Name: 3d mitochondrial ultrastructure of drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography
Uploaded: 2017-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography at JoVE.com

Die Untersuchungen wurden in der EM-Kern am Institut für Zell- und Organismische Biologie und die Cryo-EM Kern der Academia Sinica, Taipei, Taiwan durchgeführt. Die Arbeit wurde von der Academia Sinica und die meisten unterstützt.

1. Abschnitt Drosophila Gewebe mit einer schwingenden Klinge-Mikrotom
<ol>
	<li>Drosophila auf Eis zu betäuben und jede einzelne Fliege in 1 mL 4 % niedrig schmelzende Agarose in Phosphatpuffer Tauchen. Lassen Sie Agarose, auf Eis erstarren. In der Regel wurden 4-6 fliegen verarbeitet.</li>
	<li>Verwenden Sie eine vibrierende Klinge Mikrotom zu Abschnitt Agarosegel eingebettete Drosophila in mit 100 µm dicke Scheiben und Tauchen in Fixativ Lösung mit 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer. Hinweis: Vibratome-Schnitt wird bevorzugt, weil Gewebearchitektur mehr intakt im Vergleich zu anderen Methoden bleibt. Alternativ kann sezieren Pinzette zur IFM in die Fixativ Lösung mit 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer sezieren.</li>
</ol>
2. bereiten Sie EM Proben vom Hochdruck Einfrieren und Freeze Substitutionsmethode (HPF/FS)
<ol>
	<li>Phosphatpuffer, gefolgt von 2 Tropfen (~ 100 µL) der Phosphatpuffer mit 20 % BSA waschen Sie Gewebeschnitte in 3 Tropfen (~ 150 µL). Dann legen Sie Abschnitte in gold Träger für HPF mit Puffer und 20 % BSA gefüllt.</li>
	<li>Laden Sie die Probe mit Trägern in einem Hochdruck-Gefrierschrank entsprechend der Gebrauchsanweisung.</li>
	<li>Nach dem Einfrieren lassen Träger aus der Halterung unter flüssigem Stickstoff und übertragen auf einen Freeze-Ersatzgerät auf-140 ° c abgekühlt</li>
	<li>Führen Sie das Einfrieren-Substitution-Protokoll wie in Tabelle 1, mit dem FS cocktail mit 2 % Glutaraldehyd, 2 % Osmium ausgefällt und 0,1 % Uranyl Acetat in Aceton dargestellt.</li>
	<li>Vorsichtig entnehmen Sie die Proben aus den Trägern mit einer Nadel und Betten Sie der Proben im Harz bei Raumtemperatur ein. Polymerisieren Sie das Harz bei 65 ° C 16 h. Hinweis: FS Protokolle sollten geändert werden, um andere Arten von Proben vorzubereiten. HPF/FS wird bevorzugt zur Erhaltung der Ultrastruktur und minimiert den Verlust von zellulären Inhalt.<ol>
		<li>Alternativ eine chemische Fixierung Protokoll anwenden. Exemplare über Nacht mit 2,5 % Glutaraldehyd befestigen, waschen mit Puffern und dann fixieren Sie mit 1 % Osmium ausgefällt für 2 h waschen und entwässern mit aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol und dann infiltrieren und einbetten Exemplare in Spurrs Harz vor dadurch bei 65 ° C für 16 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. bereiten Sie Serie Abschnitte der Exemplare für Elektronenstrahl-Tomographie
<ol>
	<li>Schneiden Sie die Probe-Blöcke, um den gewünschten Block Gesicht aussetzen, das Gewebe enthält.</li>
	<li>Vorbehandeln Goldpartikel (10 nm im Durchmesser) mit 1 % BSA für 30 min. Waschen und Aufhängen Goldpartikel in PBS-Puffer. Overlay-Goldpartikel auf Kupfer Slot Gitter beschichtet mit Carbon Folie Kugelmarker erstellen.</li>
	<li>Das Sichtfeld der Tomographie Erwerb unter TEM müssen ausreichend Kugelmarker (mindestens 5-10 Marker) einchecken.</li>
	<li>Geschnitten Sie Serienschnitte, 200-250 nm dicke, mit einem regungsloses.</li>
	<li>Sammeln Sie Serienschnitte auf Slot-Gitter mit einer perfekten Schleife für Dünnschliffe.</li>
	<li>Färben Sie die Abschnitte mit Reynold es Blei Citrat für 10 min.</li>
	<li>Eine zweite Schicht aus treuhändische Goldpartikel auf der Oberseite in den Abschnitten zu überlagern.</li>
</ol>
4. sammeln Sie Doppel-Kipp-Elektron Tomographie
<ol>
	<li>Laden Sie das Raster auf einer Doppel-Mittellinie Tomographie-Halter und stecken Sie in die Transmissions-Elektronenmikroskop in Betrieb bei 200 kV.</li>
	<li>Richten Sie das Mikroskop im Euzentrische Fokus.</li>
	<li>Richten Sie die automatische Datenerfassungs-Software. Einstellen und Ausrichten des Elektronenstrahls bei der Multi-Skalen-imaging-Einstellung. Sie finden Sie im Benutzerhandbuch für Betrieb Detail10 (Abbildung 2).</li>
	<li>Dunklen und hellen Referenzen Kamera in einem leeren Raum ohne Carbon Folie unter der Einstellung "Tomographie-Sammlung" zu erwerben.</li>
	<li>Einen Raster-Atlas bei geringer Vergrößerung zu sammeln. Mitochondrien auf Schnittserien als Ziele für Tomographie Sammlung auswählen.</li>
	<li>Erwerben Sie ein Tilt-Serie von-60 ° bis + 60 ° mit 2 ° c-Schritten auf Achse-A für jedes Ziel. Hinweis: Der Neigungswinkel werden mechanisch durch die Gestaltung der Probenhalter eingeschränkt werden. Der Halter wird den Strahl im hohen Neigungswinkel blockieren.</li>
	<li>Um die zweite Serie der Neigung zu sammeln, drehen Sie die Probenhalter 90°. Erwerben Sie einen neuen Atlas. Wählen Sie entsprechende Positionen und erwerben Sie die Tilt-Serie auf Achse-B für jedes Ziel zu. Hinweis: Andere Softwarepakete, wie SerialEM und Xplore3D, stehen für die automatische Datenerfassung.</li>
</ol>
5. 3D Schichtbilder zu rekonstruieren und Segment Teilvolumina mit Software
<ol>
	<li>Schichtbilder Dual-Achse kippen Bilder mit IMOD Software11zu rekonstruieren.
	<ol>
		<li>Sie finden Sie im Benutzerhandbuch zum Betrieb Detail.</li>
		<li>Richten Sie die individuelle Neigung-Serie durch die Position der gold Kugelmarker. Rekonstruieren Schichtbilder zurück Projektionsmethode oder durch die gleichzeitige Iterative Rekonstruktion Technik (SIRT) Methode für beide Achsen A und B-Achse bzw. (Abbildung 3).</li>
		<li>Kombinieren Sie Schichtbilder der Achse A und Achse-B, ein Doppel-Kipp-Tomogramm mit reduzierten fehlende Keil Artefakt zu generieren.</li>
		<li>Gemeinsam Doppel-Kipp Schichtbilder der Schnittserien Rekonstruktionen für gesamte Mitochondrium Volumen zu erhalten. Die Lücken zwischen den Schnittserien IMOD programmtechnisch zu modellieren.</li>
		<li>Trim verbundenen Schichtbilder und bin auf eine gewünschte Größe für die Volumen-Segmentierung.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analysieren Sie verbundene serielle Schichtbilder mit einer 3D-Software.
	<ol>
		<li>Sie finden Sie im Benutzerhandbuch zum Betrieb Detail.</li>
		<li>Filtern Sie die Schichtbilder mit eine Gaußsche Filter (oder andere gewünschte Methode) verbessert den Kontrast der Funktionen und die Hintergrund dichten.</li>
		<li>Die Ultrastruktur der Mitochondrien zu segmentieren, entweder manuell oder automatisch.</li>
		<li>Anschauungsmodelle Segmentierung zur Inspektion in 3D ermöglichen.</li>
		<li>Filme mit verfügbaren Tools in 3D zu erzeugen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure:+theory+and+practice.">High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice.</a> J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).</li><li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemistry+and+electron+microscopy.+The+preservation+of+cellular+ultrastructure+and+enzymatic+activity+by+aldehyde+fixation.">Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation.</a> J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Soto, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+electron+tomography:+a+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+large+structures.">Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures.</a> Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).</li><li>Jiang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomographic+analysis+reveals+ultrastructural+features+of+mitochondrial+cristae+architecture+which+reflect+energetic+state+and+aging.">Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging.</a> SciRep. 7, 45474 (2017).</li><li>Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Cristae:+Where+Beauty+Meets+Functionality.">Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality.</a> TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).</li><li>Friedman, J. R., Nunnari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+form+and+function.">Mitochondrial form and function.</a> Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon.">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

In diesem Protokoll beschreiben wir einen optimierten Workflow für die Anwendung von seriell-Abschnitt Elektron Tomographie zur 3D mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel zu studieren. Erhaltung der Ultrastruktur in der Probe ist die größte technische Herausforderung für diese Art der Analyse. Um am besten die Ultrastruktur zwei methodische zu bewahren wurden Schritte enthalten. Erstens wurde Gewebe gesampelt, durch Schneiden mit vibrierender Klinge Mikrotom um die Gewebearchitektur so weit wie möglich zu halten. Zweitens wurde ein HPF/FS-Protokoll optimiert, um Organelle Ultrastruktur während der Vorbereitung des eingebetteten Proben Blöcke zu bewahren. Proben wurden unter hohem Druck, eingefroren, senkt den Gefrierpunkt des Wassers und reduziert die Bildung von Eiskristallen, die Ultrastruktur1beschädigen. Exemplare, die so dick wie 0,1 mm augenblicklich verglast sein kann, und dann einfrieren, Ersatz um Probe Blöcke für EM-Analyse zu generieren unterzogen. Die verbesserte Erhaltung der Ultrastruktur von HPF/FS wurde festgestellt, wenn im Vergleich zu chemischen Fixierung Methoden. Mit dieser Serie von Schritten für die Probenvorbereitung, wurde Erhaltung der mitochondrialen doppelte Membranen und Cristae Membranen erheblich verbessert.
Schnittserien der Probe zu erhalten, ist der schwierigste Schritt des Verfahrens. Da der Elektronenstrahl Durchdringungskraft begrenzt hat, die Dicke des Abschnitts beschränkt sich auf entweder 250 nm oder 500 nm mit einem TEM Betrieb bei 200 kV oder 300 kV, beziehungsweise. Da die Dicke der ein Mitochondrium möglicherweise mehr als 2 µm, Serienschnitte müssen volle Lautstärke Rekonstruktionen zu erhalten. Wiederherstellung einer ausreichenden Zahl von Schnittserien umfassen eine ganze Organelle ist jedoch eine technische Herausforderung. Das Block-Gesicht so flach wie möglich zwischen den Basen des Trapezes zu trimmen können eine Slot-Raster, um Platz für weitere Abschnitte und deckt damit größere Mengen. Darüber hinaus erhöht mit einer perfekten Schleife für Dünnschliffe die Erfolgsquote der Schnittserien an das Stromnetz zu übertragen.
Seriell-Abschnitt Elektron Tomographie kann mit Standardausrüstung EM Kern erreicht werden. Die Methode hat jedoch einige unvermeidlichen Einschränkungen, die durch technische Zwänge entstehen. Einer ist, dass Material unweigerlich verloren zwischen Serienschnitte, so dass Lücken in den verbundenen Wiederaufbau. Zweitens ist das fehlende Keil Artefakt, die aufgrund der begrenzten Neigungswinkel entsteht, die erreichbar sind. Diese Einschränkung tritt auf, weil der Probenhalter in eine volle Umdrehung eingeschaltet werden kann, ohne zu blockieren den Elektronenstrahl. Trotz dieser Einschränkungen bietet Serien-Abschnitt Elektron Tomographie ausreichenden Auflösung, Mobilfunk- und Organelle Ultrastruktur in 3D zu offenbaren.
Für die kleineren Maßstab Bildgebung ist Cryo-Elektron Tomographie eine neue Technologie, die verwendet werden, um die Struktur der makromolekularen komplexe und Baugruppen in Situ in nm oder Sub Ångström Auflösung in Kombination mit Sub-tomographische zu erhalten Umbau3. In dieser Anwendung sind die Zellen durch Schneiden oder Fräsen unter flüssigem Stickstoff fokussierten Ionenstrahl ausgedünnt. Die Schichtbilder werden unter Cryo-Bedingungen gesammelt wo sind molekulare Strukturen in der Nähe der nativen Zustand ohne chemische Fixierung, Austrocknung oder einbetten erhalten. Am anderen Ende der Skala um große Gewebe auf Kosten der Auflösung, analysieren ist Rasterelektronenmikroskopie serielle Block-Gesicht eine ansprechende Modalität, obwohl es ein spezifisches Instrument4erfordert.

Elektronenmikroskopie ist ein wertvolles Instrument zur Untersuchung der strukturellen Kontext der subzellulären Baugruppen und Organellen, die zelluläre Prozesse ausführen. Methoden wurden entwickelt, um die Ultrastruktur von Geweben oder Zellen entweder durch chemische Fixierung mit Aldehyden zu erhalten oder durch hohen Druck Einfrieren (HPF) gefolgt von freeze Substitution (FS)1,2. Die eingebetteten Proben Blöcke können dann geschnitten, gebeizt und mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) beobachtet. Die HPF-Probe konnte auch unter Cryo-Zustand, z. B. durch Cryo-schneiden oder fokussierten Ionenstrahl (FIB) Fräsen und beobachtet von Cryo-EM3,4verarbeitet werden.
Obwohl dünn-Sektion EM morphologische aufschlussreiche Einblicke bietet, können die resultierenden 2D Bilder nur die Ultrastruktur der einen bestimmten Querschnitt zeigen. Wie die Ultrastruktur in ein 3D Volumen anordnet bleibt verdeckt. Um zellulären Ultrastruktur dreidimensional sichtbar zu machen, wurde eine Elektron Tomographie Methode entwickelt, wo Tilt Bilderserie erworben und zurück projiziert, um eine tomographische Rekonstruktion5 (Abbildung 1) zu generieren. Eine doppelte Tilt-Reihe kann gesammelt werden, durch die Probe 90° drehen und eine zweite Tilt-Serie zu erwerben. Dies minimiert fehlt-Wedge Artefakte, die ergeben sich aus der begrenzten Probenahme Winkel und Auflösung der Tomogramm verbessert.
Hier beschreiben wir die Anwendung der seriell-Abschnitt Elektron Tomographie studieren mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel (IFM)6,7,8,9 . Um 3D Rekonstruktionen für gesamte Mitochondrien (ca. 2,5 µm dicken) zu erhalten, wurden Serienschnitte von Drosophila IFM Gewebe Blöcke erhalten. Schichtbilder der einzelnen Abschnitte wurden einzeln mit automatischer Datenerfassungs-Software gesammelt. Tomographische Rekonstruktionen wurden generiert und serielle Schichtbilder schlossen mit dem IMOD Paket, einem rekonstruierten Volumen von eine gesamte Mitochondrium zu erhalten. Die verbundenen Schichtbilder wurden von 3D Software analysiert. Die Dichte der Mitochondrien Cristae wurden segmentiert, um einem Segmentierungsmodell zu generieren, die die Organisation in drei Dimensionen offenbart.

<table><tbody><tr><td>vibrating blade microtome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>Tissue sectioning</td></tr><tr><td>high-pressure freezer</td><td>Leica</td><td>EM HPM100</td><td>Specimen preparation</td></tr><tr><td>freeze-substitution device</td><td>Leica</td><td>EM AFS2</td><td>Specimen preparation</td></tr><tr><td>ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td>Ultra-thin sectioning</td></tr><tr><td>dual-axis tomography holder</td><td>Fischione</td><td>Model 2040</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>transmission electron microscope</td><td>FEI</td><td>Tecnai F20</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Gatan</td><td>UltraScan 1000</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>Leginon</td><td>NRAMM/AMI</td><td>tomography collection</td><td></td></tr><tr><td>IMOD</td><td>Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells</td><td>Tomography reconstruction&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Avizo 3D</td><td>FEI</td><td></td><td>Tomography analysis</td></tr></tbody></table>

3d mitochondrial ultrastructure of drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography

Mitochondrien sind zelluläre Kraftpakete, die produzieren ATP, Lipide und Metaboliten sowie Kalzium-Homöostase und Zelle Tod zu regulieren. Die einzigartige Cristae-reiche Doppelmembran Ultrastruktur von dieser Organellen ist elegant angeordnet, um mehrere Funktionen durchzuführen, durch die Partitionierung Biomoleküle. Mitochondrialen Ultrastruktur ist eng mit verschiedenen Funktionen; die feinen Details dieser Struktur-Funktions-Beziehungen sind jedoch erst am Anfang beschrieben werden. Hier zeigen wir die Anwendung der seriell-Abschnitt Elektron Tomographie, mitochondriale Struktur in Drosophila indirekte Flüge Muskel aufzuklären. Seriell-Abschnitt Elektron Tomographie kann Zellstruktur in drei Dimensionen zu studieren angepasst.

Wir angewendet seriell-Abschnitt Elektron Tomographie Strukturmerkmale der Mitochondrien Cristae zu analysieren, die den energetischen Zustand und Alterung widerspiegelt. Wir zeigten, dass Mitochondrien von Drosophila IFM ein integriertes bilden Cristae und Matrix-Netzwerk in 3D (Abbildung 4)7. Darüber hinaus angesammelt mutierte fliegen mit mitochondrialen DNA Replikation defekt und eine beschleunigte Alterung Phänotyp Mitochondrien, die Unterabschnitte von Zwiebel-wie wirbelnde Kern (Abbildung 5)7enthalten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Abbildung der Elektron Tomographie Rekonstruktion aus einer Reihe von Tilt. Im Experiment wird ein Elektronenstrahl ein 3D-Objekt durchlaufen, wenn das Objekt in unterschiedlichem Maße geneigt wird. Für jede Bedingung Tilt 2D Projektion erzeugt und mit einer Kamera erfasst. Die 2D Projektionen dürften dann wieder um das 3D-Objekt basierend auf der zentralen Scheibe Theorem zu rekonstruieren. In der Abbildung ist der gleiche Prozess für eine ursprüngliche 2D-Bild dargestellt, die in einer einzigen Dimension unter verschiedenen Neigungswinkel projiziert wird. Die 1D Projektionen werden verwendet, um das 2D-Bild zu rekonstruieren. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig2.jpg"> 
Abbildung 2: automatische Datenerfassung. Eine Bildanzeige Viewer Software zeigt des Atlas eine Slot-Raster mit Schnittserien kippen mehrskaligen Ausrichtung der Mitochondrien und erworbene Bilder. Maßstabsleiste = 500 µm (oben links), 100 µm (linken Bodenplatte), 1 µm (rechte Abbildung). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Serial-Abschnitt Elektron Tomographie von einem einzigen Mitochondrium in Drosophila indirekte Flüge Muskel. 2D Mikrographen (A) und (B) 3D Schichtbilder von Schnittserien deckt das gesamte Volumen der ein Mitochondrium. (C) verbundene seriell-Abschnitt Schichtbilder werden projiziert, erstellen Sie einen Längsschnitt mit der z-Achse vertikal dargestellt. Vor allem führte Gewebe schneiden zu Verlust von Material, so dass Lücken zwischen verknüpften Schichtbilder. Maßstabsleiste = 500 nm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig4.jpg"> 
Abbildung 4: integrierte Intra-Mitochondrien Cristae und Matrix-Netzwerk in 3D gezeigt. (A) Scheiben der mitochondrialen Elektron tomographische Rekonstruktionen zeigen wechselt zwischen lamellaren Membranen durch die z-Achse. (B) Abbildungen von den beobachteten Cristae Muster direkt übergeben und/oder Linkshänder Spiralen wechseln. (C) tomographische Segmentierung zur Veranschaulichung einer linkshändigen Spirale in 3D (D) Cristae umschalten Muster analysiert und Farbe auf das Segmentierungsmodell (E, F) gerendert wurden. Tomographische Scheibe mit seitlichen Matrix Konfluenz (dunkle Rohdichten, rot markiert) über Cristae Membranen (weiße Dichte). (G) Segmentierung der Tomogramm in (E) mit seitlichen Matrix Konfluenz (in rot) Modell und repräsentative Cristae (in grau). Maßstabsleiste = 50 nm (A), 200 nm (C) und 300 nm (D, E, F, G). Die Figur wurde die Neuauflage von Jiang Et al. 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Mitochondrien mit Zwiebel-wie wirbelnde Kernen angesammelt fliegen mit mitochondrialen DNA Replikation Fehler während des Alterns. Repräsentative tomographische Scheiben und die entsprechenden Segmentierung (richtigen Platten) zeigt eine Querschnittsansicht (oben) und einen Längsschnitt Ansicht (unten) aus einem wirbelnden Kern. Volumen-Segmentierung wird durch willkürliche Farbwiedergabe den wirbelnden Kern hervorheben. Maßstabsleiste: 200 nm. Die Figur wurde die Neuauflage von Jiang Et al. 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schritt</td>
			<td colspan="2">Temp</td>
			<td colspan="2">Zeit</td>
			<td colspan="2">Lösung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">-140 ° C bis-9 0 ° C</td>
			<td colspan="2">30 min</td>
			<td colspan="2">Flüssiger Stickstoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">-90 ° C</td>
			<td colspan="2">96 hr</td>
			<td colspan="2">FS-cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">-90 ° C bis-60 ° C</td>
			<td colspan="2">6 h (5 ° C/h)</td>
			<td colspan="2">FS-cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">-60 ° C</td>
			<td colspan="2">12 h</td>
			<td colspan="2">FS-cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">-60 ° C bis-25 ° C</td>
			<td colspan="2">7 hr (5 ° C/h)</td>
			<td colspan="2">FS-cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">-25 ° C</td>
			<td colspan="2">12 h</td>
			<td colspan="2">FS-cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="2">-25 ° C bis 0 ° C</td>
			<td colspan="2">5 h (5 ° C/h)</td>
			<td colspan="2">FS-cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="2">0 ° C</td>
			<td colspan="2">1 hr x 3 Mal</td>
			<td colspan="2">Aceton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="2">Raumtemp</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">Harz-infiltration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Freeze-Substitution-Protokoll.

Watch this Scientific Journal Video about 3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography at JoVE.com

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel von Serial-Abschnitt Elektron Tomographie aufgedeckt

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Anwendung der seriell-Abschnitt Elektron Tomographie, mitochondriale Struktur in Drosophila indirekte Flüge Muskel aufzuklären.

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

3d-mitochondrial-ultrastructure-drosophila-indirect-flight-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

8.5K Aufrufe.  National Taiwan University. In diesem Protokoll demonstrieren wir die Anwendung der seriell-Abschnitt Elektron Tomographie, mitochondriale Struktur in Drosophila indirekte Flüge Muskel aufzuklären.

Serie: 3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissektion von Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Forschung

Genetik

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Entwicklungsbiologie

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Biologie

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at the Drosophila NMJ enables researchers to acquire synaptic information, encompassing both quantitative data on synapse abundance and detailed insights into their morphology. However, the diffuse distribution and limited visual range of the TEM present challenges for the ultrastructural analysis. This study introduces an innovative and efficient sample preparation method that surpasses the conventional approach. The procedure begins by placing a metal mesh at the base of a flat-bottomed bottle or test tube, followed by positioning fixed larvae samples onto the mesh. An additional mesh is placed over the samples, ensuring that they are positioned between the two meshes. The fixed samples are thoroughly dehydrated and infiltrated before proceeding with the embedding procedure. Then embedding of the samples in epoxy resin is performed in a flat sheet manner, which allows for the preparation of muscles for positioning and sectioning. Benefiting from these steps, all the muscles of Drosophila larvae can be visualized under light microscopy, therey facilitating subsequent positioning and sectioning. Excess resin is removed after locating the 6th and 7th muscles of body segments A2 and A3. Serial ultra-thin sectioning of the 6th or 7th muscle is performed.

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

This report provides a new sample preparation procedure for visualizing neuromuscular junctions in Drosophila Larvae. This method is more effective in preventing the curling of the samples compared to the traditional method and is particularly useful for Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

Optimierung des Probenvorbereitungsprozesses für die Transmissionselektronenmikroskopie von neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

Neurowissenschaften

Betrachtung von Mikrotubuli-Netzwerken in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Autor im Rampenlicht: Verständnis des Mikrotubuli-Netzwerks in neuromuskulären Verbindungen von Drosophila 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in<em&gt; Drosophila</em&gt; Ovarien

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

3D mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel von Serial-Abschnitt Elektron Tomographie aufgedeckt

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Dissektion von Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Optimierung des Probenvorbereitungsprozesses für die Transmissionselektronenmikroskopie von neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in