-Milliliter-Transferbeutel und an einen Schlauchsatz an. In einer Bio-Sicherheitswerkbank 25 Milliliter gefilterten Elutionspuffer pro Leukoreduktionsfilter in den leeren Beutel injizieren und den Beutelinhalt mit einer 30 Milliliter Spritze schonend durch den Filter absaugen.
Übertragen Sie die gesammelten roten Blutkörperchen in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen und verdünnen Sie die Zellsuspension um die Hälfte mit 2% Dextran. Mischen Sie gut, um die Blutzellen zu aggregieren und die Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur sedimentieren zu lassen. Wenn sich die roten Blutkörperchen niedergelassen haben, übertragen Sie den Überstand in ein 50-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie das Röhrchen mit zwei Millimolaren PBS-EDTA-Lösung.
Legen Sie die Hälfte des Überstandes vorsichtig auf 25 Milliliter Dichtegradientenmedium in jeweils zwei 50-Milliliter-Rohren, ohne die Gradientenoberfläche zu stören, und trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation. Verwenden Sie eine Einwegpipette, um die Zellen von jeder Schnittstelle auf ein neues 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Waschen Sie die Zellen zweimal in 50 Millilitern von zwei Millimolar PBS EDTA pro Wäsche.
Nach der zweiten Wäsche resuspendieren Sie die Pellets in einem einzigen 50 Milliliter Volumen von frischem PBS EDTA zum Zählen. Hier ist es möglich, das Verfahren zu stoppen, indem die gesammelten Zellen während der Nacht bei vier Grad Celsius unter Bewegung gehalten werden. Für die CD34+ Zellselektion bestimmen Sie die Zellzahl und sammeln die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Zellpellet in 300 Mikrolitern von zwei Millimolar PBS EDTA pro 10 bis zu den achten Zellen.
Fügen Sie das entsprechende Volumen des FC-Rezeptor-blockierenden Reagenz und 50 Mikroliter CD34-Mikroperlen pro 10 zu den achten Zellen hinzu. Nach 30 Minuten bei vier Grad Celsius waschen Sie die Zellen mit zwei millimolaren PBS EDTA und resuspenieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern frischem zwei Millimollem PBS EDTA pro 10 zu den acht Zellen. Befeuchten und dimensionieren Sie die magnetische Säule mit PBS EDTA und geben Sie dann die Probe zur Säule hinzu.
Waschen Sie die Säule zweimal mit drei Millilitern von zwei Millimolar PBS EDTA pro Waschgang. Vor dem Ausweichen der CD34+-Zellen mit zwei Fünf-Milliliter-Volumina von zwei Millimolaren PBS EDTA pro Elution. Um die Reinheit der ausgewählten Magnetperlenzellen zu beurteilen, fügen Sie zwei Mikroliter eines geeigneten menschlichen Anti-CD34-Antikörpers zu einem 100 Mikroliter Aliquot der isolierten Zellen hinzu und mischen Sie gut, bevor Sie 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren.
Nach der Inkubation die Zellen in PBS waschen und das Pellet in 200 Mikrolitern PBS resuspendieren, um die Reinheit der Zellprobe durch Durchflusszytometrie zu analysieren. Sammeln Sie nach der Zählung die CD34 + -Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet sofort in kalter Lösung eins bis zu einer Dichte von 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter, bevor Sie die Zellsuspension schnell zu Kaltlösung zwei hinzufügen. Dann legen Sie das Kryorohr sofort für 24 Stunden in einen minus 80 Grad Celsius gefrierenden Gefrierschrank, bevor Sie das Kryorohr in die Flüssigstickstofflagerung überführen.
In dieser repräsentativen Studie wurden die Zellen durch Leukoreduktionsfiltration gewonnen, wie mit einer Lebensfähigkeit von etwa 95% gezeigt wurde. Nach magnetischer Perlenauswahl wurde eine mehr als 90% reine CD34 + Zellpopulation erhalten. Die Zellproliferation nimmt typischerweise nach einer Woche der Kultur ab, jedoch ohne signifikante Veränderungen der Zelllebensfähigkeit.
Am siebten Tag sollten die CD34 + -Zellen beginnen, CD41 zu exprimieren, einen spezifischen und frühen Marker oder für die Entwicklung von Megakaryozyten und Thrombozyten. Am Tag 10 entwickelt sich die Mehrheit der Zellen in der Kultur typischerweise zu reifen CD41, die Megakaryozyten exprimieren. Am Tag 13 können megakaryozyten-Pro-Thrombozyten-Erweiterung und Thrombozytenfreisetzung durch Lichtmikroskopie beobachtet werden.
Die Gesamtzahl der cd41, CD42, 8 positiven Blutplättchen, die in die Kultur freigesetzt werden, kann dann mit einer kalibrierten Anzahl von fluoreszierenden Kügelchen quantifiziert werden. Diese Methode ebnet den Weg, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Megakaryopoese zu verbessern und die Thrombozytenausbeute visuell zu erhöhen. Auch wenn diese Methode mühsam erscheint, ist es sehr einfach, dass Sie nur geduldig sein und alle Regionen im Voraus vorbereiten müssen.
Obwohl unsere kritischen Bedenken Megakaryopoese sind, erhalten wir CD42-Zellen, die in überhämatopoetischen Signalwegen verwendet werden können.
