Diese Studie wurde unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). Die Autoren möchten Axel Erhardt für die Durchführung der Großteil der Dissektion und hilfreiche Vermittlung dieses Wissens und Dr. Volker Eckstein für die Unterstützung bei den technischen Aspekt der das Durchflusszytometer danken.

Wildtyp C57BL/6 Mäusen (Männchen; 10-12 Wochen) wurden in standard 12 h hell/dunkel-Zyklus gehalten und wurden standard Chow Ernährung und Wasser kostenfrei zur Verfügung gestellt. Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den einschlägigen Leitlinien der lokalen Animal Care und Einsatz hat und durch die lokalen Animal Care and Use Committee bei der regionalen Behörde in Karlsruhe, Deutschland (G216/10) genehmigt.
(1) Perfusion der Maus
<ol><li>Opfer der Maus (C57BL/6; Männchen; 10-12weeks) mit CO2 oder gemäß den örtlichen Vorschriften. Hinweis: Retro-Orbital Blutungen kann durchgeführt werden um Kontrolle Leukozyten, mit 1,5 mL EDTA-beschichtete Rohre zu erhalten. Diese Methode der Blutung ist sofort nach dem Opfer nur effizient. Weitere, peritoneal Hohlraum Lavage (PCL) kann durchgeführt werden, um zu erhalten Kontrolle Makrophagen, mit vorgewärmten PBS bei 37 ° C zu kalt Agglutination des Blutes, vermeiden die Durchblutung behindern kann.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Maus durch Besprühen das Fell auf dem Bauch großzügig mit 70 % V/V Ethanol und immer wieder abwischen mit einem Tuch mit Baumwolle Gaze. Mit einer stumpfen Schere, schneiden Sie die Bauchhaut durch eine longitudinale Inzision.</li>
	<li>Setzen Sie den pleuralen Raum von ersten macht einen Schnitt in das Zwerchfell mit gebogenen, stumpfe Scheren und dann Ausweitung des Schnittes über die gesamte Länge des Brustkorbes. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt auf der kontralateralen Seite, bis das Brustbein entfernt vorsichtig gehoben werden kann.</li>
	<li>Mit einem klaren Blick des Herzens und der großen Gefäße einfügen ein Schmetterlings 23¾ gauge Nadel, verbunden mit einer 50 mL-Spritze mit eiskaltem PBS in die linke Kammer des Herzens gefüllt.</li>
	<li>Einen Einschnitt in den rechten Vorhof des Herzens mit Iris-Schere so groß von einer Steckdose wie möglich zu erstellen, ohne Beschädigung der absteigenden Aorta, und dann drücken Sie vorsichtig die Spritze ca. durchsetzen 30 mL PBS. Das Exsudat sollte klar ausgeführt werden. Die Rodung von Leber und/oder Nieren kann als Indikator für eine gute Durchblutung verwendet werden.</li>
</ol>2. Präparation des n. ischiadicus und DRG
Hinweis: Für die Zerlegung des Ischias-Nerven positioniert die Haut über den Gluteus Maximus entfernt wird und die Maus ist Bauchseite nach unten während aus den unteren Extremitäten ausdehnen.
<ol><li>Bilateral sezieren Sie die ganze Ischias Nerven durch die Trennung des Muskelgewebes vom dorsalen Oberschenkel, und verfolgen Sie den Nerv entlang der Wirbelsäule. Schneiden Sie die Nerven, wo es aus der Wirbelsäule und unmittelbar oberhalb des Knies am anderen Ende austritt. Hinweis: Vermeiden Sie übermäßige Handhabung des Nervs z. B. zerkleinern oder mit der Pinzette ziehen.</li>
	<li>Mit Pinzette, übertragen Sie die ausgeschnittenen Nerve(s), ca. 2 cm pro Nerv zu einer 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL eiskaltem PBS und Shop auf Eis. Hinweis: Die Nerven kann über Nacht auf Eis gespeichert werden. Hinweis: Für die DRG-Dissektion mit Pinzette und Skalpell, lösen Sie die Haut von der darunter liegenden Weichteile durch sanft abziehen die verbliebene hintere Haut um den zervikalen, thorakalen und lumbalen Wirbelsäulen Regionen verfügbar zu machen. Entfernen Sie den Kopf durch Schneiden an der Basis des Schädels mit einer stumpfen Schere.</li>
	<li>Schneiden Sie die Rippen parallel mit und in der Nähe der Wirbelsäule auf beiden Seiten, bevor trennen die Eingeweide an der vorderen Seite der Wirbelsäule verbunden. Schneiden der Oberschenkelknochen und die Wirbelsäule durch eine quer geschnitten auf der Ebene der Oberschenkelknochen entfernen. Mit Iris-Schere, schneiden Sie alle Muskel-, Fett- und andere Weichteile von der Wirbelsäule.</li>
	<li>Legen Sie die Wirbelsäule mit der dorsalen Seite nach oben und öffnen Sie sie, beginnend am kaudalen Ende, indem Sie schieben ein Tipp der Schere in den Wirbelkanal auf 03:00-Position und den Knochen Schnitt. Wiederholen Sie den Vorgang an die 09:00-Position. Hinweis: Es ist wichtig, genau in der Mitte um eine Beschädigung der DRG zu schneiden.</li>
	<li>Wiederholen Sie das Schneiden von einer Seite zur anderen, bis das rostral Ende erreicht wird und das Rückenmark vollständig ausgesetzt. Eine Dissektion Mikroskop, entfernen Sie das Rückenmark, die Spinalnerven aussetzen, die verwendet werden können, um die DRGs innerhalb der Wirbelsäule zu suchen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lendenwirbelsäule DRGs durch sanft zerrte an der Rückenflosse Wurzel ziehen die DRG in der vertebralen Kanäle, dann übersteuert die Nerven und Bindegewebe mit Iris-Schere, der DRGs zu entfernen. Hinweis: Es ist möglich, die Auflistung der L4-L6-DRG zu beschränken, die tragen an den Ischiasnerv.</li>
	<li>Mit Pinzette, der DRGs auf einem 1,5 mL Röhrchen mit etwa 1 mL eiskaltem PBS übertragen und speichern auf Eis. Hinweis: Die Nerven kann über Nacht auf Eis gespeichert werden.</li>
</ol>(3) Verdauung der Ischiasnerv und DRG
<ol><li>Bereiten Sie die Verdauung Medien (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, 1,6 mg/mL Kollagenase Typ 4) ergänzt mit 100 µg/mL Deoxyribonuclease und Shop auf Eis. Hinweis: Die Höhe der Verdauung Medium erforderlich per Mausklick (Ischias Nerven + DRGs) beträgt 1 mL. Nachdem vorbereitet, speicherbar Aliquote der Verdauung Medien bei-20 ° C.</li>
	<li>Übertragen der Ischias Nerven und DRGs aus einem einzigen Mausklick in separate 1,5 mL Röhrchen mit 500 µL der Verdauung Medien. Für den Ischias Nerven das Material in 15-20 Stücke schneiden mit einer Schere Frühling und inkubieren Sie die Gewebe-Suspensionen in einem schütteln Inkubator bei 37 ° C für 20 min mit sanften Agitation (≤ 450 u/min).</li>
	<li>Immer wieder genannte die Zellsuspension durch 1.000 µL Pipettenspitze unvollständig verdaute Gewebe mechanisch zu trennen. Hinweis: Wenn die Federung schwer zu titrieren, dann schneiden Sie die Pipettenspitze mit einer Schere, eine stumpfe Ende zu schaffen. Inkubieren Sie die Gewebe-Aussetzung bei 37 ° C für 20 min mit sanften Agitation (≤ 450 u/min).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Verreibung durch eine 1.000 µL Pipettenspitze und inkubieren Sie für weitere 10 min bei 37 ° C mit sanften Agitation (≤ 450 u/min).</li>
	<li>Vorbereiten den FACS-Puffer (PBS mit 10 % FCS und 1 mM EDTA ergänzt) und speichern Sie auf dem Eis. Spülen Sie und genießen Sie einen Edelstahl-Bildschirm mit einer Maschenweite von 140 µm mit FACS Puffer 60 x 15 mm Petrischale auf Eis. Hinweis: Nylon Screen Filter sollte vermieden werden, denn sie zu einem erheblichen Verlust der Ausbeute von kernhaltigen Zellen führt.</li>
	<li>Immer wieder durchlaufen Sie die Gewebe-Suspensionen 140 µm Gaze-Filter, wie es in der Petrischale mit stumpfen Pinzette auf Eis gehalten wird. Kassiere die Zellsuspension in der Petrischale und überträgt es auf eine neue 1,5 mL Tube auf Eis gelagert.</li>
	<li>Drücken Sie alle unvollständig verdaute Gewebe, das auf dem Filter durch wiederholte Verreibung mit einer Pipettenspitze 1.000 µL bleibt. Spülen Sie den Siebfilter zweimal mit 500 µL Puffer FACS und sammeln Sie die daraus resultierenden Zellsuspension in der Petrischale mit der Zellsuspension aus Schritt 3.6 zu kombinieren. Hinweis: Wenn das Durchflusszytometer verwendet für Schmutz empfindlich ist, kann die Zellsuspension aus Schritt 3.7 durch eine 70 µm Gaze-Filter übergeben werden; Allerdings kann dies zu einem Verlust der Ausbeute von kernhaltigen Zellen führen.</li>
	<li>Zentrifugieren der Zellsuspensionen 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL der FACS-Puffer. Wiederholen Sie waschen einmal.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 150-350 µL FACS Puffer, je nach Anzahl der Färbung, die erforderlichen (150 µL FACS Puffer pro Färbung Panel).</li>
</ol>(4) Färbung des Ischias-Nervs und DRG mit Gewebekulturen beschriftete Antikörper für die Durchflusszytometrie
<ol><li>Übertragen Sie 100 µL der Ischiasnerv oder DRG Zellsuspension auf Eis in eine V-Form gut in eine 96-Well-Platte. Hinweis: Single-gefärbten Zellen sind notwendig für alle Antikörper verwendet, da sie die notwendigen Kontrollen vorsehen, Einrichten der Durchflusszytometrie in Bezug auf Photomultiplier Röhre (PMT) Spannung Gewinne und Entschädigung sowie von spezifischen unterscheiden zu helfen unspezifische Bindung. Aufgrund des begrenzten Materials der Ischiasnerv und DRGs, Blut Leukozyten und Makrophagen aus der PCL (Schritte 1.1-1.2) können verwendet werden, wie die Single-gefärbten Steuerelemente, die Färbung für die parallel mit der Färbung von den Ischias durchgeführt werden sollte Nerven- und DRGs.</li>
	<li>Pool der restlichen Zellen Suspensionen (etwa 50 µL pro Probe) aus den Ischias Nerven oder DRG Proben, als einem ungefärbten Kontrolle dienen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Platte 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den Überstand durch Umdrehen der Plattenrandes über einem Mülleimer und eine scharfe Bewegung aus dem Handgelenk zu, und klopfen Sie leicht auf Küchenpapier trocken.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie für Oberflächen beflecken jeder Zelle-Pellets in 20 µL FACS-Puffer mit den Antikörpern von Interesse (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 und MHC-Klasse II-Biotin) und inkubieren Sie, geschützt vor Licht, für 30 min auf Eis. Hinweis: (1) die optimale Antikörper Verdünnung sollten entschlossen vor dem Gebrauch durch Ausführen einer Verdünnungsreihe nach Produktinformationen des Herstellers; (2) eine unspezifische Färbungen können durch Inkubation mit Fc-Block in diesem Schritt nach den Anweisungen des Herstellers reduziert werden; und (3) Isotype Kontrolle Färbungen sind in der Regel nicht erforderlich, wenn mit primären Antikörper konjugiert direkt mit einem Fluorophor und/oder wenn die Antigene von Interesse unterschiedliche Bevölkerungen produzieren.</li>
	<li>Jedes gut 130 µL FACS Puffer hinzu und Zentrifugieren der Platte 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor beschrieben (Schritt 4.3) und die Zelle Pellets zweimal mit 150 µL des FACS-Puffers zu waschen. Hinweis: Bei Verwendung einer unconjugated Primärantikörper oder einer primären Antikörper konjugiert, Biotin, dann eine geeignete sekundären Reagenz, konjugiert zu einem Fluorophor kann an dieser Stelle hinzugefügt werden und Schritte 4,4-4,5 werden wiederholt. Im Falle dieses Protokoll wurde Streptavidin-PE/Cy7 oder Streptavidin-PerCP zur MHC Klasse II in Kombination mit CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5 oder in Kombination mit CD68-APC und F4/80-PE/Cy7, bzw. zu erkennen.</li>
	<li>Zur Fixierung, nach dem letzten Waschschritt Aufschwemmen der Zelle Pellets in 100 µL 4 % Paraformaldehyd mit PBS-Puffer (pH 7,4). Brüten die Platte für 10 min auf Eis und anschließend Zentrifugieren bei 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen des Überstands als zuvor beschrieben (Schritt 4.3) und waschen Sie die Zelle Pellets einmal mit 150 µL des FACS-Puffers. Achtung: Paraformaldehyd ist giftig; tragen Sie geeignete Schutzmaßnahmen wie Handschuhe und Brille, etc.. Hinweis: Aufschwemmen der Zelle Pellets in 150 µL FACS-Puffer und lagern Sie lichtgeschützt bei 4° C für bis zu zwei Tage. Keine intrazelluläre Färbung erforderlich ist, dann gehen Sie zu Schritt 4.11 nach dem Zentrifugieren der Platte 400 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Intrazelluläre Färbung, Aufschwemmen Sie der Zelle Pellets in 150 µL FACS buffer+0.5% Waschmittel und bei Raumtemperatur, lichtgeschützt für 15 min. Zentrifugieren der Platte 400 X g für 5 min bei 4 ° c inkubieren Verwerfen Sie den Überstand zu, wie zuvor beschrieben (Schritt 4.3) und waschen Sie der Zelle Pellet einmal mit 150 µL FACS Puffer + 0,5 % Waschmittel zu. Aufschwemmen der Zelle-Pellets in 20 µL FACS buffer+0.5% Waschmittel, enthält die Antikörper von Interesse (CD68-APC, CD206-PE) und inkubieren, lichtgeschützt bei Raumtemperatur für 30 Minuten.</li>
	<li>Jedes gut 130 µL FACS buffer+0.5% Spülmittel hinzu und Zentrifugieren der Platte 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor beschrieben (Schritt 4.3) und die Zelle Pellets zweimal mit 150 µL FACS Puffer + 0,5 % Waschmittel zu waschen. Hinweis: Bei Verwendung einer unconjugated Primärantikörper oder einer primären Antikörper konjugiert, Biotin, dann eine geeignete sekundären Reagenz, konjugiert zu einem Fluorophor hinzugefügt werden an dieser Stelle und 4,9-4.10 Schritte wiederholt.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellets in 150 µL FACS Puffer + 0,5 % Waschmittel und Store, lichtgeschützt bei 4 ° C für bis zu zwei Tage.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie die Zelle Pellets mit 150 µL FACS Puffer + 0,5 % Waschmittel ergänzt mit 5 µg/mL DAPI und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Zentrifugieren Sie die Platte 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand, wie zuvor beschrieben (Schritt 4.3) zu verwerfen.</li>
	<li>Die Zelle-Pellets in 150 µL PBS und Übertragung auf einen entsprechend gekennzeichneten FACs-Schlauch aufzuwirbeln. Lagerung bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, bis bereit für die Analyse. Hinweis: Nach Wiederfreisetzung mit PBS-Puffer, sollten die Zellen innerhalb von Stunden, analysiert werden, da das DAPI wird langsam von der DNA, was zu einem Verlust im Signal zu distanzieren.</li>
</ol>5. Setup der Durchflusszytometrie und Ausführung von Proben
<ol><li>Sicherstellen Sie, dass das Durchflusszytometer über die geeignete Laser verfügt und/oder Filter setzt auf um die Fluorophore verwendet, um die Zellen färben zu messen. Dies kann unter Cytometer Standardkonfiguration auf dem System ermittelt werden. Bei diesem Protokoll wurden Zellen mit einem Durchflusszytometer, ausgestattet mit drei Lasern analysiert (405 nm, 488 nm und 633 nm) ermöglicht die Erkennung von ≤ 5 Fluorophore.</li>
	<li>Wählen Sie die entsprechenden Kanäle für die Erkennung von Fluorophore von Interesse. Alle fluoreszierenden Signale werden am besten mit logarithmischen Verstärkung entdeckt.</li>
	<li>Wählen Sie eine entsprechende Volumenstrom für die Proben. Dieser Parameter kann variieren, abhängig von dem System verwendet und sollte empirisch ermittelt werden. Im Falle dieses Protokoll wurde ein Durchfluss von MED-HI (35-60 µL/min) verwendet, um zu verhindern Verstopfung der Nadel.</li>
	<li>Wählen Sie die Gesamtzahl der Veranstaltungen/Zellen pro Probe gesammelt werden. Die minimale Anzahl von Ereignissen sollte 1.000.000.</li>
	<li>Erstellen von Streudiagrammen unter einem globalen Arbeitsblatt der SSC-A im Vergleich zu FSC-A, sowie für jede Fluorophor des Interesses gegen FCS-A. Erstellen Sie eine statistische Ansicht, die die Anzahl der Ereignisse und die mittlere Fluoreszenz Intensität (MFI) für die ausgewählten Fluorophore angezeigt wird.</li>
	<li>Stellen Sie die Spannung der FSC-A und SSC-A Kanäle, so dass die kleinsten Zellen in der unteren linken 10 % das Streudiagramm passen. Bestimmen Sie die Hintergrundfluoreszenz und minimale Probe Fluoreszenz von ungefärbten Steuerelemente aus den Ischias Nerven oder DRGs. bestimmen Sie die Streuung der übergeordneten (P1) Tor Grundlage aus DAPI-nur Plotten Färbung Kontrollen. Hinweis: Dies ist keine Sammlung Tor aufgrund zum Teil auf die Heterogenität der Bevölkerung DAPI + in der PNS.</li>
	<li>Mit dem FSC Scatter Grundstücke für jeden der das Fluorophore von Interesse, die Spannungen so einstellen, dass die Zellen des ungefärbten Steuerelements in das untere Viertel ihrer jeweiligen Streudiagrammen fallen. Tore entstehen dann über diese Region für diese Zellen zu definieren, die für jede der jeweiligen Marker/Fluorophore positiv sind. Die Platzierung eines Tores wird durch die Ausführung der einzelnen gebeizt Steuerung (Schritt 4.1) bestätigt. Hinweis: Entschädigung für überlappende Emissionsspektren kann an dieser Stelle durchgeführt oder rückwirkend mit der entsprechenden Analysesoftware.</li>
	<li>Sobald das Durchflusszytometer eingerichtet, hat wie beschrieben, können die Beispiele ausgeführt werden.</li>
	<li>Nach dem Lauf der verbleibenden Probenmaterial kann weggeworfen werden und zur weiteren Analyse der FCS-Dateien exportiert werden können.</li>
</ol>

<ol>
	<li>DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroimmunology+of+degeneration+and+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system.">The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system.</a> Neuroscience. 302, 174-203 (2014).</li><li>Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+pathology.">Macrophage polarization in pathology.</a> Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).</li><li>Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+Signaling+Pathway+in+Macrophage+Activation+and+M1/M2+Polarization.">Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization.</a> J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).</li><li>Perrin, F. E., Lacroix, S., Avil&#233;s-Trieueros, M., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+monocyte+chemoattractant+protein-1,+macrophage+inflammatory+protein-1alpha+and+interleukin-1beta+in+Wallerian+degeneration.">Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration.</a> Brain. 128, 854-866 (2005).</li><li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+Macrophages+Near+Axotomized+Neuronal+Cell+Bodies+in+Stimulating+Nerve+Regeneration.">A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration.</a> J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).</li><li>Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+modulating+macrophage+phenotype+on+peripheral+nerve+repair.">Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair.</a> Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).</li><li>Martini, R., Willison, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+in+the+peripheral+nerve:+Cause,+modulator,+or+bystander+in+peripheral+neuropathies?.">Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies?.</a> Glia. 64, 475-486 (2016).</li><li>Carriel, V., Garz&#243;n, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering.">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).</li><li>Leong, T. Y. -. M., Leong, A. S. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+antigen+retrieval+work?.">How does antigen retrieval work?.</a> Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).</li><li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration.">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).</li><li>Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+inflammatory+cells+isolated+from+the+sciatic+nerve+and+DRG+after+chronic+constriction+injury+in+mice.">Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).</li><li>Pannell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+M2+macrophages+reduces+neuropathic+pain+via+opioid+peptides.">Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides.</a> J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).</li><li>Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STZ+causes+depletion+of+immune+cells+in+sciatic+nerve+and+dorsal+root+ganglion+in+experimental+diabetes.">STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes.</a> J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte in Bezug auf diese Studie.

Ischias Nerven enthalten einen großen Anteil an Lipiden, wie Cholesterin, aufgrund des Gehaltes an Myelin um die Axone. Da die Eigenschaften von Lipiden mit Temperatur ändern, erhalten Sie unterschiedliche Ergebnisse bei unterschiedlichen Temperaturen. Um die Zelle Erhaltung zu gewährleisten, wurden alle Schritte in diesem Protokoll nach der Verdauung auf Eis durchgeführt. Während Konsistenz aus Gründen der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse empfohlen wird, kann Ausbeute zu erhöhen, durch Ausführen der Schritte 3....

Immunzellen, die aus dem Kreislauf der PNS eingeben helfen definiert durch den Ausdruck von CD45 und CD11b, um die Integrität des Nerven und eine Rolle sowohl in der Regeneration und Degeneration1. Makrophagen (definiert durch ihren Ausdruck des CD68 Maus) können zu einer entzündlichen Phänotyp, mit dem Ausdruck mehr MHC verzerrt werden der Klasse II und CD86 auf ihrer Oberfläche (M1), oder gegen eine entzündungshemmende Phänotyp auszudrücken mehr intrazelluläre CD206 (M2)2 . Schiefstellung des Phänotyps Makrophagen ist ein dynamischer Prozess durch Akt3-Signalisierung, reflektieren die verschiedenen Aufgaben der Makrophagen in der Abwehr von Krankheitserregern (M1) und die Rolle bei der Geweberegeneration (M2) geregelt. Regeneration von einem verletzten Nerven erfordert zunächst Phagozytose von Myelin Schutt durch Makrophagen in den Nerv4,5, und entzündungshemmend (CD68+CD206+) M2-Makrophagen haben gezeigt, dass Axon Auswuchs in fördern die PNS-6. Reduzierte Rekrutierung oder Makrophagen an den PNS oder eingeschränkter Fähigkeit zur Phagozytose beeinträchtigt Regeneration und Pflege der Nerv Integrität führen kann. Entzündliche M1 Makrophagen, mit dem Ausdruck MHC Klasse II, sind weniger fähig als M2-Makrophagen Phagozytose und neuronaler Entzündung in der Pathogenese der verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten7verwickelt ist.
Die Änderungen, die an den Nerv resident Immunsystem als Folge von Schäden auftreten können quantitative, Verlust von CD45 manifestiert werden+ Leukozyten (oder Infiltration von CD45 erhöht+ Leukozyten im Fall Entzündungen), oder qualitative, wie z.B. Ändern von Makrophagen Phänotyp von M2, M1 Phänotyp. Die Immunzellen des PNS wurden traditionell durch IF, mit Gefrierschnitte oder Paraffin-eingebetteten materiellen8analysiert. IF ist für die Bestimmung der Lokalisierung der Zellen des Interesses erforderlich. Allerdings stützt sich Quantifizierung zu verwenden, wenn häufig auf zählen eine relativ kleine Anzahl von Zellen in einem schmalen Bereich des Gewebes, Quantifizierung unzuverlässig und Vorwählervorspannung anfällig machen. Für die Identifizierung von bestimmten Teilmengen von Immunzellen ist die simultane Detektion von extrazellulären und intrazellulären Markierungen erforderlich, während Bestimmung des Phänotyps Makrophagen mindestens mindestens zwei Markierungen, insbesondere CD206 und MHC erfordert Klasse II. Am häufigsten verfügbaren Mikroskope sind begrenzt auf mindestens zwei-Farben-Kanäle, wie Fluorescein erfolgt (FITC) und Phycoerythrin (PE), läßt die Charakterisierung der spezifischen Teilmengen von Immunzellen durch IF restriktiv und unvollständig, erfordern sich die Notwendigkeit, mehrere Folien, abgeleitet aus der gleichen Gegend von Interesse, die befleckt und parallel analysiert. Dieser zeitaufwändige Aspekt ist daher nicht notwendig, eignet sich zur Analyse der großen Sample-Sets. Da die meisten der Marker des Interesses extrazelluläre kann der Nachweis im Gewebe, die entweder in Paraffin oder kryokonservierten eingebettet worden, problematisch wegen der Störung der Membran Integrität und die Maskierung von Epitopen sowie den Verlust von werden die Antigene des Interesses durch die Verwendung von Lösungsmitteln wie Aceton und Methanol9.
Im Gegensatz dazu flow Cytometry, welche optische Maßnahmen und Fluoreszenz Eigenschaften einzelner Zellen in Suspension als Durchgang durch einen Lichtstrahl, bietet praktische und umfassende Analyse der Zell-Populationen. Durchflusszytometrie, anstatt zu produzieren ein digitales Bild des Gewebes, bietet eine automatisierte Quantifizierung der eingestellten Parameter, die relative Größe und reflektierende Index, genannt der forward Scatter (FSC), Granularität/interne Komplexität der Zelle enthalten oder Seite-Streuung (SSC) und relativen Fluoreszenzintensität, vorausgesetzt, dass die Zelle mit einer entsprechenden Fluorophor wie ein konjugierten Antikörper gekennzeichnet hat. Eine typische Durchflusszytometer besteht aus zwei, luftgekühlte Laser; ein Argonlaser erzeugt Blaulicht bei 488 nm und einem Helium-Neon-Laser erzeugt Licht bei 633 nm. Diese Kombination ermöglicht die Erkennung und Messung, gleichzeitig mindestens fünf Ziele auf der Oberfläche oder in den intrazellulären Raum. Erweiterte fließen Cytometers besteht aus mehreren Lasern, die für die Erkennung von bis zu acht verschiedene Fluorochromes auf einmal erlauben, dass Emissionen Spitzenwellenlängen von ausgewählten Fluorochromes nicht erheblich überschneiden.
Für die Analyse von Durchflusszytometrie, muss das Gewebe von Interesse zuerst enzymatisch, in der Regel mit Kollagenase, eine einzellige Suspension erzeugen verdaut werden. Die Analyse der murinen Ischias Nerven war bisher schwierig aufgrund der geringen Menge des Gewebes aus jeder Maus gewonnen. Darüber hinaus der hohe Fettgehalt von Myelin um die Axone behindert Zelle Erholung und produziert große Mengen von Schutt. Für die Vorbereitung der Ischiasnerv und Verdauung hierin beschriebene Methode wurde von Schwann-Zellen isoliert Protokoll der Spange Et al. 7, und zielt darauf ab, genügend Zellen von Nerven der einzelnen Mäuse für Flow-Zytometrie-Analyse, zu isolieren, um Unterschiede zwischen den Mäusen zu reduzieren. Mit DAPI für die Identifizierung von einzelnen Zellen in der rohen Gewebe Digest umgeht die Notwendigkeit, Axon Schmutz, die häufig zum Verlust der Zelle führt. Waschen, mehrmals mit einer Waschmittel-reiche Puffer Aids in der Freisetzung von Zellen gefangen in fetthaltigen Schmutz, dadurch Erhöhung der Ausbeute. Verdauung der beiden Full-length Ischias Nerven von einem einzigen Mausklick nach diesem Protokoll generiert ≥30, 000 kernhaltigen Einzelveranstaltungen und mindestens 3 mal so viele von der DRG abgerufen wurde. Der Anteil der CD45+ Leukozyten lag bei ca. 5 % der gesamten Zellinhalt in der Ischiasnerv Digest und etwa von 5-10 % in der DRG-Digest. Der Großteil der CD45+ Zellen in den Ischiasnerv drückte die Makrophagen Marker, CD68 und CD206.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mouse</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>C57BL/6NCrl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>31885023</td>
			<td>The source of this material is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 4</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp., US</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td>Clone M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against MHC class II, biotinylated</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107603</td>
			<td>Clone M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against CD45-A647</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107603</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against CD68-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137007</td>
			<td>Clone FA/11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against CD206-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141706</td>
			<td>Clone C068C2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody against F4/80-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123113</td>
			<td>Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405206</td>
			<td>Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-PerCP</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405213</td>
			<td>Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Dilute in PBS to a 50x and store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation sieve - tissue grinder kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Shaped, 96-well plates</td>
			<td>Greiner/Sigma</td>
			<td>M8185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15mm petri dish</td>
			<td>Greiner/Sigma</td>
			<td>Z643084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of immune cells in single sciatic nerves and dorsal root ganglion from a single mouse using flow cytometry

Nerv-Resident Immunzellen in das periphere Nervensystem (PNS) sind wesentlich für neuronale Integrität in einen gesunden Nerv. Die Immunzellen des PNS betroffen sind Verletzungen und Erkrankungen, beeinträchtigen die Funktion der Nerven und die Fähigkeit zur Regeneration. Neuronale Zellen werden häufig durch Immunfluoreszenz (IF) analysiert. Während wenn ist wichtig für die Bestimmung des Orts der Immunzellen in den Nerv, wenn nur semi-quantitativen und die Methode beschränkt sich auf die Anzahl der Markierungen, die gleichzeitig analysiert werden können und der Grad der Oberflächenexpression. In dieser Studie wurde die Durchflusszytometrie für Quantitative Analyse der Leukozyten-Infiltration in Ischias Nerven oder Dorsal Root Ganglien (DRGs) von einzelnen Mäusen verwendet. Einzelne Zelle Analyse erfolgte mittels DAPI und mehrere Proteine gleichzeitig für die Oberfläche oder intrazelluläre Expression analysiert wurden. Beide Ischias Nerven von einer Maus, die nach diesem Protokoll behandelt wurden generiert ≥ 30.000 kernhaltigen Einzelveranstaltungen. Der Anteil der Leukozyten in den Ischias Nerven, bestimmt durch Expression von CD45, betrug etwa 5 % der gesamten Zellinhalt in den Ischiasnerv und etwa 5-10 % in der DRG. Obwohl dieses Protokoll konzentriert sich in erster Linie auf die Immunzelle Bevölkerung innerhalb der PNS, bedeutet die Flexibilität der Durchflusszytometrie, eine Reihe von Markierungen gleichzeitig messen, dass die anderen Zellen Populationen innerhalb der Nerven, wie Schwann-Zellen, Perizyten vorhanden , Fibroblasten und Endothelzellen, auch analysiert werden können mit dieser Methode. Diese Methode bietet daher ein neues Mittel für das Studium systemischer Wirkungen auf die PNS wie Neurotoxicology und genetische Modelle der Neuropathie oder bei chronischen Krankheiten wie Diabetes.

Zellsuspensionen von Full-length Ischias Nerven und allen wichtigen DRG waren vorbereitet, nach dem Protokoll von sechs gesunde C57BL/6 Mäusen und unterteilt in drei gleiche Aliquote zum Färben. Zähler mit DAPI, die DNA zu Flecken, beflecken erlaubt die Erkennung einer einzelnen Zelle Bevölkerung (Abbildung 1A–B, obere Leiste). Auswaschen DAPI, vor der Analyse von Durchflusszytometrie, sank in einem Ausmaß die fluoresz...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry at JoVE.com

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Quantitative Analyse des Zelleninhalts innerhalb der murinen Ischiasnerv wird erschwert durch die Knappheit des Gewebes. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Gewebe-Verdauung und Vorbereitung, die genügende Zellen für Flow-Zytometrie Analyse Immunzelle Populationen von Nerven der einzelnen Mäusen versorgt.

Analyse von Immunzellen in einzelnen Ischias Nerven und Dorsal Root Ganglion aus einem einzigen Mausklick mit Durchflusszytometrie

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

analysis-immune-cells-single-sciatic-nerves-dorsal-root-ganglion-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Aufrufe.  University Hospital of Heidelberg. Quantitative Analyse des Zelleninhalts innerhalb der murinen Ischiasnerv wird erschwert durch die Knappheit des Gewebes. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Gewebe-Verdauung und Vorbereitung, die genügende Zellen für Flow-Zytometrie Analyse Immunzelle Populationen von Nerven der einzelnen Mäusen versorgt.

Serie: Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Forschung

Neurowissenschaften

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

In-vivo-Elektrophysiologische Messungen an Maus Ischiasnerven

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomie LWS Dorsal Root Ganglion-Zugriff und Injektion bei Schweinen

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...