We thank Stephan Uphoff for discussions. 
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Viele Parameter können während der Zell Elektroporation und die Datenerfassung in Abhängigkeit von dem biologischen System von Interesse und der genauen Art des Experiments (Zellebene oder Einzelmolekülanalyse) variiert werden. Wenn zum Beispiel die Elektroporation von DNA in Bakterien, 0,25 bis 5 pmol der markierten dsDNA-Fragmenten führt zu einer geringen Effizienz der Internalisierung, die eine direkte Detektion von Einzelmolekülen (dh., Ohne die Notwendigkeit einer Photobleich vorher). Vor 5 pmol dsDNA, Zellen dazu neigen, stark belastet werden, eine Regelung für die Einzelzell-Analyse besser geeignet. Alle markierten DNAs sollten zuvor gelgereinigt, um jede Spur von freien Farbstoff zu entfernen (nicht-umgesetzte Fluorophor) von der DNA-Stammlösung. Außerdem potenzielle Probleme mit den DNA-Abbau, insbesondere für smFRET Experimente können mit DNAs mit unnatürliche Nukleinsäuren oder Motive, die Exonuclease-zugänglichen Enden zu schützen, wie Haarnadelschleifen richten. Ein weiterer adjustablE-Parameter in der Elektroporation ist die Feldstärke während der Elektroporation angewendet. Niedriger Feldstärke (~ 1 kV / cm) wird auf einen niedrigen Ladeeffizienz für Einzelmoleküluntersuchungen angemessen zu führen. Höhere Feldstärken (bis zu 1,8 kV / cm) wird die Ladeeffizienz zu steigern; jedoch gibt es eine umgekehrte Korrelation zwischen Feldstärke und die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Elektroporation (siehe Abbildung 4). Zur Bezugnahme ist eine normale Feldstärke für Bakterien und Hefe Elektroporation verwendet ~ 1,5 kV / cm. Die Zeitkonstante, die die Länge dieser Zerfall, ist ein bequemer Parameter zu folgen, da die Zeitkonstante sinkt, sobald eines Bogenphänomens in der Küvette erfolgt. Unter normalen Einstellungen sollte die Zeitkonstante größer als 4 ms ist; niedrigere Werte auf niedrige Ladeeffizienz oder sogar nicht-geladenen beschädigten Zellen führen. Meist electroporators bieten anderen Freiheitsgraden (wie &quot;Impuls Abschneiden&quot; oder &quot;Impulsform&quot;), der zur Abstimmung sowohl modifiziert werden könnenZelle Lade und Lebensfähigkeit. Wir wendeten diese Methode, um sowohl Bakterien und Hefen, jedoch ähnliche Verfahren soll auch die Internalisierung von markierten Biomolekülen in Säugerzellen unter Verwendung geeigneter Elektroporator Einstellungen seit der Membran ist eigentlich weniger komplex (Einzel Lipid-Doppelschicht), und da die Elektroporation bereits mit solchen Zellen verwendet 21. Wenn Internalisierung markierten Proteinen, braucht alle freien Farbstoff aus dem markierten Protein-Stammlösung vor Elektroporation entfernt werden. Freien Farbstoffmoleküle, die aufgrund ihrer kleineren Größe können bevorzugt gegenüber der interessierenden Proteine ​​internalisiert werden, und sind schwierig während der Datenanalyse (trotz ihrer voraussichtlich schneller Diffusion) zu unterscheiden. Als Anhaltspunkt für eine Probe von biologischem markierten Proteins geeignet zur Elektroporation zu sein, sollte die Menge des verbleibenden freien Farbstoffes unter 2% (detektiert unter Verwendung von Fluoreszenzabtastung einer SDS-PAGE) 22. Dieses Verfahren ist besonders wichtig,da einige Moleküle könnten an den äußeren Membranen von Bakterien oder Hefe elektroporiert haften. In dieser Hinsicht sollte die negative Kontrollprobe Fluoreszenzintensität pro Zelle deutlich niedriger als elektroporierten Zellen, idealerweise so niedrig wie der Autofluoreszenz Niveau der leeren Zellen (Zellen, die nicht mit fluoreszenzmarkierten Biomoleküle inkubiert wurden noch elektroporiert, Bild 2) an. Wie bei dsDNA wird der Internalisierung Effizienz markierte Proteine ​​zur Menge der Biomoleküle an die Zellen vor der Elektroporation hinzugefügt verbunden. Aber auch andere Parameter, wie Größe und Ladung, eine Rolle bei der Internalisierung. Kleine Proteine ​​zeigen eine hohe Internalisierung Effizienzen, während größere Proteine ​​(von bis zu 98 kDa) kann erfolgreich internalisiert werden, aber mit geringerer Effizienz (Figur 5) 26. Der isoelektrische Punkt des Proteins, mögliche Wechselwirkungen mit der Zellmembran und anderen physikalisch-chemischen Parametern auchEinfluss Zellbelastung während der Elektroporation. Infolgedessen müssen die Benutzer Experimente für ihre eigenen System zu optimieren, zu wissen, daß eine hohe Anfangskonzentration des markierten Proteins (&gt; 50 uM) die besten Chancen für eine erfolgreiche Belastung ergeben. Elektroporation bietet auch ein neues Werkzeug, um zu stören und zu analysieren, die Zellfunktion durch die Einführung von Proteinen und anderer Biomoleküle in Zellen (entweder markiert oder unmarkiert). Die T7-RNA-Polymerase-Experimente (5C) vorhanden ist, so ein Beispiel für ein Experiment, wo wir ein Molekül, das die Genexpression in vivo unter Verwendung von Elektroporation ändern kann einzuführen. Bei der Durchführung von Einzelmolekülfluoreszenzexperimenten wird TIR Beleuchtungs Regel über andere Beleuchtungsarten bevorzugt, da es die beste Signal-zu-Rausch-Verhältnis durch Erregen nur Fluorophore innerhalb einer dünnen Abschnitt oberhalb der Deckfläche (~ 100 nm). Allerdings Bildgebung markierten Biomolekülen diffundieren in lebenden Mikroorganismen könnte erneuterfordern tiefere Beleuchtung (bis zu 0,8 &amp; mgr; m für E. coli). Tiefere Beleuchtung in HILO Modus erreicht, unter Beibehaltung eines hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Andererseits ist Weitfeldabbildungs ​​besonders wichtig für schrittweises Bleichen Analyse, bei dem der Anwender die Schätzung der Anzahl der Moleküle internalisiert durch Photobleichen eines gesamten belasteten Zelle mit hoher Laserleistung und Dividieren des Anfangszellfluoreszenzintensität durch die einheitliche Intensität erzeugt von einem einzelnen Molekül (single Bleichen Schritt 3). Weitfeld-Bildgebung wird auch für die Langzeit Molekül Verfolgung, um die streuenden Moleküle von Interesse zu lokalisieren, auch erforderlich, wenn ihre Flugbahn decken das gesamte Zellvolumen. In diesem Protokoll präsentieren wir, wie Elektroporation, eine Standardtechnik für Biologen und Biochemikern zur Abgabe von Nukleinsäuren in Zellen, stellt eine einfache Methode zur Bereitstellung von fluoreszierenden Biomolekülen in verschiedenen Zelltypen. Thist neu, bietet Hochdurchsatz-Technik ein einzigartiges Werkzeug, um markierte Moleküle in ihrer natürlichen Umgebung zu beobachten. Zusätzlich Biomolekülen mit Fluorophore mit einem breiten Spektrum von Wellenlängen gekennzeichnet, die Elektroporation können Moleküle mit vielen chemischen Gruppen, wie unnatürliche Nukleotide und Aminosäuren, Metallchelatoren, Vernetzer und Käfighaltung Gruppen modifiziert zu liefern. Wenn das biologische System in der Umgebung ist nicht wesentlich für die Zellentwicklung, kann das Gen-Kodierung für das Zielprotein ebenfalls gelöscht (oder zerlegt), so dass die nach Internalisierung beobachtet Proteine ​​stellen alle (oder die meisten) der intrazellulären Proteinpool . Im Wesentlichen kann die Elektroporation &quot;Transplantation&quot; die Flexibilität des In-vitro-Biokonjugate in lebende Zellen und damit profitieren Bemühungen in der Synthetischen Biologie, Systembiologie und In-vivo-Detektion von Einzelmolekülen.

Die meisten Fluoreszenzuntersuchungen in lebenden Zellen hängen von Proteinfusionen mit fluoreszierenden Proteinen (FRP), wie GFP 1. Diese fluoreszierenden Tags erlauben Untersuchungen der Kopienzahl, Diffusionsmuster oder Lokalisierung von Proteinen in Prozesse wie die Genexpression oder Membrantransport 7.2 beteiligt. Rahmenprogramme bieten eine hohe Kennzeichnungs Spezifität, einfach implementiert werden und sind in einem großen Bestand an Varianten mit unterschiedlichen photophysikalischen und chemischen Eigenschaften 1 zur Verfügung. Allerdings bleiben organische Fluorophore die erste Wahl für die in vitro durch ihre größere Fotoexperimente (bis zu 100-mal stabiler als RP) 8,9, geringe Größe (bis zu 100-fach geringeres Volumen als RP) und die einfache intramolekulare Kennzeichnung (vor allem durch die Verwendung von Cystein-Resten). Alle diese Faktoren sind besonders wichtig für die Einzelmolekül-Fluoreszenz und FRET untersucht 10. Mehrere Internalisierung Methoden combining die Vorteile von Bio-Kennzeichnung und in-vivo-Nachweis haben sich im letzten Jahrzehnt eingeführt wurden; aber solche Methoden entweder beschäftigen relativ große Polypeptide Tags (zB TMP, Halogen oder 20 kDa SNAP Tags) von 11 bis 14, erfordern die Verwendung von unnatürlichen Aminosäuren 15 oder an großen, Single-Membran eukaryotischen Zellen beschränkt (z. , Scrape Loading, Spritze Belastung, Mikroinjektion) 16-19. Dieses Protokoll beschreibt eine neue, einfache und Hochdurchsatz-Verfahren Verinnerlichung, dass Paare die Vorteile organischer Fluorophore mit in vivo Beobachtung. Um diese Technik zu entwickeln, passten wir die Elektroporation Verfahren häufig verwendet, um Zellen mit Plasmid DNA 20,21 um Mikroorganismen, wie E. laden Transformations coli oder S. cerevisiae mit organisch markierten Biomolekülen. Das Protokoll besteht aus 4 Schritten: Inkubation von Zellen mit markierten BiomoleküleElektroporation, Zellgewinnung und Zellwasch auf nicht verinnerlicht Biomolekülen zu entfernen. Hier präsentieren wir dieses Elektroporation Protokoll, sowie die Cell Imaging und Datenanalyseverfahren, um zellbasierte und Einzelmolekül-Fluoreszenz zu studieren und FRET-Signale. Elektroporation beruht auf Entladen eines elektrischen Hochspannungsfeld in einer niedrigen Ionenstärke Zellsuspension transienter Membranporen durch die Biomoleküle Zellen eindringen (Figur 1) 20,21 bilden. Genau wie bei Transformation von Bakterien oder Hefe, die mit Plasmid-DNA, haben Zellen vor der Elektroporation ihre electrocompetency zu gewährleisten, hergestellt werden. Dieses Verfahren, das aus mehreren Waschschritten mit Wasser, erhöht die Durchlässigkeit der Membran und verringert die Ionenstärke der Zelllösung, um Überschlagen im Elektroporationsküvette vermeiden. In diesem Protokoll können Zellen, wie unten beschrieben (siehe PROTOCOL: 1,1), hergestellt werden oder von kommerziellen Anbieter gekaufts. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Internalisierung Protokoll Von links nach rechts:. Es werden einige Mikroliter der markierten Biomolekülen auf das Aliquot elektrokompetenter Zellen (doppelt markierte DNA-Fragmente und Bakterien in diesem Beispiel); Inkubation 1 bis 10 Minuten auf Eis und Transfer in ein vorgekühltes Elektroporationsküvette; elektroporieren und fügen 0,5-1 ml Vollmedium zu den Zellen unmittelbar nach; Inkubieren bei 37 ° C (oder der durch den Organismus erforderliche Temperatur, beispielsweise 29 ° C für Hefe) die Zellen zu gewinnen lassen; 5 Waschschritte durchführen, um überschüssige nicht internalisierte markierten Moleküle zu entfernen; resuspendieren endgültige Pellet in 100-200 ul PBS-Puffer und Pipette 10 ul auf einem Agarose-Pad; decken Sie das Pad mit einem Deckglas reinigen und Bild auf einem Fluoreszenzmikroskop (in Weitfeld-Modus oder HILO-Modus). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Elektrokompetente Zellen mit den markierten Biomoleküle nur vor der Elektroporation, die Verwendung von Standard electroporators in den meisten biochemischen Laboratorien durchgeführt werden kann, inkubiert. Unmittelbar nach der Elektroporation werden die Zellen in einem reichen Medium, das die Wiederherstellung vor der Wäsche (1) inkubiert. Der Überschuß an nicht internalisierte markierten Biomolekülen wird zuerst durch Waschen in einem Puffer, der eine ziemlich hohe Salzkonzentration und eine Reinigungsmittel entfernen (siehe PROTOKOLL: 3,3). Die Anwesenheit von Salz stört unspezifische elektrostatische Wechselwirkungen von nicht internalisierte markierten Biomolekülen, die sonst auf der äußeren Membran haften gebildet. Auch die Gegenwart von Detergens in der Waschpuffer stört unspezifische hydrophobe Wechselwirkungen. Während DNA-Internalisierung ist unkompliziert (Abbildung 2), als Internalisierungsfaktor markierten Proteine ​​unter Verwendung von Elektroporation die ergriffen werden müssen Vorsichtsmaßnahmen. Erstens könnte die Aktie Probe organisch markierten Proteins noch eine geringe Prozentsatz an freiem Farbstoff. Freien Farbstoffmoleküle sind viel kleiner als Proteine ​​und könnte daher bevorzugt internalisiert werden. Um sicherzustellen, dass die überwiegende Mehrheit der beobachteten internalisiert fluoreszierenden Molekülen zu dem Protein von Interesse entspricht, sollte die anfängliche Proteinprobe weniger als ~ 2% enthalten freie Farbstoff (5) 22. Der Überschuß an nicht internalisierte markierten Proteine ​​können auch an der äußeren Zellmembran nach der Elektroporation kleben; Dieses Phänomen ist proteinspezifische und muss für jede neue Protein kontrolliert werden. Wir schlagen vor, mehrere Optionen, die die Entfernung von nicht internalisierte Proteine ​​aus der geladenen Zellprobe zu ermöglichen (siehe PROTOKOLL: 3.3.3). Schließlich werden die Zellen in einem kleinen Volumen von Phosphatpuffer pipettiert und auf einem Agarose-Pad, wodurch die Abbildung auf einem Fluoreszenzmikroskop. Immobilisierung auf Agarose-Pads ist ein simple und effiziente Art der Bildgebung von Zellen auf einem Deckglas ohne Schädigung ihrer Integrität. Die Unterlage sollte eine niedrige Fluoreszenzkulturmedium enthalten. Cell Imaging kann entweder im Weitfeld, Totalreflexions-Fluoreszenz (TIRF) oder über HILO (stark geneigt und laminierte optische Sheet) Mikroskopie durchgeführt werden. Im HILO Konfiguration dringt der Laserstrahl tiefer in die Probe als im TIRF, noch nicht die gesamte Probe wie für Weitfeld zu beleuchten, so dass ein größeres Signal-zu-Rausch-Verhältnisses 23. In Abhängigkeit von der Laserleistung und Zeitauflösung verwendet wird, kann verinnerlicht Biomoleküle angerechnet werden (mit Hilfe schrittweise Photobleaching-Analyse, Abbildung 3), lokalisiert oder verfolgt 24-28. Internalisierung von doppelt markierten Konstrukte mit einem FRET-Paar von Fluorophoren erlaubt die Quantifizierung von FRET sowohl auf Einzelzelle oder der Einzelmolekülebenen (Abbildung 6). Verschiedene Parameter können variiert werden,abhängig von der gewünschten Leistung und dem biologischen System untersucht. Erstens kann die Menge des Materials pro Zelle internalisiert durch Verändern der Konzentration von markierten Biomolekülen zugegeben, um die Zellen vor der Elektroporation (2) eingestellt werden. Elektroporation Feldstärke wird auch beeinflussen sowohl die Ladeeffizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen; wie erwartet, während die Ladeeffizienz erhöht sich mit zunehmender Feldstärke, die Lebensfähigkeit der elektroporierten Zellen ab (4A). Beide Parameter können durch Aufzeichnung der Prozentsatz der belasteten und sich teilenden Zellen nach der Elektroporation zu quantifizieren. Diese Lebensfähigkeitstest in Verbindung mit Fluoreszenz-Bildgebung überprüft auch die Beobachtung von verinnerlicht Biomoleküle in lebenden Zellen und ermöglichen eine kontinuierliche Beobachtung über mehrere Generationen (4B). Zusammenfassend lässt dieses Protokoll die Internalisierung von fluoreszenzmarkierten DNA-und Proteinmoleküle inE. coli oder S. cerevisiae 26. Einzelmoleküle mit organischen Fluorophoren markiert mit hoher Raum-Zeit-Auflösung für Zeitskalen eine Größenordnung länger als RP verfolgt werden. Schließlich ist dieses Verfahren mit Weitfeld, TIRF und konfokale Detektion sowie gepulste Anregung Systeme wie ALEX (Wechsellaseranregung 28,29) kompatibel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:321px;">ElectroMax DH5-alpha Comptent cells</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11319-019</td>
			<td>or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">EZ Rich Defined Madia</td>
			<td style="width:227px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">M2105</td>
			<td>low fluorescence rich media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporation Apparatus&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100</td>
			<td>or any classical electroporator for microorganism transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Certified Molecular Biology agarose</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:321px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td style="width:227px;">Menzel</td>
			<td style="width:119px;">BB024060SC</td>
			<td>remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Single-molecule fluorescence microscope</td>
			<td style="width:227px;">Home-built</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>described in REFs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Localization software</td>
			<td style="width:227px;">Custom-written, available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Tracking software</td>
			<td style="width:227px;">Available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB implementation by Blair and Dufresne.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

internalization and observation of fluorescent biomolecules in living microorganisms via electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Probenvorbereitung Die verschiedenen Stufen des Protokolls sind als Schaltbilder in Abbildung 1 dargestellt. Als ein Beispiel, das Laden von Bakterien, die mit doppelt markierte (Donor und Akzeptor-Farbstoffe) DNA-Fragmente dargestellt wir. Repräsentative Ergebnisse für DNA-Internalisierung sind in Abbildung 2 dargestellt. Für jedes elektroporiert Probe wurden Daten für Leerzellen und Nicht-elektroporierten Zellen ebenfalls aufgezeichnet (Figur 2). &quot;Leere Zellen&quot; entsprechen weder Zellen mit fluoreszierenden Biomolekülen noch elektroporiert inkubiert elektro; deren Intensität in dem Fluoreszenzkanal reflektiert das Autofluoreszenzpegel unter identischen experimentellen Bedingungen (Laserleistung, Zeitauflösung, Temperatur, etc.). &quot;Non-elektroporierten Zellen&quot; (auch -EP, dh minus EP) entsprechen einer negativen Kontrolle, bei der elektrokompetenten Zellen mit dem fluoreszierenden biomolec BebrütenModule aber nicht elektroporiert. Diese nicht-elektroporierten Zellen sollte einen Fluoreszenzniveau ähnlich der Autofluoreszenz der leeren Zellen und signifikant niedriger ist als die Fluoreszenzintensität, die durch geladene, elektroporierten Zellen dargestellt aufweisen. Dies bestätigt die Entfernung von irgendwelchen nicht internalisierte markierten Biomolekülen, die an die äußere Zellmembran angeklebt sein können. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig2.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse für die Internalisierung von dsDNA mit verschiedenen Fluorophoren in Bakterien bezeichnet in verschiedenen Konzentrationen (AE) und Hefe (F) Von links nach rechts:. Weißlicht, Fluoreszenz und Overlay-Bilder. - / + EP bezeichnet Inkubation ohne / mit Elektroporation. Maßstabsbalken: 3 um. A. Cy3B dsDNA, 10 pmol, E. coli. B. ATTO647N dsDNA, 10 pmol, E. coli. C. Alexa647 dsDNA, 5 pmol, E. coli. D. Cy3B dsDNA, 100 pmol, E. coli. E. ATTO647N dsDNA, 100 pmol, E. coli. F. ATTO647N dsDNA, 30 pmol, Hefe. Diese Zahl hat sich von der Referenz 26 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52208/52208fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Zählen der Anzahl von verinnerlicht Biomolekülen pro Zelle Das Verfahren, um die Anzahl von internalisierten markierten Biomolekülen pro Zelle unter Verwendung von Photobleich Analyse ist in Abbildung 3 und Ergänzungs Movie 2 dargestellt abzuschätzen, zusammen mit verschiedenen Konzentrationen von markierten DNA erhaltenen Ergebnisse repräsentativ. Zelle Ladewirkungsgrad steigt mit der Ausgangsmenge an inkubiert markierter DNA, so dass der Anwender die Feineinstellung der Anzahl der markierten Moleküle pro Zelle von einer &quot;Einzelmolekül&quot; Niveau (&lt;10, Ergänzender Film 2B) zu einem &quot;Ensemble&quot; Niveau (&gt; 10 , Ergänzender Film 2A). Eine robuste Möglichkeit zur Schätzung der Prozentsatz der geladenen Zellen to zählen die Anzahl der elektroporierten Zellen, die eine Zellstärke über dem mittleren Zellenintensität nicht elektroporierten Zellen plus 3-fache ihrer Standardabweichung (dh, Av (I-EP) + 3 * StdDev (I-EP), wobei Av = mittel, I = Intensität pro Pixel, Std. Abw. = Standardabweichung und -EP = nicht elektroporiert), wie in Abbildung 3 dargestellt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig3.jpg" /> Abb. 3: Zählen der internalisierte Moleküle mit Photobleaching-Analyse (A) Einzellige Photobleaching-Analyse. Beispiele für Fluoreszenzintensität timetraces (blau: Rohdaten; rot: fit, Einlässe: WL und Fluoreszenzbilder von E. coli mit ATTO647N markierten dsDNA geladen vor und nach dem Bleichen). Oben: Ein-Schritt-Bleich Veranstaltung. Mitte: Zelle mit ± 3 Moleküle, die Bleichund blinkt. Unten: cell&gt; 10 Schritte, die mindestens 10-Moleküle (B) Histogramm der Einzelschritthöhe Intensitäten von einem automatisierten Schritt Anpassungsalgorithmus aus 57 Zellen, die weniger als 6 unterscheidbare Schritte.. Einzel-Gaußsche Anpassung wird bei 11 ± 3 au zentriert ist, entsprechend einem einheitlichen Fluorophor Intensität von 8100 Photonen pro Sekunde. Der Stern markiert die Behälter dem Sammeln aller Stufenhöhen größer oder gleich 50 au (C) Histogramm der internalisierten Moleküle pro Zelle, die mit unterschiedlichen Mengen an ATTO647N dsDNA, nach dem Aufteilen des Anfangsfluoreszenzintensität durch die einheitliche Fluorophor Intensität berechnet elektroporiert. Von oben nach unten: leere Zellen (dh nicht mit fluoreszierenden Molekülen inkubiert und nicht durch Elektroporation), nicht durch Elektroporation (aber mit fluoreszierenden Molekülen namens -EP inkubiert) und elektroporierten Zellen mit 10 und 100 pmol dsDNA (Namen + EP) inkubiert. Leere und nicht elektroporierten Zellen entsprechenum Autofluoreszenz, während elektroporierten Zellen zeigen eine breite Verteilung der verinnerlichten Moleküle, mit einem höheren Anteil an hoch belasteten Zellen bei 100 pmol (≥ 4 Moleküle finden Sternchen markierten bin). Internalisierung Effizienz (Fraktion von Zellen, die mit Int.&gt; Mittelwert + 3x Std. Dev. Nicht -EP Probe) für die 10 und 100 pmol Proben betrug 94% bzw. 90% betrugen. Die mittlere Anzahl der verinnerlichten Molekülen pro Zelle: 121 ± 106 Moleküle für 10 pmol dsDNA und 176 ± 187 Moleküle für 100 pmol dsDNA. Einstellungen: 100 ms Belichtung, Weitfeldbeleuchtung. Maßstabsbalken: 1 um. Diese Zahl hat sich von der Referenz 26 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52208/52208fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Zell Be- und Rentabilität Neben der Änderung der Menge des markierten Biomoleküle vor der Elektroporation zu den Zellen gegeben, dieAnwender können noch die Menge der Moleküle internalisiert, indem Sie verschiedene Feldstärken bei der Elektroporation (Abbildung 4, Zusatz Film 1). Höhere Feldstärken führen zu mehr Effizienz Internalisierung, führen aber zu einem leichten Rückgang der Lebensfähigkeit der Zellen. Für die Protein Internalisierung kann die Verwendung eines Filtrationsschritt zur Beseitigung von nicht internalisierte markierten Proteinen (siehe 3.3.3.1.1). In solchen Fällen sorgt Zellfiltration daß beobachteten fluoreszierenden Proteinen sind in der Tat innerhalb des bakteriellen Zytoplasma internalisiert; wir weisen Sie jedoch darauf, dass die Filtration hat auch einen negativen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen (für weitere Einzelheiten siehe REF 22). <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig4.jpg" /> Abbildung 4: Einfluss der Elektroporation Spannung beim Laden und Zelllebensfähigkeit (A) Balkendiagramm, das die Wirkung der Elektroporation Feldstärke zum Einlegen effic.iency (rote Balken) und Lebensfähigkeit der Zellen (grüne Balken). 84 ± 8% des nicht elektroporierten Zellen (0 kV / cm) Spaltung nach 1 h auf einem Agarose-Pad bei 37 ° C. Unter den gleichen Bedingungen, 78 ± 3% und 49 ± 3% der Zellen bei 0,9 kV / cm und 1,8 kV / cm elektroporiert dividieren nach 1 Stunde. Für Beladungseffizienz sind 73 ± 8% der Zellen bei 0,9 kV / cm geladen, 92 ± 6% der Zellen werden bei 1,8 kV / cm geladen. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung aus drei unabhängigen Messungen berechnet; mehr als 200 Zellen wurden für jede Probe und jeder Wiederholung analysiert. Insgesamt Ladeeffizienzsteigerungen mit Elektroporation Spannung der geringen Kosten der Lebensfähigkeit der Zellen. (B) Zellbasierte Fluoreszenzmessungen über mehrere Generationen zu zeigen, dass die Gesamtfluoreszenzintensität wird gleichmäßig auf beide Tochterzellen weitergegeben. Zelle 1 und 2 bezieht sich auf die Anzahl von Zellen in der Weißlichtbild (links) und Fluoreszenzbild zum Zeitpunkt t = 0. MaßstabBar: 1 um). Diese Zahl hat sich von der Referenz 26 modifiziert. Protein Internalisierung Repräsentative Ergebnisse für Protein Internalisierung sind in den 5A &amp; B. Es ist besonders wichtig, so viele der restlichen freien (nicht umgesetzten) Farbstoff aus der Proteinprobe wie möglich vor der Elektroporation zu entfernen. In den Beispielen in den Figuren 5A und B, die Cy3B markierten Klenow Fragment Probe (Cy3B-KF, wobei KF ist das Klenow-Fragment der E. coli DNA Polymerase I, 66 kDa) enthält nur 1% freien Farbstoffes; solche Farbstoff Beitrag zur Gesamtzellenbelastung ist vernachlässigbar. Vergleiche der elektroporierten interessierende Probe sowohl mit der nicht-elektroporierten Zellen (mit der gleichen Menge an markiertem Protein inkubiert werden), sowie Zellen, die mit der äquivalenten Menge des freien Farbstoffs elektroporiert bilden zwei erforderlichen Kontrollen, um sicherzustellen, dass die beobachteten Fluoreszenzmolekületatsächlich verinnerlicht markierten Proteine. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig5.jpg" /> Abbildung 5: Protein Internalisierung in lebenden Bakterien (A) Vertreter Fluoreszenzüberlagerungsfeld von Ansichten.. Zellen bei 1,4 kV Spannung elektroporiert mit 50 pmol RNAP ω-Untereinheit aus einem Protein-Stammlösung, die nur 1% kostenlos CY3B Farbstoff enthalten. Nicht elektroporiert (nicht -EP) und leere Zellen wie zuvor definiert sind. Freien Farbstoffs wurde in der gleichen Konzentration wie in der RNAP ω elektroporiertem Probe internalisiert. Imaging in weiten Feldmodus mit 532 nm Anregung bei 1 mW, 50 ms Expositions. (B) Verteilung unkorrigierter Zelle gemittelte Intensitäten für Proben in (A), im Verhältnis des Gesamtzellzahl angegeben. Mehr als 400 Zellen pro Probe wurden segmentiert. Diese Zahl hat sich von der Referenz 22 geändert wurde. (C) Internalisierung von UNLABeled T7 RNA-Polymerase (T7 RNAP, 98 kDa) in elektro DH5a tragenden pRSET-EmGFP kodierendes Plasmid smaragd GFP (EmGFP) unter der Kontrolle eines T7-Promotors. Links: Schematische Darstellung des Assays. Mitte: Fluoreszenz-Overlay. Rechts: Histogramme der Zellbasis Fluoreszenzintensitäten für die nicht-elektroporiert Probe (oben) und die Zellen inkubiert und mit T7 RNAP (unten) elektroporiert; ca. 11% der elektroporierten Zellen zeigen hohe Fluoreszenzintensität (Anteil der Zellen mit Int.&gt; Mittelwert + 3x Std. Abw. von nicht -EP Probe), die die Expression von EmGFP. Die Sternchen zeigen Körbe Erfassung aller Intensitäten größer oder gleich 1.100 au Maßstabsbalken: 3 um. Diese Zahl hat sich von der Referenz 26 modifiziert. 5C stellt eine weitere Anwendung der Protein Elektroporation. Hierbei ist die elektroporierten Protein unmarkierten, aber ihre Internalisierung triggert beobachtbares Fluoreszenzsignal. Es zeigt sich, das vorgeSinn und Funktionalität elektroporiert Proteine ​​im Zytoplasma der Zelle. Unmarkiertem T7 RNA Polymerase (98 kDa) wurde in E. internalisiert coli Stamm DH5a enthält unter der Kontrolle eines T7-Promotors 26 ein Plasmid, das für eine fluoreszierende Protein EmGFP. Da das Gen für T7 RNA Polymerase in DH5a abwesend EmGFP Expression in unseren Experimenten erfordert, dass funktionelle T7 RNA Polymerase wird mittels Elektroporation (5C) in die Zellen eingeführt. Nach Elektroporation mit 1 pmol T7 RNAP,&gt; 11% der Zellen (blau bar, 5C) zeigte Fluoreszenz höher als die Negativkontrolle (mit der gleichen Menge an T7 RNAP inkubiert, aber nicht durch Elektroporation). Dieses Ergebnis legt fest, dass ein Teil der T7 RNAP Molekülen durch Elektroporation internalisiert behalten ihre Integrität in vivo und können ihre beabsichtigten Funktionen in das Cytoplasma der Zelle durchzuführen. In-vivo-FRET an der Einzelmolekül-und Single-Cell-Ebenen Schließlich wird die Internalisierung und Analyse der doppelt markierten Spezies in lebenden Bakterien in 6 und Ergänzungs Film 3 dargestellt als Fluoreszenzproteinfusionen sind nicht ideal für in vivo Studien smFRET, ist die Möglichkeit, doppelt markierten Biomolekülen in lebende Zellen zu liefern unter Verwendung von Elektroporation einer der großen Vorteile dieses Verfahrens. 6A stellt Single-Cell-FRET-Analyse der Bakterien mit unterschiedlichen FRET-DNA-Standards (mit Cy3B und ATTO647N Fluorophore als Donor-Akzeptor-FRET-Paar) geladen. Die Zellen werden mit 20 pmol von drei kurzen doppelt markierte dsDNA FRET Standards FRET Effizienzen (E *) von 0,17, 0,48 elektroporiert, und 0,86 in vitro (vorher bestimmten 26). Alle DNA in die Zellen effizient (6A, links) und der Hauptpeak jeder einzellige E * Verteilung stimmt gut mit den in-vitro-Ergebnisse (6A, Rechts). In den mittel- und hoch FRET Proben, Zellpopulationen mit niedrigeren E * als erwartet beobachtet, vermutlich aufgrund einer Kombination von Akzeptorbleichen und photophysikalischen Inaktivität variable Zellenbelastung (also variable Signal-zu-Rausch-Verhältnis) und den DNA-Abbau . <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig6.jpg" /> Abb. 6:. Repräsentative Ergebnisse für Einzelzellen-und Einzelmolekül-FRET-Beobachtung in lebenden Bakterien Ensemble und smFRET Studien in einzelnen Bakterien (A) Analyse der Zellen mit 20 pmol jedes der drei DNA-FRET-Standards beladen eine niedrige (~ 0,17) Zwischen (~ 0,48) und hohen (~ 0,86) FRET (gemessen unter Verwendung von in vitro Einzelmolekülmessungen, siehe REF 26). Links: weißes Licht und grün / rot (FRET) Fluoreszenz-Overlay-Bilder (Maßstabsbalken: 3 um). Beispiele für FRET Werte aus verschiedenen Zellen angegeben (weiß). Ausrüstung<html> ht (oben nach unten):. unkorrigierte zellbasierten FRET (E *) Histogramme für Spender nur (dunkelgrün), niedrig (hellgrün), Mittelstufe (gelb) und hoch (rot) FRET-DNA-Standards (B-D) In vivo smFRET. Die Zellen werden mit 0,25 pmol Zwischen-FRET-DNA (Feld B), 0,25 pmol High-FRET-DNA (Panel C) geladen und 5 pmol doppelt markierte KF (Panel D). Linke Spalte: grün / rote Fluoreszenz Überlagerung der Einzelbild vor und nach der Akzeptor-Photobleichen. Mittlere Spalte: Zeit Spuren entsprechend dem Molekül in der gelben Kreis. FRET Effizienz, Geberemissionsintensitäten und Akzeptor-Emissionsintensitäten sind in blau, grün und rot dargestellt sind. Rechte Spalte: FRET-Histogramme der Spender nur Moleküle (grün) und Donor-Akzeptor-Moleküle (gelb, rot und grau) von 20 Zeitspuren für jede Probe. Maßstabsbalken: 3 &amp; mgr; m für die A, 1 &amp; mgr; m für die B-D. Diese Zahl hat sich von der Referenz 26 modifiziert.208fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Um smFRET in vivo für DNA- oder Proteinproben, geringe Mengen (0,25 pmol) von Mittel- und Hoch FRET DNA-Standards (6B, C) ​​oder 5 pmol doppelsträngiger markierter KF (Alexa647 / Cy3B Fluorophore als FRET-Paar, Fig beachten 6D) in E. elektroporiert coli. Solche Konzentrationen führte zu vielen Zellen mit wenigen (n = 1-10) markierten Moleküle geladen werden, die eine direkte Lokalisierung, Verfolgung und Überwachung von FRET für einzelne Moleküle. Einige Moleküle diffundieren frei, während andere unbeweglich erscheinen oder langsam diffundieren (Ergänzende Movie 3). Timetraces immobilisierter doppelt markierte Biomoleküle (Abbildung 6, Mitte) dauern 1 bis 30 s und zeigen die Handschrift der smFRET: antikorreliert Veränderungen in der Donor und Akzeptor Fluoreszenz nach Akzeptorbleichen (zB t ~ 16 sec; 6B, Mitte ), gefolgt von Einzel-Schritt Donor Bleichmittel (beispielsweise t ~, 19 sec; 6B). FRET Ausschüttungen aus solchen timetraces (Abbildung 6, rechts) führen zu einem Mittelwert, der in sehr guter Übereinstimmung mit in-vitro-Studien 26,31,32 veröffentlicht erzeugt. Diese Ergebnisse stellen die Fähigkeit zur quantitativen smFRET Studien über internalisiert DNAs und Proteine, und lassen vermuten, dass Proteine ​​behalten ihre Integrität und Struktur bei der Elektroporation und Internalisierung (wie durch die T7 RNAP Internalisierung Experimente unterstützt). Ergänzende Film. 1: Zelllebensfähigkeit Links: Weißes Licht Bilder. Rechts: Fluoreszenzbilder. Animated GIF animiert, die die Teilung nach der Elektroporation (1,8 kV / cm) von Bakterien mit 10 pmol Atto647 markierte DNA geladen. Die scheinbare Gesamt Abnahme der Fluoreszenz aufgrund der Verdünnung des markierten DNA auf die Zellteilung und auch teilweise auf die Photozerstörung, die während jedes auftrittMessung. Ergänzende Movie 2: Zellbasierte Ausbleichen Studien A.. Repräsentative Beispiel für eine stark belastete Zelle (mit&gt; 100 ATTO647N-markierten DNA-Moleküle). Oben links, weißes Licht Bild der Zelle von Interesse (rotes Rechteck). Rechts oben, Film der beladenen Zellen, die ihre Fluoreszenzzerfall über mehrere Minuten. Unten, Zeitverlauf der Gesamtfluoreszenzintensität Zerfall der Zelle von Interesse. Organische Fluorophore weisen Photobleaching Lebensdauer 2 Größenordnungen höher als die FRP (hier ~ 41 sec für ATTO647N). B. Repräsentative Beispiel für eine Zelle, die mit weniger als 10 markierte Moleküle (3 in diesem Fall) geladen. Top, identisch mit der Abdeckung A. Unten, Zeitverlauf der Gesamtfluoreszenzintensität der Zelle von Interesse, die einzelnen Schritt Bleichen und / oder blinken entsprechend einzigen organischen Farbstoffen. Die durchschnittliche Höhe dieser Stufen entspricht der Einzelmolekül einheitlichen Intensität (hier ~12 au) verwendet, um die Anfangszahl der verinnerlichten Molekülen pro Zelle zu schätzen. Filme im Dauer roten Laseranregung bei 300 &amp; mgr; W Leistung und 100 ms pro Frame. Ergänzende Movie 3: I n vivo Einzelmolekül-FRET-Top:. Zellen mit 0,25 pmol High-FRET-DNA (wie in Abbildung 6C) kontinuierlich bei 50 ms pro Bild unter nTIRF Beleuchtung überwacht mit 1 mW Grün (532 nm) Laser geladen. Jeder Rahmen ist ein grün / rot (FRET) Fluoreszenzüberlagerung der einzelnen Kanäle. Diffundiert und unbeweglich rot (intakt) und Grün (einzelnes aktives Label) DNA-Moleküle zu beobachten. Unten: Zeit Spur entsprechend dem Molekül in der gelben Kreis. FRET Effizienz, Geberemissionsintensitäten und Akzeptor-Emissionsintensitäten sind in blau, grün und rot dargestellt sind. Anti-Korrelation Akzeptorbleichen Ereignis (rot nach grün Gänge) entspricht der Unterschrift der Einzelmolekül-FRET.

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Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.7K Aufrufe.  University of Oxford. Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Serie: Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Elektroporation von Mykobakterien

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Forschung

Biologie

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

Überwachung des Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen unter Verwendung eines Degron (DGN)-destabilisiert Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

Protein WISDOM: A Workbench für<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Aufbau von Biomolekülen

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Tracking-Drug-induzierte Veränderungen der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel durch Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Beobachtung und Quantifizierung der Paarungsverhalten in der Pinewood Nematode,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...