Wir danken Michael VanNieuwenhze (Indiana University) für das Geschenk des FDAAs, die in Abbildung 2 und Abbildung 4verwendet. Wir danken Mitglieder des braunen Lab for Feedback während der Vorbereitung dieser Handschrift. Forschung in die braunen Lab on A. Tumefaciens Zelle Wachstum und Teilung wird von der National Science Foundation (IOS1557806) unterstützt.

1. Wachstum von A. Tumefaciens Stämme
<ol><li>
Kultivierung von A. Tumefaciens Stämme
	<ol>
<li>Verwenden Sie einen sterilen Holzen Stick oder Pipettieren Tipp impfen 1 mL ATGN Wachstumsmedien (siehe Materialliste für das Rezept) mit einer einzigen Kolonie der gewünschten Sorte. Hinweis: Für A. Tumefaciens Erschöpfung Stämme, sollte die ATGN 1 mM IPTG wie ein Induktor weiterhin Biosynthese von essentielles Protein enthalten.</li>
		<li>A. Tumefaciens Stämme über Nacht in ATGN bei 28 ° C mit Schütteln bei 225 u/min zu wachsen.</li>
		<li>Messung die optische Dichte der Zellen bei 600 nm (OD600) mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die Zellkultur auf einer OD600 = ~0.2 und weiter wachsen bis OD600 = ~0.6 erreicht ist. Für Erschöpfung Stämme weiter wachsen mit Induktor bis OD600 = ~0.6 erreicht ist.</li>
		<li>Verwenden Sie Wildtyp und Mutanten Stämme von A. Tumefaciens OD600 = ~0.6 für Target-spezifische Färbung und/oder Zeitraffer Mikroskopie (siehe § § 2 und 3.1). Für Erschöpfung Stämme Auswaschen der Induktor (siehe Abschnitt 1.2.)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entfernung der Induktor zur Charakterisierung von A. Tumefaciens Protein Erschöpfung Stämme
	<ol>
<li>Pellet-1 mL der exponentiellen Kultur (OD600 = ~0.4-0.6) durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min in einer Desktop-Zentrifuge bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Zum Waschen entfernen überstand und das Pellet in frische Medien ohne Induktor Aufschwemmen und pellet die Zellen wie oben (1.2.1) beschrieben. Waschen Sie den Zellen insgesamt 3 Mal in den neuen Medien.</li>
		<li>Aufschwemmen der letzten Pellet in frische Medien und konzentrieren sich die Zellen eines OD600 = ~0.8 für sofortige Färbung mit Ziel bestimmte Farbstoffe (Abschnitt 2 und Abbildung 4 b-D) oder Time-Lapse-Mikroskopie (Abschnitt 3.2 und Abbildung 4a).) . Alternativ vorab zum Abbau der Zellen für die gewünschte Menge an Zeit durch den Anbau von der Zellen in den Medien ohne Induktor vor Fleckenbildung und Bildgebung der Zellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Target-spezifische Färbung von A. Tumefaciens Zellen
<ol><li>
Fluoreszierende d-amino Acid Zellwand Kennzeichnung Hinweis: FDAAs sind ungiftig fluoreszierende d-Aminosäuren die ohne weiteres in die A. Tumefaciens Peptidoglycan integriert sind. Dieses einfache Kennzeichnung Verfahren Sonden Wachstum in lebenden Zellen6Musterung. Protokolle für die Synthese von vier FDAAs sind verfügbar38.<ol>
<li>Pellet-500 µL der exponentiellen Kultur (OD600 = ~0.4-0.6) durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min in einer Desktop-Zentrifuge. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 100 µL der neuen Medien.</li>
		<li>Fügen Sie 5 µL 5 mM FDAA, gewaschen und Zellen konzentriert und 2 min im Dunkeln inkubieren. Hinweis: Maximal FDAA Lichteinwirkung. Die Zeit der Inkubation wird die Wachstumsrate der Belastung abhängig. In der Regel sollte die Inkubationszeiten zwischen 5-10 % der Verdoppelung Mal6.</li>
		<li>Pellet-Zellen durch Zentrifugation und Zelle Pellets mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) dreimal waschen.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie Pellet in ~ 50 µL PBS. Hinweis: Die Lautstärke des PBS zur Wiederfreisetzung variieren basierend auf Pellet-Größe.</li>
		<li>Anwenden von 0,8-1 µL Zellen zu einer Agarose-Pad und Bild mit Epifluoreszenz Mikroskopie sofort (siehe Abschnitte 3.1 und 3.2).<ol>
<li>Alternativ weitere stoppen Sie Label Aufnahme durch die Fixierung der Zellen mit eiskalten 70 % Ethanol. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL eiskaltes 70 % Ethanol und 15 Minuten auf dem Eis inkubieren.</li>
			<li>Zellen durch Zentrifugation zu sammeln und in einem kleinen Volumen der PBS für die Bildgebung zu einem späteren Zeitpunkt erneut. Zellsuspensionen bei 4 ° C und Bild innerhalb von 48 Stunden zu speichern.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA-Färbung mit DAPI oder Orange Fleck Hinweis: Um DNA zu beobachten Struktur, Zellen mit DAPI oder Orange (tote Zelle Fleck) gekennzeichnet sind. Obwohl klassisch als einen "Toten Zelle Fleck" beschrieben, ist Orange permeationsfähigen, photostabil, und hat keinen Einfluss auf das Wachstum von Bakterienzellen, ermöglicht live-Cell DNA imaging-10. In A. Tumefaciensorangefarbene Kennzeichnung Werke auch in lebenden Zellen und eignet sich für Zeitraffer-Mikroskopie (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu, die ultraviolette (UV) Belichtung notwendig für bildgebende DAPI-gefärbten Zellen phototoxischen (Abbildung 3) und somit DAPI-Färbung eignet sich am besten zum Beizen von lebenden Zellen für sofortige imaging oder Färbung feste Zellen.<ol>
<li>DAPI-Färbung der Zellen<ol>
<li>Pellet-1 mL der exponentiellen Kultur (OD600 = ~0.4-0.6) durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min in einer Desktop-Zentrifuge.</li>
			<li>Optional, um Zellen vor der Färbung zu beheben, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL eiskaltes Ethanol 70 %. Inkubation auf Eis für 10-15 min. sammeln die Zellen durch Zentrifugation als 2.2.1.1 beschrieben.</li>
			<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL PBS mit 1 µL der Stammlösung DAPI (1 mg/mL; siehe Materialtabelle). Mischen von pipettieren und 5 Minuten im Dunkeln inkubieren.</li>
			<li>Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min und in 1 mL PBS entfernen überschüssige DAPI aufzuwirbeln. Waschen der Zellen zwei weitere Male und das Pellet in 50 µL PBS oder Medien Aufschwemmen.</li>
			<li>Anwenden von 0,8-1 µL Zellen eine Agarose-Pad und Bild Epifluoreszenz Mikroskopie sofort verwenden. Siehe Abschnitte 3.1 und 3.2. Hinweis: Dieses Protokoll ist nicht optimal für Zeitraffer-Mikroskopie, Chromosom Dynamik (Abbildung 3) zu beobachten. Erwägen Sie Orange Färbung als Alternative (siehe Abschnitt 2.2.2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Orange Färbung von lebenden Zellen</li>
		<li>Pellet-1 mL der exponentiellen Kultur (OD600 = ~0.4-0.6) durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min in einer Desktop-Zentrifuge. Aufschwemmen Zelle Pellet in 1 mL PBS mit 1 µL Orange-Stammlösung (siehe Materialliste). Mischen von pipettieren und 5 min im Dunkeln inkubieren.</li>
		<li>Pellet-Zellen durch Zentrifugation und Aufschwemmen in 1 mL PBS, überschüssige Orange zu entfernen. Waschen der Zellen zwei weitere Male und das Pellet in 50 µL PBS aufzuwirbeln.</li>
		<li>Anwenden von 0,8-1 µL Zellen eine Agarose-Pad und Bild Epifluoreszenz Mikroskopie sofort verwenden. Siehe Abschnitte 3.1 und 3.2. Hinweis: Dieses Protokoll funktioniert gut mit lebenden Zellen und eignet sich für Zeitraffer-Mikroskopie, Chromosom Dynamik (Abbildung 3) zu beobachten. Wenn es nicht sofort Bild passt, können Zellen in eiskalte 70 % igem Ethanol (siehe Abschnitt 2.2.1.2) behoben werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Membran zu beschriften Hinweis: Die lipophilen Styryl Fluoreszenzfarbstoff 4-64 ist beträchtlich, die Membran der Bakterienzellen beobachten benutzt worden. Im Gegensatz zu vielen Bakterien 4-64 mit der Bezeichnung A. Tumefaciens Zellen nicht einheitlich zu kennzeichnen, aber recht häufig ein "Hufeisen" Muster14,15aufweisen. Bemerkenswert ist die Wachstumspol fast frei von Flecken, während der alte Pol intensiv gekennzeichnet ist. Somit ermöglicht 4-64 Visualisierung der Zelle Wachstumsmuster und Membran-Struktur in A. Tumefaciens.<ol>
<li>Hinzu kommt eine Endkonzentration von 8 µg/mL in 1 mL der exponentiellen Phase Zellkultur FM 4-64 und 5 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Pellet-markierte Zellen durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 Minuten in einer Desktop-Zentrifuge und Zelle Pellet in 1 mL PBS aufzuwirbeln. Waschen Sie den Zellen insgesamt dreimal, um überschüssige Farbe zu entfernen.</li>
		<li>Aufzuwirbeln Sie Zellen in einem kleinen Volumen der PBS und vor Ort auf eine Agarose-Pad, um sofort Bild. (Siehe Abschnitte 3.1 und 3.2) Achtung: Zellen müssen sofort abgebildet werden, um charakteristische Kennzeichnung Muster zu beobachten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Darstellung der A. Tumefaciens Zellen
<ol><li>
Agarose-Pad-Vorbereitung Hinweis: Abbildung 1 enthält eine Bildsequenz (zentrale A) und Schaltplan (Gruppe B) eines typischen Agarose-Pads für Zeitraffer-Mikroskopie vorbereitet. Agarose-Pads sind in der Regel bereit, je nach Bedarf.<ol>
<li>3.1.1 verwenden Sie ein Deckglas als Wegweiser und Schnitt eine 22 x 22 mm Quadrat des Labors mit einem Skalpell an den Rändern film (siehe Materialliste).</li>
		<li>Schneiden Sie ein Quadrat aus dem Zentrum des Labor-Films verlassen ~ 2-5 mm Grenze als eine Dichtung für die Agarose-Pad zu dienen. Verwerfen Sie den Center-Ausschnitt.</li>
		<li>Legen Sie die Film-Dichtung auf einen Objektträger (75 mm x 25 mm) mit Ammoniak und Alkohol Reiniger (siehe Materialliste) gereinigt und erhitzen, bis der Film auf Glas (obere Bild in Abbildung 1A) leicht geschmolzen ist. Labor Film schmelzen, benutzen Sie den Rand von einem Block Heatset auf 70 ° C oder über einer Flamme leicht schmelzen.</li>
		<li>Bereiten Sie Agarose-Lösung durch Mischen ~0.075 g Agarose (siehe Materialliste) in 5 mL Medien in eine kleine Flasche. Erhitzen Sie die Lösung in einer Mikrowelle mit periodischen Wirbeln zu mischen, bis die Agarose aufgelöst wird und die Lösung klar ist. Halten Sie die Agarose-Lösung bei 55-70 ° C und für den Bau von mehreren Agarose-Pads innerhalb von 48 Stunden.</li>
		<li>Pipette Medien mit 1,2 – 1,5 % Agarose in der Mitte der Dichtung. Hinweis: Die Lautstärke der Medien ist in der Regel 50-60 µL aber variiert je nach Größe der Dichtung. Hinzufügen von Medien zu einer kalten Folie die Agarose, vorschnell zu verfestigen verursachen können, sollte daher die Folie auf eine warme Oberfläche gehalten werden. Der Rand von einem Heizblock auf 70 ° C arbeiten gut eingestellt. Wasser-Agarose oder gepufferten Agarose Lösungen wie Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) können verwendet werden, anstelle von Medien, die Agarose für Anwendungen, in denen weitere Zellwachstum nicht erforderlich ist. Für imaging Erschöpfung Stämme, Induktor kann präsentieren oder abwesend in den Medien. Präsenz der Induktor kann als Kontrolle verwendet werden, während das Fehlen der Induktor den Erschöpfung Phänotyp offenbaren wird.</li>
		<li>Platzieren Sie ein Deckglas über die Dichtung um die Agarose gleichmäßig zu verteilen.</li>
		<li>Legen Sie die Folie auf einen kühlen Untergrund für ~ 2 min. vermeiden Übertrocknetes der Agarose Pad da dies eine runzlige Oberfläche auf die Agarose-Pad und Bündelung der Zellsuspension bei Anwendung auf der Oberfläche führt zu festigen.</li>
		<li>Schieben Sie vorsichtig das Deckglas aus dem Agarose-Pad. Achtung: Dieser Schritt keine Eile. Die Agarose-Pad kann leicht reißen und eine ungleichmäßige Agarose-Pad kann Bildgebung erschweren.</li>
		<li>Lassen Sie die Agarose-Pad an der Luft trocknen für 1 – 2 min. bei Raumtemperatur bis die Oberfläche des Pads trocken erscheint. Mit einem Skalpell entfernen Sie einen schmaler Streifen der Agarose erstelle ich ein Luftpolster (mittlere Bild, Abbildung 1A); das Luftpolster ist in der Regel ~ 2 x 7-10 mm und A. Tumefaciens Zellen sind in der Regel wachsen am besten in der Nähe der Atemhöhle (Abbildung 1). Hinweis: Für die Bildgebung der fixen Zellen oder unter Bedingungen, wo Wachstum nicht überwacht wird, ist ein Luftpolster nicht erforderlich.</li>
		<li>Spot 0,8-1 µL Zellen auf die Agarose-Pad und mit einem neuen Deckgläschen abdecken. Legen Sie das Deckglas vorsichtig über den oberen Teil der Agarose-Pad auf die Oberfläche des Pads Agarose Zellen verteilt.</li>
		<li>Seal die Ränder der das Deckglas mit geschmolzenen VALAP (siehe Materialtabelle für Rezept; Abbildung 1A, Bild unten). Entlang der Kanten und Ecken von dem Deckglas versiegeln können fehlschlägt Trocknung von der Agarose-Pad, die zu das Auseinanderdriften der Zellen während der Bildgebung führen wird. Hinweis: Abdichtung von das Deckglas ist nur für die langfristige Zeitraffer Bildgebung erforderlich.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56497/56497fig1.jpg"> Abbildung 1: Agarose Pad Vorbereitung. (A) Bild-Sequenz des Protokolls Agarose Pad Vorbereitung. Bild 1 ist eine Folie mit der Labor-Film-Dichtung. In Abbildung 2 sind die Agarose-Pad und Atemhöhle visualisiert. Zu guter Letzt Bild 3 zeigt die komplette Agarose-Pad mit den Zellen unter einem Deckglas und mit VALAP versiegelt. (B) eine schematische Darstellung einer Agarose-Pad für Zeitraffer-Mikroskopie steht zur Verfügung. Hauptmerkmale des Agarose-Pads sind im Schaltplan gekennzeichnet. (C) die Atemhöhle förderte Wachstum von A. Tumefaciens auf Agarose-Pads. Gezeigt werden Bilder der Wildtyp A. Tumefaciens Zellen gewachsen auf einem Agarose-Pad für 20 Stunden. Bilder wurden an Positionen immer weit entfernt von der Atemhöhle. Die Entfernung von der nächsten Kante des Bildes in die Atemhöhle wird über jedes Bild angezeigt. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56497/56497fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="2"><li>
Bildgebung Hinweis: Differential Interferenz-Kontrast, Phasenkontrast und Epifluoreszenz Bildgebung erfolgt mit einem inversen Mikroskop mit Hardware-basierte Autofokus, 60 X Ölimmersion automatisierte frühzeitig, Standardfilter, eine LED-Lichtquelle ausgestattet Ziele (1,4 NA) für Phasenkontrast oder differential Interferenz-Kontrast (DIC), und ein 1K Elektron-Multiplikation-gepaart-Ladegerät (EMCCD) Kamera. Das Mikroskop sollte in einem klimatisierten Raum platziert werden. Alternativ kann eine Stufe wärmer oder Kammer weiterhin konsequente Temperaturen während der Aufnahme verwendet werden.<ol>
<li>Epifluoreszenz Mikroskopie Hinweis: Für die Fluoreszenz-Bildgebung von lebenden Zellen ist es notwendig, die Anzahl der Bild Akquisitionen und optimieren Sie die Belichtungszeit um Immunofluoreszenz und Phototoxizität zu minimieren. Für die Darstellung von jeder Farbstoff empfiehlt es sich, eine optimale Belichtungszeit zu finden, die ausreichend Fluoreszenz-Detektion bietet aber führt nicht zur Immunofluoreszenz oder Phototoxizität. In den Abbildungen 2-4dienten alle Fluoreszenzbilder Belichtungszeiten von 200 ms. Für die Zeitraffer-Sequenzen in Abbildung 3dargestellt wurden die Bilder alle 10 min für 3 h erworben.<ol>
<li>Immersionsöl auf das angestrebte Ziel und legen Sie die invertierte Folie in den Diahalter auf der Bühne. Verwenden Sie die Fokussierung-Regler, um die Zellen in den Fokus zu bringen.</li>
			<li>Bilder in Phase (oder DIC) und den gewünschten Fluoreszenz-Filter zu erwerben. Hinweis: Die maximale Anregung und Emission Wellenlängen für die Flecken verwendet in Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4 sind wie folgt: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), Orange (547/570).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zeitraffer-Mikroskopie Hinweis: Während der Time-Lapse-Mikroskopie die folgenden Features sind Computer gesteuert: x-, y- und Z-Position, Fensterläden und Fluoreszenz-Filter. Eine Hardware-basierte Autofokus-System ist optimal zu konzentrieren während der Time-Lapse Bildgebung. Alternativ kann eine Software-basierte Autofokus-Schleife verwendet werden.<ol>
<li>Immersionsöl auf das angestrebte Ziel und legen Sie die invertierte Folie in den Diahalter auf der Bühne. Verwenden Sie die Fokussierung-Regler, um die Zellen in den Fokus zu bringen.</li>
			<li>Optional: Erwerben mehrere (X, y) Positionen. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 10 Felder von Zellen in unmittelbarer Nähe der Atemhöhle der Agarose-Pads.</li>
			<li>Einrichtung der Sequenz Erwerb Bild in Phase oder DIC auf das gewünschte Zeitintervall. Hinweis: Für die Zeitraffer-Sequenz, die in Abbildung 4dargestellt, DIC-Bilder mit 30 ms Exposition alle 10 min für 14 h erworben wurden. Bei der Verwendung von Fluoreszenz-Bildgebung im Zeitraffer Mikroskopie anpassen der Erfassungszeit Intervall und Belichtung, Immunofluoreszenz und Phototoxizität zu minimieren.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll enthält eine Reihe von Verfahren zur Untersuchung von A. Tumefaciens Wildtyp, Mutanten und Erschöpfung Stämme. Es ist erwähnenswert, dass alle im Abschnitt Protokoll aufgeführten Verfahren für andere Bakterienstämme mit zusätzlichen Modifikationen ausmachen Wachstumsmedien, Temperaturen und Wachstumsraten leicht angepasst werden kann.
Die Verwendung von Farbstoffen gezielt ist ein wertvolles Werkzeug für die Bereitstellung einer detaillierte Charakterisierung...

Fortschreiten durch die bakterielle Zelle Zyklus erfordert die Koordination vieler Prozesse einschließlich der Membran und Zellwand Biosynthese, DNA-Replikation und Segregation und Zellteilung. Um die Komplexität der bakteriellen Zelle Biologie zu verstehen, ist es notwendig, diese wesentliche Ereignisse zu studieren; Dies ist jedoch eine nicht-triviale Aufgabe, da Zellviabilität gefährdet ist, wenn wichtige Komponenten dieser Wege mutagenisierter werden. Epifluoreszenz Mikroskopie gepaart mit zielgruppenspezifischer Farbstoffe ist ein leistungsfähiger Ansatz, diese wesentlichen Prozesse in Wildtyp und Mutanten Bakterienstämme zu erforschen.
Peptidoglycan-spezifische Farbstoffe enthalten fluoreszierende Antibiotika (Vancomycin-FL, Bocillin-FL) und Leuchtstoff-d-Aminosäuren (z. B. 7-Hydroxycoumarin-3-carboxylic Acid-3-amino-d-Alanin, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-Alanin , NADA; Tetramethylrhodamine-3-amino-d-Alanin; TADA). In grampositiven Bakterien wurde die Verwendung von subletalen Konzentrationen von fluoreszierenden Antibiotika Analoga auf Seiten der Peptidoglycan Biosynthese Sonde eine wirksame Strategie zur Peptidoglycan einfügen Muster1,2zu offenbaren, 3,4. Während fluoreszierende Vancomycin Kennzeichnung verwendet wurde, um Einblicke in die Peptidoglycan einfügen Muster in festen Gram-negativen Bakterien5, bietet die äußere Membran in der Regel eine Durchlässigkeit Barriere, die verhindert, die Verwendung von Leuchtstofflampen dass Antibiotika als Sonde für Peptidoglycan Biosynthese in lebenden Zellen. Im Gegensatz dazu beschriften kurze Pulse von Leuchtstoff-d-Aminosäuren oder d-Aminosäuren mit Biorthogonal funktionellen Gruppen kovalent Regionen der jüngsten Peptidoglycan Insertion in einer Vielzahl von lebendigen Bakterienzellen6,7. Muster der Peptidoglycan Einfügung, die mit synthetischen d-Aminosäuren beobachtet gehören punctata und septal (Escherichia coli und Bacillus Subtilis), polar und septal (Agrobacterium Tumefaciens und Listeria Monocytogenes), septal nur (Staphylococcus Aureus) und apikal (Streptomyces Venezuelae)6,7. Diese Beobachtungen zeigen, dass Bakterien unterschiedliche Muster der Zellwand Biogenese weisen und die Verwendung von synthetischen d-Aminosäuren als Sonden für die Prüfung Wachstum Musterung eine sinnvolle Strategie in vielen Bakterien ist.
Farbstoffe, die bakterielle Chromosomen beschriften gehören der Desoxyribonukleinsäure (DNA) bestimmte kleinere Groove Binder (4,6-Diamidino-2-Phenylindole; DAPI) und hohe Affinität Cyanin-Farbstoffe (grün und Orange; siehe Materialliste). DAPI-Färbung der fixen Zellen hilft bei der Aufzählung der Bakterien aus Umweltproben8, wogegen DAPI-Färbung von lebenden Zellen verwendet wird, um bakterielle Lebensfähigkeit9anzugeben. Im Gegensatz dazu Farbstoffe Cyanin wie Orange und grün sind häufig beschrieben, wie impermeant "tote" Zelle Membrane Flecken, nicht lebensfähige Zellen9aufzulisten. Bemerkenswert ist, wenn diese Reagenzien verwendet werden, um die Morphologie der bakterielle Nucleoid während Zellwachstum Sonde, DAPI, Orange und grün alle erwiesen sich Membran permeationsfähigen und in der Lage, Kennzeichnung von lebenden Zellen10. In E. Coli Zellen Leben, DAPI-Färbung der DNA erscheint diffus durch Auto-Fluoreszenz von Zytoplasma und wiederholte Exposition des DAPI-gefärbten Zellen auf ultraviolettes (UV) Licht stört die Nucleoid Struktur10. Färbung E. Coli oder B. Subtilis mit Orange enthüllt, dass dieser Farbstoff Membran permeationsfähigen und lang anhaltende Fluoreszenz auf Bindung an DNA in lebenden Zellen bietet ohne Beeinträchtigung der Zelle Wachstum, DNA-Replikation oder Chromosom Abtrennung10 . Diese Beobachtungen legen nahe, dass Cyanin DNA-Farbstoffe verwendet werden können, um die Morphologie des ausgedehnt beim Zellwachstum in vielen Bakterien zu überwachen.
Phospholipid-specific Stryl Farbstoffe wie z. B. N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridiniumdichromat Dibromide (4-64; siehe Materialliste) sind kationische Verbindungen und ordnen Sie bevorzugt negativ geladen Phospholipide wie Cardiolipin und Phosphatidylglycerol11. Verschiedene Muster werden beobachtet, wenn 4-64 verwendet wird, um die Membran von verschiedenen Bakterien zu beschriften. In Escherichia coli4-64 ist in Polen, in Bändern entlang der Seitenwand angereichert und in den Geschäftsbereich des späten pre-divisional12Zellen. In Bacillus Subtilisermöglicht 4-64 Kennzeichnung die Visualisierung der Lipid Spiralen13. In Agrobacterium Tumefaciens4-64 Etiketten die äußere Membran und ist in einem charakteristischen "Hufeisen"-Muster, in der die Wachstumspol ist frei von14,15Kennzeichnung, beobachtet. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass diese Bakterien heterogene Lipid-Distributionen aufgrund des Vorhandenseins von Lipid-Domains zeigen die zellulare Asymmetrie beitragen. Änderungen 4-64 Kennzeichnung Muster wie zum Beispiel das Vorhandensein von diffusen Kennzeichnung kann Blebs oder Vesikel, Invaginations oder Membran Schrumpfung informativ sein bei der Charakterisierung von Mutanten, die Einfluss auf die Verteilung oder die Biosynthese von Lipiden.
Hinausgeht, Färbung Zellen, ist bestimmen die Funktion von Proteinen, die Teilnahme an essentielle Prozesse erforderlich. Die Charakterisierung der wesentlichen Proteine ist technisch anspruchsvoll, denn es nicht möglich ist, löschen Sie wesentlichen Gene und die phänotypischen Auswirkungen zu studieren. So entstanden alternative Ansätze, die zu einem des Proteins Abbau. Beispielsweise kann ein wesentliches gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoter, anstatt seine native Veranstalter gestellt werden. Induzierbare Promotoren sind empfänglich für kleine Moleküle wie z. B.; Zink-16, Isopropyl β-d-1-Thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, Arabinose22, vanillate17,23, und Xylose23, damit die Transkription des Zielgens aufhört und das Protein des Interesses ist leer, wenn der Induktor entfernt wird. Alternative Ansätze für abbauende wesentlich interessierenden Proteine enthalten synthetische Riboschalter24 welche kleine Molekül-RNA Interaktionen verwenden, um die Transkription von Zielgenen, CRISPR Einmischung25,26 behindern , Block-Transkription von Zielgenen und induzierbaren Protein Degradation27,28 die Peptid-Tags Zielproteine für den Abbau von ClpXP Protease verwendet. Erschöpfung Stämme bieten nur kurze Zeit für die Charakterisierung, bevor die Zellen Lebensfähigkeit verlieren, daher mikroskopische Bildgebung von Zellen im Laufe der Zeit während der Protein-Abbau ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Charakterisierung. In der Tat ermöglichte Mikroskopie lebender bakterielle Zellen Forscher Einblicke in grundlegende biologische Prozesse, einschließlich der Mechanismen der Zelle Form Wartung, Sekretion und Abschottung29.
A. Tumefaciens ist eine bakterielle Pflanzen Pathogen30 und natürlichen genetischen Ingenieur31,32. Also, auch Mechanismen im Zusammenhang mit Pathogenität, Wirt-Pathogen Interaktionen33,34,35, Sekretion36und Host Transformation30,31, 37 ausgiebig untersucht. Um Strategien zu entwerfen, die A. Tumefaciens vermittelten Krankheiten vorbeugen oder verbessern Pflanzentransformation, A. Tumefaciens überlebensnotwendig Prozesse besser verstanden werden müssen. Die Verwendung von Farbstoffen gezielt und die jüngste Entwicklung einer Protein-Abbau-Strategie für A. Tumefaciens18 bietet eine Möglichkeit, wichtige Prozesse zu untersuchen.
Hier werden ausführliche Protokolle für die mikroskopische Analyse der Wildtyp und Mutanten Protein Erschöpfung Stämme von A. Tumefaciens bereitgestellt. Die ersten beiden Protokolle wird beschrieben, wie Zellen vorbereiten und beschriften Sie sie mit gezielt Farbstoffe. Das dritte Protokoll bietet schrittweise Anleitungen für die Zubereitung von Agarose-Pads (Abbildung 1) und imaging die Bakterienzellen (Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4). Diese Protokolle möglicherweise auch geeignet für andere Bakterien mit zusätzlichen Anpassungen an verschiedene Medien Bedingungen, Wachstumsraten, Sauerstoff-Anforderungen und Zellstrukturen zu berücksichtigen.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58</td><td>ATCC</td><td>33970</td><td>Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. J Bacteriol 123:255-264.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58&amp;Delta;tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-&lt;em&gt;ctrA &amp;Delta;ctrA&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. 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Autoclave.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP359</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>20X AT Salts</td><td></td><td></td><td>Add 40 g/L (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 3.2 g/L MgSO4&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.2 g/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, and 0.024 g/L MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to water. Autoclave.</td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>A701</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Chemical</td><td>M114</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16</td><td>Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1423</td><td>Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Optional Media Additives&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>GoldBio</td><td>K-120</td><td>Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>GoldBio</td><td>I2481C5</td><td>Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopy Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550D</td><td>25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-B</td><td>22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.</td></tr><tr><td>Sparkle Glass Cleaner</td><td>Home Depot</td><td>203261385</td><td>Ammonia and alcohol free.</td></tr><tr><td>Ultra Pure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td>Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399500</td><td>10X solution to be diluted to 1X with sterile water.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.</td></tr><tr><td>VALAP</td><td></td><td></td><td>Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 &amp;deg;C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.</td></tr><tr><td>Lanolin Butter</td><td>SAAQIN</td><td>SQ-LAB-R1</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum Jelly</td><td>Target Corp.</td><td>06-17644</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin Wax</td><td>Crafty Candles</td><td>263012</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Target-specific dyes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Use to dilute stock solutions of dyes as needed.</td></tr><tr><td>FDAAs (NADA, HADA,TADA)</td><td></td><td></td><td>FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td>Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 &amp;micro;M.</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry bath</td><td>Sheldon Manufacturing, Inc.</td><td>52120-200</td><td></td></tr><tr><td>Metallic thermal beads</td><td>Lab Armor</td><td>42370-002</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera</td><td></td><td></td><td>Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.</td></tr></tbody></table>

live cell fluorescence microscopy to observe essential processes during microbial cell growth

Zelluläre Kernprozesse wie DNA-Replikation und Segregation, Proteinsynthese, Zellwand-Biosynthese und Zellteilung verlassen sich auf die Funktion von Proteinen, die bakterielle überlebenswichtig sind. Eine Reihe von Farbstoffen gezielt kann verwendet werden, da diese Prozesse Sonden, um besser zu verstehen. Färbung mit lipophilen Farbstoffen ermöglicht die Beobachtung der Membran-Struktur, Visualisierung von Lipid Microdomains und Erkennung von Membran Blebs. Einsatz von Leuchtstoff-d-Aminosäuren (FDAAs), die Standorte der Peptidoglycan Biosynthese Sonde kann mögliche Mängel in Zellwand Biogenese oder Zelle Wachstum Musterung angeben. Nukleinsäure-Flecken können schließlich mögliche Defekte im DNA-Replikation oder Chromosom Segregation angeben. Cyanin DNA Flecken Label lebende Zellen und eignen sich für Zeitraffer-Mikroskopie ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen der Nucleoid Morphologie beim Zellwachstum. Protokolle für die Zelle Kennzeichnung können auf Protein Erschöpfung Mutanten, defekte Membran-Struktur, Zellwand Biogenese oder Chromosom Abtrennung zu identifizieren angewendet werden. Darüber hinaus kann Zeitraffer-Mikroskopie, morphologische Veränderungen zu überwachen, wie ein essentielles Protein entfernt und zusätzliche in Proteinfunktion Einblicke kann verwendet werden. Beispielsweise führt die Erschöpfung der wesentlichen Zellteilung Proteine Filamentierung oder Verzweigungen, die Erschöpfung der Zelle Wachstum Proteine Zellen kürzer oder runder werden verursachen. Hier sind Protokolle für Zellwachstum, Target-spezifische Kennzeichnung und Zeitraffer Mikroskopie bakterielle Pflanzen Pathogen Agrobacterium Tumefaciensvorgesehen. Zusammen ermöglichen gezielt Farbstoffe und Zeitraffer Mikroskopie Charakterisierung der wesentlichen Prozesse in A. Tumefaciens. Schließlich können die Protokolle zur Verfügung gestellt leicht geändert werden, um wichtige Prozesse in anderen Bakterien zu untersuchen.

Target-spezifische Kennzeichnung der Wildtyp A. Tumefaciens Zellen Um zu verdeutlichen, dass Zellmorphologie werden nicht beeinflusst durch das Waschen Stufen oder Behandlung mit 1 % DMSO (die verwendet wird, um die Fluoreszenz-Farbstoffen verdünnen), Zellen wurden direkt von Kultur (Abb. 2A, weit links), nach dem Waschen der Zellen durch abgebildet Zentrifugation wie beschrieben in 1.2 (<strong...

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Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Verständnis der Funktion der wesentlichen Prozesse in Bakterien ist eine Herausforderung. Fluoreszenz-Mikroskopie mit zielgruppenspezifischer Farbstoffe kann wichtige Einblicke in mikrobiellen Zelle Wachstum und Zellzyklus Fortschreiten geben. Hier wird Agrobacterium Tumefaciens als ein Modell-Bakterium verwendet, um Methoden für das live Cell Imaging zur Charakterisierung der wesentlichen Prozesse zu markieren.

Live Cell Fluoreszenzmikroskopie um wesentliche Vorgänge während der mikrobiellen Zellwachstum beobachten

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.8K Aufrufe.  University of Missouri. Verständnis der Funktion der wesentlichen Prozesse in Bakterien ist eine Herausforderung. Fluoreszenz-Mikroskopie mit zielgruppenspezifischer Farbstoffe kann wichtige Einblicke in mikrobiellen Zelle Wachstum und Zellzyklus Fortschreiten geben. Hier wird Agrobacterium Tumefaciens als ein Modell-Bakterium verwendet, um Methoden für das live Cell Imaging zur Charakterisierung der wesentlichen Prozesse zu markieren.

Serie: Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Krebsforschung

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

Fluoreszenz Live Cell Imaging der komplette Vegetative Zellzyklus von langsam wachsenden sozialen Bakterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Biochemie

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biologie

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

Live-Cell Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie Veränderungen in Bakterien

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

Kinetische Visualisierung von einzelzelligen Interspezies-Bakterien-Wechselwirkungen

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...