Thermische Toleranz ist ein entscheidender Bestandteil der Artenverteilungen und Reaktionen auf den Klimawandel. Hier bieten wir Methoden zur schnellen Beurteilung der Wärme- und Kältetoleranz bei kleinen Insekten. Diese Methoden zur Messung der Kältetoleranz über die kritische thermische Mindest- und Wärmetoleranz über die abgeschlagene Wärmezeit sind durchdiesam, halbautomatisch und erfordern minimale Ausrüstung.
Demonstriert wird das Verfahren von David Awde, einem Postdoc aus meinem Labor. Um einen kritischen thermischen Mindesttest einzurichten, schalten Sie ein temperaturgeregeltes Flüssigkeitsbad ein und drücken Sie die Spieltaste, um ein Programm auszuführen, wobei die Temperatur des Bades auf 25 Grad Celsius erhöht und beibehalten wird. Warten Sie fünf bis zehn Minuten, bis die flüssige Badsäule 25 Grad Celsius erreichen kann, bevor Sie den Stecker oben in der Säule durch einen Filter mit einem Durchmesser von 5,08 Zentimetern ersetzen.
Tippen Sie etwa 40 Fliegen von ihrer Nahrungsflasche in die Säule durch den Trichter und ersetzen Sie schnell den Trichter mit dem Stecker, wobei darauf geachtet wird, dass keine Fliegen entkommen. Dann lassen Sie die Fliegen zu begleichen. Gelegentlich tippen Sie auf den unteren Stecker, um die Fliegen zum Klettern zu ermutigen.
Nach fünf Minuten drücken Sie den Startknopf am Flüssigkeitsbadverstärkung, um das kritische thermische Minima-Ramping-Programm zu starten. Klicken Sie hier, um die Thermopaaraufzeichnungssoftware auf dem Computer zu öffnen, und klicken Sie auf Datensatz, um die Aufzeichnung der Temperatur in der Spalte zu beginnen, jede Sekunde für die Dauer des Assays. Stellen Sie sicher, dass jede Temperaturaufzeichnung den für den zweiten Zeitstempel spezifischen Zeitstempel enthält, damit Temperaturdaten später mit Daten aus dem Drosophila-Trichtermonitor zusammengeführt werden können.
Fügen Sie fünf Milliliter 90% Ethanol zu einem 15 Milliliter konischen Zentrifugenrohr hinzu und legen Sie das Rohr in ein Rack unter der Säule. Gelegentlich tippen Sie auf den unteren Stecker der Säule, um alle Fliegen auf der Unterseite zum Klettern zu locken. Die meisten Fliegen werden auf einem Barsch oder in der Nähe der Spitze der Säule um 15 Grad Celsius sein.
Bei 15 Grad Celsius einen 75 Millimeter äußeren Durchmesser Glastrichter in den Drosophila Trichtermonitor legen. Entfernen Sie den unteren Stecker und sammeln Sie alle Fliegen noch auf dem Stecker in das Ethanol. Stellen Sie den Retortenring, den Trichtermonitor und den Trichter so ein, dass sie sich unter der Säule befinden.
Stellen Sie sicher, dass die Lippe des Trichters den Boden der Säule vollständig versiegelt und den Boden des Trichters in das 15-Milliliter-Sammelrohr einfügt. Öffnen Sie die Drosophila Trichtermonitor-Software. Die Software wird sofort die Aufzeichnung der Zeit und des Datums, an dem die Fliegen ihre kritische thermische Minima erreichen.
Fliegen, die ihre kritische thermische Minima erreichen, verlieren ihre neuromuskuläre Funktion und fallen von ihren Barsche, durch den Drosophila Trichtermonitor. Um zu überwachen, ob alle Fliegen ihre kritische thermische Minima erreicht haben, wenn die Temperatur sinkt, überprüfen Sie den oberen Stecker und Barsche, um zu sehen, ob irgendwelche Fliegen noch thront. Wenn alle Fliegen ihre kritische thermische Minima erreicht haben, bewegen Sie den Drosophila Trichtermonitor und trichtern Sie von der Säulenöffnung weg.
In seltenen Fällen können Fliegen ihre kritische thermische Minima erreichen, aber in der Säule stecken bleiben. Öffnen Sie den oberen Stecker, um diese Fliegen zu entfernen. Um einen hohen Durchsatz Hitze niedergeschlagen Assay, verwenden Sie einen Aspirator und SeptumDeckel, einzelne Kohlendioxid sedierte Fliegen zu laden, in jeden Brunnen eines modifizierten 96 Brunnen keine Bodenplatte und versiegeln Sie die Platte mit einem klaren dicht sitzenden Deckel.
Dann legen Sie den Teller über eine Versorgung mit Lebensmitteln und lassen Sie die Fliegen an die 96 Brunnenplatte für mindestens 48 Stunden zu akklimatisieren. Legen Sie am Tag des Assays den Brutkasten auf 37,5 Grad Celsius, nach 30 Minuten legen Sie die Fliegenkulturplatte in den Inkubator mit dem Boden der Platte gegen das weiße Papier auf der Unterseite des Tabletts. Beachten Sie die Ausrichtung der Brunnenspalten- und Zeilennamen auf dem Fach und im Rahmen der Webcam und platzieren Sie farbiges Klebeband an den Seiten und Rändern der Platte, um die Ausrichtung zu überprüfen.
Wenn die Platte in Position ist, schließen Sie die Inkubatortür und klicken Sie in der Videoaufzeichnungssoftware auf Aufnahme. Überprüfen Sie nach zwei Stunden die Aufzeichnung, um festzustellen, ob alle Fliegen ihren letzten Rastplatz erreicht haben und sich nicht mehr bewegen. Wenn sich alle Fliegen nicht mehr bewegen, klicken Sie auf Stopp und entsorgen Sie die Fliegen.
Öffnen Sie die Videodatei und zeichnen Sie die Knockdown-Zeit jeder Fliege in jedem Brunnen auf. Das beständigste Maß für die Hitze, die zwischen den Versuchen und Beobachtungen heruntergeschlagen wird, ist die Zeit, zu der eine Fliege ihren letzten Ruhepunkt erreicht. Verfolgen Sie dann das Video rückwärts, konzentrieren Sie sich auf einen einzigen Brunnen und notieren Sie die Zeit, zu der sich die Fliege zuerst von ihrem letzten Ruheplatz entfernt.
Die Bestimmung der letzten Ruhezeit jeder Fliege kann schwierig sein. Um eine genaue Analyse zu gewährleisten, ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen und jeden gut zu beobachten. In dieser repräsentativen Analyse wiesen Weibchen aus der Drosophila-Genreferenztafellinie deutlich niedrigere mittlere thermische Minimatemperaturen auf als Weibchen aus der DGRP-Linie 714.
Darüber hinaus ist die Hitzeabsenkungszeit bei 37,5 Grad Celsius, unterscheiden sich deutlich zwischen den Weibchen von den 73 und 461 DGRP Linien. Bei geringfügigen Änderungen könnte diese Methode zur Messung der abgeschlagenen Wärmezeit verwendet werden, um andere thermische Toleranzmerkmale zu messen, wie z. B. die Kühlkoma-Rückgewinnungszeit oder das kritische thermische Maximum. Durch die deutliche Verkürzung der praktischen Zeit für die Forscher haben diese Methoden die Erforschung genetischer Variationen und thermischer Toleranzmerkmale in einem Ausmaß ermöglicht, das bisher nicht möglich war.
