Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Science Foundation (NSF) Nein zu gewähren. IOS 1354956. Wir danken Dr. Andrew D. Warren (McGuire Mitte für Lepidoptera und Biodiversität, Florida Museum of Natural History, University of Florida) für die Erlaubnis zur Verwendung der Schmetterling Bilder.

(1) Insektenarten, Zubereitung von Lösungen und Fütterung Station Setup
Hinweis: Kohl Schmetterlinge (Pieris Rapae L., Pieridae) sind wie die Arten der Vertreter Lepidoptera ausgewählt, weil sie in früheren Studien der Flüssigkeit-Aufnahme Fähigkeiten und Mouthpart Morphologie22,23verwendet wurden. Stubenfliegen (Musca Domestica L., Muscidae) und blaue Flasche fliegt (Hexamerinaufnahme Vomitoria L., Calliphoridae) werden verwendet, da sie oft beobachtet werden, Fütterung auf porösen Oberflächen13.
<ol>
	<li>Bestellung p. Rapae als Larven von einem Insekt Zulieferer und hinten auf künstliche (siehe Tabelle der MaterialienErnährung) bis sie verpuppen sich und erweisen sich als Erwachsene in einer Klimakammer setzen auf 23 ° C und einer 18 L: 6 Photoperiode. Bestellung M. Domestica und C. Vomitoria als Puppen und sie an den gleichen Umweltbedingungen als p. Rapaehinten. Füttern Sie Erwachsenen Schmetterlinge und fliegen nicht, nachdem sie aus den Puppen vor den Fütterungsversuchen hervorgehen.</li>
	<li>Bereiten Sie einen 20 % Saccharoselösung (Kontrolle) und eine 20 % Saccharose Nanopartikel Lösung für flüssige Aufnahme zu testen. Bereiten Sie die Nanopartikel-Lösung durch Zugabe von fluoreszierenden magnetische Nanopartikel (Eisenoxid mit einem Polyacryl Säure-Beschichtung, ca. 20 nm Durchmesser)24 zu einer 20 % Saccharose-Lösung (1 mg/mL dH2O Nanopartikel mit 20 % Saccharose Lösung 1:1). Bereiten Sie eine 1 X Lösung von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (10-fach verdünnt auf 1 X dH2O, pH 7,4), die für Sezierungen verwendet wird.</li>
	<li>Einrichten einer Futterstelle, die aus einer manuellen Manipulator mit einer Klemme und einer separaten Fütterung Bühne (eine flache Plattform) besteht (Abbildung 1). Legen Sie eine konkave Folie auf der Fütterung Bühne und haben Sie Nylon net Filter mit Größe Porendurchmesser von 11, 20, 30, 41 oder 60 µm und Membran-Filter mit Poren Größe Durchmesser von 1, 5, 8 oder 10 µm in der Nähe für die Fütterungsversuche.</li>
</ol>
2. Protokoll Fütterung
<ol>
	<li>Des Insekts Körper, Beine und Flügel in einem gefalteten Seidenpapier einwickeln. Positionieren Sie das Insekt, so dass nur der Kopf und Mundwerkzeuge ausgesetzt sind. Legen Sie die Flügel der Insekten zwischen zwei Objektträger, die durch die Klammer auf der Manipulator zusammengehalten werden, so dass das Insekt über die Fütterung Bühne (Abbildung 1) ausgesetzt ist.</li>
	<li>Verabreichen Sie ein 30 µL Tröpfchen von der 20 % Saccharose-Lösung oder die 20 % Saccharoselösung Nanopartikel mit einer Mikropipette an die Mitte der konkaven Folie. Legen Sie ein einzelnes Filterpapier von einer bestimmten Porengröße auf der konkaven Folie, so dass die Mitte des Filterpapiers mit den Tropfen der Nanopartikel-Lösung ausgerichtet ist. Der Kontakt zwischen den Tropfen und das Filterpapier führt die Lösung entlang dem Filterpapier, füllen die Poren (Abbildung 1). Hinweis: Das Filterpapier wird auf das Droplet, anstatt die andere Weise herum, platziert, um das mögliche Vorhandensein von Nanopartikeln auf dem Filterpapier zu minimieren, wo die Insekten ernähren.</li>
	<li>Positionieren Sie das Insekt mit dem Manipulator, so dass nur die distale Bereiche der die Mundwerkzeuge der benetzte Filterpapier auf der Fütterung Bühne (Abbildung 1) erreichen können. Verwenden Sie eine Insekt Pin zum verlängern die Mundwerkzeuge auf dem Filterpapier und ermöglichen das Insekt zu Futtermittel für 45 s.</li>
	<li>Zur Minimierung der Chance von Insekten ernähren sich von flüssigen Filme, die auf der Oberfläche des Filterpapiers vorhanden sein können, positionieren Sie die Mundwerkzeuge so, dass sie in Kontakt mit einem Teil des Filterpapiers sind, die berührt die flache Seite der Folie (zB. nicht direkt über die konkave Seite der Folie). Wenn das Insekt ein Interesse in der Fütterung nicht zum Ausdruck bringt, können die Mundwerkzeuge auf dem Filterpapier mit dem Insekt-Pin für die Dauer der Fütterung stattfinden.</li>
</ol>
(3) Sezierungen
<ol>
	<li>Legen Sie die PBS-Lösung in einem 50 mm-Uhrglas, so dass es genug Lösung gibt um das Insekt Körper bedecken. Legen Sie das Uhrglas unter ein Stereoskop und Position Insekt sezieren Ausrüstung (Frühling "Micro" sezieren, Schere, Insect Pins, feine Spitze, seziert Zange) neben das Stereoskop.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Fütterung das Insekt aus dem Tissue-Papier und mit Flügeln geschlossen zu halten. Entfernen Sie Kopf, Beine und Flügel der Insekten mit der Feder Mikro sezierenden Schere zu und das Insekt in die PBS-Lösung in das Uhrglas (Abbildung 2).</li>
	<li>Wenn nötig, zu betäuben Insekten vor Dissektionen. Verwenden Sie Zange, um das Insekt durch das Häutchen in der Nähe der distalen Region des Bauches zu halten. Verwenden Sie mit der dominanten Hand den Frühling Micro Präparierscheren, schneiden die Nagelhaut in eine anteriore Richtung entlang der lateralen Seite des Bauches, beginnend am hinteren Ende, bis der Brustkorb erreicht ist. Achten Sie besonders darauf, dass nur die Nagelhaut geschnitten ist und, dass der Verdauungskanal in das Insekt nicht (Abbildung 2 beschädigt).</li>
	<li>Machen Sie weitere Kürzungen der Nagelhaut mit der sezierenden Schere öffnet den Bauch um den Verdauungskanal innen (Abbildung 2) sichtbar zu machen. Entfernen Sie der Abdominal-Kutikula, dicken Körper und andere Strukturen mit Hilfe von Insekten Pins und außerhalb das Uhrglas für anschließende Entsorgung, so dass nur die Thorax und Verdauungskanal in das Uhrglas zu verlagern. Hinweis: Die Zerlegung wird die Ernte zeigen, die was einen Sac-artige Struktur (Verlängerung der Verdauungskanal) in der Nähe der Stelle des Thorax und Abdomen ist.</li>
	<li>Wenn die Ernte nicht ausgesetzt ist, stellen Sie zusätzliche Einschnitte in den Brustkorb mit der Schere bis die Ernte offenbart. Sobald die Ernte sichtbar ist, schneiden Sie die restlichen Teile des Insekts verlassen nur den Verdauungskanal mit der Ernte in das Uhrglas (Abbildung 2). Hinweis: Die Lepidoptera Ernte ist fast transparent und Cellophan-wie in der Natur, die möglicherweise schwer zu erkennen, wenn sie nicht mit Flüssigkeiten gefüllt und erweitert oder wenn es während der Präparation geschnitten wird.</li>
	<li>Verwenden Sie feine Spitze, seziert Zange um die Ernte auf einem Deckgläschen (24 x 24 mm) zu platzieren, für nachfolgende Bildgebung (Abbildung 2).</li>
</ol>
4. Bestimmung des aufgenommenen Nanopartikel
<ol>
	<li>Position der Ernte auf dem Deckglas mit der feinen Spitze sezierenden Zange mit darauf, dass kein bersten die Ernte. Verwenden Sie die CY3 Kanal (oder Phasenkontrast) auf einem inversen konfokalen Mikroskop für die Bildgebung mit 20 X Vergrößerung. Bild der Erntegutes sofort nach Dissektion damit sie nicht austrocknen.</li>
	<li>Halten Sie einen magnetischen Stir bar (41,3 mm Länge und 8 mm Durchmesser) in die Hand, die keine Kontrolle über die Betriebsphase des Mikroskops ist.</li></ol>Welle magnetische Stir Bar hin und her in der Nähe der Ernte (ca. 10 mm Abstand von der Ernte), so dass jedes hin und her Bewegung etwa eine Sekunde (Abbildung 2 dauert).
	<li>Während die magnetischen Stir Bar geschwenkt ist, überprüfen Sie die Ernte für die Nanopartikel. Die Betriebsphase bewegen sich langsam hin und her beim Blick durch das Okular des Mikroskops für Nanopartikel Bewegung innerhalb der fast transparente Ernte. Wenn die Nanopartikel in der Pflanze vorhanden sind, zeigt positive füttern, sie reagieren werden und Welle im Einklang mit der magnetischen bar (Abbildung 2) rühren.</li>

<ol>
	<li>Vijaysegaran, S., Walter, G. H., Drew, R. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouthpart+structure,+feeding+mechanisms,+and+natural+food+sources+of+adult+Bactrocera+(Diptera:+Tephritidae).">Mouthpart structure, feeding mechanisms, and natural food sources of adult Bactrocera (Diptera: Tephritidae).</a> Ann Entomol Soc Am. 90, 184-201 (1997).</li><li>Lehnert, M. S., Monaenkova, D., Andrukh, T., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+feeding+apparatus+and+evolution+of+proboscis+length+in+metalmark+butterflies+(Lepidoptera:+Riodinidae).">Functional morphology of the feeding apparatus and evolution of proboscis length in metalmark butterflies (Lepidoptera: Riodinidae).</a> Biol J Linn Soc. 110, 291-304 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Insekt Mouthpart Funktionalität ist historisch aus Studien von Brutto Morphologie abgeleitet (z. B.., Lepidoptera Rüssel Funktionalität im Zusammenhang mit einem trinken Stroh25,-26); jedoch haben neuere Studien, die experimentelle Beweise enthalten einen Paradigmenwechsel im Verständnis von der Komplexität der Insekten Mundwerkzeuge und Struktur-Funktions-Beziehungen-2,-12,-<sup ...

Viele Insektengruppen haben Mundwerkzeuge (Proboscises) geeignet für die Fütterung auf Flüssigkeiten, wie Nektar, faulenden Früchten, sap, fließt (z.B. Diptera1, Lepidoptera2, Hymenoptera3), Xylem (Hemiptera4), Tränen (Lepidoptera ( 5), und Blut (Phthiraptera6, besitzen7, Diptera7, Hemiptera8, Lepidoptera9). Die Fähigkeit der Insekten ernähren sich von Flüssigkeiten ist Krankheit Getriebe4,11, Biodiversification2,12, Studien und Ökosystem Gesundheit (z. B. Bestäubung10) konvergente Entwicklung13. Trotz der Vielzahl von Nahrungsquellen ist ein Thema unter einigen Insekten Fluid-Fütterung die Möglichkeit, kleine Mengen von Flüssigkeiten, zu erwerben, die auf Mikro-Nano-Größe oder Tropfen, Flüssigkeitsfilme oder porösen Oberflächen beschränkt werden könnte.
Angesichts der umfangreichen Vielfalt der Flüssigkeit-Fütterung Insekten (mehr als 20 % aller Tierarten14,15) und ihre Fähigkeit, auf einer Vielzahl von Nahrungsquellen ernähren, verstehen ihre Fütterung Verhaltensweisen und Mechanismen der Flüssigkeit-Aufnahme ist in vielen Bereichen wichtig. Insekt Mouthpart Funktionalität, hat zum Beispiel eine Rolle bei der Entwicklung von Biomimetic-Technologie, z.B., mikrofluidischen Geräte, die Aufgaben wie der Erwerb von geringen Mengen an Flüssigkeiten mit Methoden, die ähnlich wie die Beschäftigten können durch Insekten16. Ein grundlegendes Problem in den Studien der flüssige Aufnahme Mechanismen, jedoch ist bestimmen nicht nur, wie Insekten auf Flüssigkeiten ernähren, aber experimentelle Beweise, dass den Mechanismus unterstützt zu erwerben. Allein mit Verhalten (z. B. mit dem Rüssel12,17sondieren) als Indikator für die Fütterung unzureichend, ist weil es nicht die erfolgreiche Aufnahme von Flüssigkeiten bestätigen, noch es ein Mittel bietet, um die Route zu bestimmen, Flüssigkeiten zu reisen als Durchgang durch das Insekt. Darüber hinaus stellt die Durchführung von Experimenten mit kleinen Mengen an Flüssigkeiten besser natürliche Fütterung Szenarien, wo Flüssigkeiten eine begrenzende Ressource2,12sind.
X-ray Phase Kontrast Bildgebung mit der Monarchfalter (Danaus Plexippus L.) verwendet wurde, um zu beurteilen, wie Schmetterlinge auf kleine Mengen von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen12ernähren. Monarchfalter verwenden Kapillarwirkung über Leerzeichen zwischen kutikulären Projektionen (dorsale Legulae) entlang der Rüssel, um Flüssigkeiten beschränkt sich auf kleine Poren in den Lebensmittel-Kanal zu bringen. Die eingehenden Flüssigkeiten bilden einen Film auf der Nahrung Kanalwand, das wächst und bricht in eine flüssige Brücke durch Plateau Instabilität12,18, das dann durch Einwirkung der saugende Pumpe in den Kopf, der Schmetterling Darm transportiert wird. Obwohl Röntgenbildgebung Phase Kontrast ein optimales Werkzeug zur Visualisierung von Strömung innerhalb der Insekten12,19,20,21, die Technik ist nicht leicht zugänglich und ein bequemer Methode für schnelle Einschätzung eines Insekts Fähigkeit zur Aufnahme von Flüssigkeiten benötigt wird und schlucken sie.
Um festzustellen, ob die Fütterung Mechanismus für D. Plexippus anderer Lepidoptera und auch fliegen (Diptera) (beide Gruppen ernähren sich von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen), gilt Lehnert Et Al. 13 angewendet eine Technik für die Beurteilung eines Insekts Fähigkeit, ernähren sich von kleinen Mengen an Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen, die hier ausführlich berichtet wird. Obwohl das Protokoll hier skizzierten für Studien, mit denen benetzt und porösen Oberflächen ist, kann die Methodik für andere Studien, wie die Adressierung Pool-Fütterung Mechanismen geändert werden. Darüber hinaus erweitern die Anwendungen in anderen Bereichen, einschließlich der Mikrofluidik und Muskelmodelle Technologie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% sucrose solution</td>
			<td>Domino Sugar</td>
			<td></td>
			<td>Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single depression concave slide</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>BS-C6</td>
			<td>Slide is necessary for feeding stage setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NY6004700 (60 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NY4104700 (41 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NY3004700 (30 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NY2004700 (20 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NY1104700 (11 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>TCTP04700 (10 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>TETP04700 (8 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>TMTP04700 (5 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>RTTP04700 (1 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris microdissecting scissors</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>623555</td>
			<td>Scissors used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins (#1)</td>
			<td>Bioquip Products</td>
			<td>1208B1</td>
			<td>Pins used during dissections and feeding trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-fine point dissecting forceps</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>624684</td>
			<td>Dissecting equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 C Stereoscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M205 C</td>
			<td>Stereoscope used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>S68067</td>
			<td>Magnet used to detect nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Tissues used to secure insects during feeding trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>House fly (Musca domestica) pupae</td>
			<td>Mantisplace.com</td>
			<td></td>
			<td>insects for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae</td>
			<td>Mantisplace.com</td>
			<td></td>
			<td>insects for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>144102</td>
			<td>insects for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4641080N</td>
			<td>micropipette for dispensing liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finntip 250 pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>9400250</td>
			<td>micropipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm)</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>CS-S24-100</td>
			<td>coverslips for viewing the insect&#39;s crop on confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the ingestion of fluorescent, magnetic nanoparticles for determining fluid-uptake abilities in insects

Flüssigkeit-Fütterung Insekten nehmen eine Vielzahl von Flüssigkeiten, die in der Umwelt als Pools, Filme, oder beschränkt sich auf kleine Poren. Studien von flüssigen Erwerb erfordern Beurteilung Mouthpart Struktur und Funktion Beziehungen; flüssige Aufnahme Mechanismen sind jedoch historisch aus der Beobachtung der strukturellen Architektur, manchmal ohne Begleitung mit experimentellen Beweis abgeleitet. Hier berichten wir über eine neuartige Methode zur Beurteilung der Fähigkeiten der Flüssigkeit-Aufnahme mit Schmetterlingen (Lepidoptera) und fliegen (Diptera) mit kleinen Mengen von Flüssigkeiten. Insekten werden mit 20 % Saccharose-Lösung gemischt mit Leuchtstofflampen, magnetische Nanopartikel aus Filterpapiere bestimmten Porengrößen gefüttert. Die Ernte (interne Struktur zum Speichern von Flüssigkeiten verwendet) ist das Insekt entnommen und auf einem confocal Mikroskop gelegt. Ein Magnet ist winkte, von der Ernte, das Vorhandensein von Nanopartikeln, zu bestimmen, die angeben, ob die Insekten Flüssigkeiten aufnehmen können. Diese Methode wird verwendet, um einen weit verbreiteten Fütterung Mechanismus (Kapillarwirkung und flüssigen Brückenbildung) aufzudecken, der möglicherweise unter Lepidoptera und Diptera geteilt wird, bei der Fütterung von porösen Oberflächen. Darüber hinaus können mit dieser Methode für Studien der Fütterung Mechanismen unter einer Vielzahl von Flüssigkeit-Fütterung Insekten, darunter diejenigen wichtig in einer Krankheitsübertragung und Biomimetik und möglicherweise andere Studien, die Nano-Mikro-Größe oder Leitungen beinhalten wo Flüssigkeitstransport erfordert Überprüfung.

Die Studie der Muster in Flüssigkeit-Aufnahme Fähigkeiten unter Flüssigkeit-Fütterung Insekten erfordert Entschlossenheit der Fütterung auftreten. Das Protokoll hier skizzierten wird verwendet, um die begrenzende Pore Größe Hypothese unter Lepidoptera und Diptera13. Die begrenzende Pore Größe Hypothese besagt, dass Flüssigkeit-Fütterung Insekten aus Flüssigkeit gefüllten Poren nicht ernähren können, wenn der Porendurchmesser Größe kleiner als der D...

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The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Flüssigkeit-Fütterung Insekten haben die Fähigkeit, kleinste Mengen von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen zu erwerben. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode um die Fähigkeit der Insekten zu Verschlucken von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen mit Fütterung Lösungen mit Leuchtstofflampen, magnetische Nanopartikel direkt zu bestimmen.

Die Einnahme von Leuchtstofflampen, magnetische Nanopartikel für die Bestimmung der Fluid-Aufnahme Fähigkeiten bei Insekten

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

the-ingestion-fluorescent-magnetic-nanoparticles-for-determining

Research

JoVE Journal

Biology

6.3K Aufrufe.  Kent State University at Stark. Flüssigkeit-Fütterung Insekten haben die Fähigkeit, kleinste Mengen von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen zu erwerben. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode um die Fähigkeit der Insekten zu Verschlucken von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen mit Fütterung Lösungen mit Leuchtstofflampen, magnetische Nanopartikel direkt zu bestimmen.

Serie: The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which include many crops such as cabbage, broccoli, Brussel sprouts etc. Rearing of the insects takes place on cabbage plants in the greenhouse. At least two cages are needed for the rearing of Pieris rapae. One for the larvae and the other to contain the adults, the butterflies. In order to investigate the role of plant hormones and toxic plant chemicals in resistance to this insect pest, we demonstrate two experiments. First, determination of the role of jasmonic acid (JA - a plant hormone often indicated in resistance to insects) in resistance to the chewing insect Pieris rapae. Caterpillar growth can be compared on wild-type and mutant plants impaired in production of JA. This experiment is considered "No Choice", because larvae are forced to subsist on a single plant which synthesizes or is deficient in JA. Second, we demonstrate an experiment that investigates the role of glucosinolates, which are used as oviposition (egg-laying) signals. Here, we use WT and mutant Arabidopsis impaired in glucosinolate production in a "Choice" experiment in which female butterflies are allowed to choose to lay their eggs on plants of either genotype. This video demonstrates the experimental setup for both assays as well as representative results.

Plant resistance to chewing insect herbivores can be tested in several ways. Here, we demonstrate how to set-up a choice and a no-choice experiment with the model plant Arabidopsis thaliana to identify resistance against the pest species Pieris rapae.

Auswahl und No-Choice Tests zur Prüfung der Beständigkeit von A. thaliana zu Fraßinsekten

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

Forschung

Biologie

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Zählen und Bestimmung der Lebensfähigkeit von kultivierten Zellen

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

Bestimmung des Beitrages der Energy Systems während des Trainings

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to study the functions and evolution of bacterial symbionts in their host. As most symbionts cannot be cultured in vitro, methods to isolate an adequate quantity of bacteria for genome sequencing are very important. In the whitefly Bemisia tabaci, a number of endosymbionts have been identified and are predicted to be of importance in the development and reproduction of the pests through multiple approaches. However, the mechanism underpinning the associations remains largely unknown. The obstacle partially comes from the fact that the endosymbionts in whitefly, mostly restrained in bacteriocytes, are hard to separate from the host cells. Here we report a step-by-step protocol for the identification, extraction and purification of endosymbionts from the whitefly B. tabaci mainly by dissection and filtration. Endosymbiont samples prepared by this method, although still a mixture of different endosymbiont species, are suitable for subsequent genome sequencing and analysis of the possible roles of endosymbionts in B. tabaci. This method may also be used to isolate endosymbionts from other insects.

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Here, we present a protocol to isolate endosymbionts from the whitefly Bemisia tabaci through dissection and filtration. After amplification, the DNA samples are suitable for subsequent sequencing and study of the mutualism between endosymbionts and whitefly.

Methoden zur Extraktion von Endosymbionten aus der Whitefly<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /(T1)Magnetic Resonance Imaging

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible synthetic procedures. In this case, starting from FeCl3 and citrate trisodium salt, iron oxide nanoparticles coated with citric acid are obtained in 10 min in the microwave. These nanoparticles present a small core size of 4.2 &#177; 1.1 nm and a hydrodynamic size of 7.5 &#177; 2.1 nm. Moreover, they have a high longitudinal relaxivity (r1) value of 11.9 mM-1&#183;s-1 and a modest transversal relaxivity value (r2) of 22.9 mM-1&#183;s-1, which results in a low r2/r1 ratio of 1.9. These values enable positive contrast generation in magnetic resonance imaging (MRI) instead of negative contrast, commonly used with iron oxide nanoparticles. In addition, if a 68GaCl3 elution from a 68Ge/68Ga generator is added to the starting materials, a nano-radiotracer doped with 68Ga is obtained. The product is obtained with a high radiolabeling yield (&#62; 90%), regardless of the initial activity used. Furthermore, a single purification step renders the nano-radiomaterial ready to be used in vivo.

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /T1Magnetic Resonance Imaging

Here, we present a protocol to obtain 68Ga core-doped iron oxide nanoparticles via fast microwave-driven synthesis. The methodology renders PET/(T1)MRI nanoparticles with radiolabeling efficiencies higher than 90% and radiochemical purity of 99% in a 20-min synthesis.

Synthese von 68-Ga-Kern-dotierte Eisenoxid-Nanopartikeln für Dual Positronen-Emissions-Tomographie / (T1) Magnetic Resonance Imaging

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible ...

High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are essential for predicting responses to climate change. This work describes two high-throughput protocols for measuring insect thermal limits: one for assessing critical thermal minima (CTmin), and the other for assessing heat knock down time (KDT) in response to a static heat stressor. In the CTmin assay, individuals are placed in an acrylic-jacketed column, subjected to a decreasing temperature ramp, and counted as they fall from their perches using an infrared sensor. In the heat KDT assay, individuals are contained in a 96 well plate, placed in an incubator set to a stressful, hot temperature, and video recorded to determine the time at which they can no longer remain upright and move. These protocols offer advantages over commonly used techniques. Both assays are low cost and can be completed relatively quickly (~2 h). The CTmin assay reduces experimenter error and can measure a large number of individuals at once. The heat KDT protocol generates a video record of each assay and thus removes experimenter bias and the need to continuously monitor individuals in real time.

Thermal limits can predict the environments organisms tolerate, which is valuable information in the face of rapid climate change. Described here are high-throughput protocols to assess critical thermal minima and heat knockdown time in insects. Both protocols maximize the throughput and minimize the cost of the assays.

High-Throughput-Tests kritischer thermischer Grenzwerte bei Insekten

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are ...