Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST, 105-2320-B-010-007-MY3, PCC), von den National Health Research Institute (NMRI-EX105-10215BC, PCC), des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (die meisten 105-2314-B-400-019 zu HJK) und aus den National Health Research Institute (NMRI MG-105-SP-10, NMRI MG-106-SP-10 bis HJK). Diese Arbeit wurde auch teilweise mit National Yang-Ming University Manuskript Publikation PCC unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder Wiedergutmachung des Manuskripts.

1. Vorbereitung des Baculovirus Ausdruck Konstrukte
<ol><li>
SUMO-E3-Ligase K-bZIP durch Klonen die cDNA von K-bZIP19 in eine duale Expressionsvektor Baculovirus zu reinigen (siehe Tabelle der Materialien) mit einem N-terminale Epitop-Tag. Wir hatten Erfolg mit einem Octapeptide Tag (angegeben im gesamten Protokoll als Vektor-Tag-K-bZIP). Hinweis: Die DNA-Vorlage für K-bZIP Polymerase Kettenreaktion (PCR) Klonen ist cDNA reverse transkribiert von RNA isoliert von TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 Zellen nach Doxycyclin Behandlung20.<ol>
<li>Übertrage die Full-length K-bZIP cDNA19 in den dualen Ausdruck Vektor mit Cpoich Klonen Websites. CPO Das PCR-Produkt und 1 µg des dual Expressionsvektors bei 37 ° C für 3 h21zu verdauen.</li>
		<li>Trennen Sie und extrahieren Sie die verdaute DNA Elektrophorese im Anschluss an eine 0,8 % Agarose-Gel-22. Verbinden des Einsatzes (K-bZIP) und Vektor von T4 DNA-Ligase bei 16 ° C für 30 min nach Herstellerangaben (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Fügen Sie 5 µL der Ligatur DNA zu 50 µL kompetente E. Coli Zellen "A" (siehe Tabelle of Materials) in einer 1,5 mL Tube. Für 30 min auf Eis gelegt. Dann inkubieren der 1,5 mL Tube im Wasserbad 42 ° C für 45 s und habe sofort das Rohr für 3 min auf Eis.</li>
		<li>Fügen Sie 600 µL S.O.C. Medium (0,5 % (w/V) Hefeextrakt, 2 % (w/V) Tryptone 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO4und 4 % (w/V) Glukose) in die Röhre und Inkubation bei 37 ° C für 1 h. Dann Zentrifugieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 3 min bei 600 X g.</li>
		<li>Entfernen Sie überstand, Aufschwemmen Pellet mit 60 µL Luria-Bertani Medium (LB; 1 % (w/V) Tryptone, 0,5 % (w/V) Hefe-Extrakt und 85 mM NaCl) und verteilt auf LB-Agar-Platten mit 100 µg/mL Ampicillin. Inkubieren Sie die Agarplatte bei 37 ° C für 16 h23,24.</li>
		<li>Wählen Sie 1 Kolonie in 5 mL LB-Medium mit 100 µg/mL Ampicillin und Kultur bei 37 ° C 16 h mit 250 u/min schütteln zu impfen. Extrahieren Sie das Plasmid, Vektor-Tag-K-bZIP, durch ein Plasmid Extraktion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generieren der rekombinanten Bacmid beherbergen die bZIP-K-Tag durch Umwandlung von Vektor-Tag-K-bZIP in kompetente E. Coli Zellen "B" (siehe Tabelle der Materialien).
	<ol>
<li>Mischen Sie 0,2 µg Vektor-Tag-K-bZIP Plasmid und 100 µL kompetente E. coli Zellen "B" in einem 1,5 mL-Tube und auf Eis für 30 min. Inkubieren Sie das Rohr in der 42 ° C Wasserbad für 45 s und habe sofort das Rohr für 3 min auf Eis.</li>
		<li>Fügen Sie 900 µL des S.O.C. Mediums in das Rohr und Inkubation bei 37 ° C für 4 h mit Rotation bei 50 Umdrehungen pro Minute. Als nächstes nehmen Sie 10 µL des Mediums, fügen Sie eine zusätzliche 50 µL S.O.C Medium auf LB-Agar-Platten mit 50 µg/mL Kanamycin, 7 µg/mL Gentamicin, 10 µg/mL Tetracyclin, 100 µg/mL Galaktosidase Substrat und 40 µg/mL Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG verteilen ), und die Platten für 48 h bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Eine weiße Kolonie in 5 mL LB-Medium mit 50 µg/mL Kanamycin, 7 µg/mL Gentamicin und 10 µg/mL Tetracyclin zu impfen. Inkubation bei 37 ° C mit 250 u/min schütteln für 16 h.</li>
		<li>Isolieren Sie der rekombinanten Bacmid DNA beherbergen die bZIP-K-Tag, quantifizieren Sie und erneut in einer Konzentration von 1 µg/µL25auszusetzen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rekombinante Baculoviren Tag K bZIP zu äußern, indem transfecting 1 µg der rekombinanten Bacmid DNA mit Tag-K-bZIP in Sf9 Zellen in einen Brunnen von einem 6-Well-Platte zu generieren.
	<ol>
<li>2 x 106 Sf9 Samenzellen (siehe Tabelle der Materialien) in 2 mL Grace Insekt Medium geliefert mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Gentamicin in jedem der 6-well-Platte gut, dann Inkubation bei 27 ° C für 1 h.</li>
		<li>Pflegen eine Log-Phase-Kultur Sf9 Zellen Grace Insekt Medium mit 10 % FBS, 1 % Gentamicin und 1 % Waschmittel C geliefert (siehe Tabelle der Materialien) bei 27 ° C im orbital Aussetzung bei 140 u/min. Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und Trypan blau Färbung; Zellviabilität sollte 95 % überschreiten. Pflegen Sie Zellen mit einer Zellfläche-Verhältnis von 1:3 alle 2-3 Tage (minimale Dichte ~0.5 X 106 Zellen/mL).</li>
		<li>Fügen Sie 2 µL Bacmid DNA (1 µg/µL) und 98 µL reduziert Serum Media (siehe Tabelle der Materialien) in eine 2 mL-Tube. Fügen Sie 4 µL Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien), Rohr und gut mischen. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.</li>
		<li>Diese Transfektion Mischung (104 µL) in jede Vertiefung, und Inkubation bei 27 ° C für 12-16 Uhr.</li>
		<li>Entfernen Sie erschöpfte Medien mit sanften Aspiration und ersetzen durch 2 mL frische Graces Insekt Medium mit 10 % FBS und 1 % Gentamicin geliefert. Die Sf9 Zellen halten locker an der Plattenoberfläche und nicht mit sanften Aspiration gestört werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammeln Sie rekombinante Baculovirus nach Transfektion und verstärken Sie Baculovirus um hohe Titer Bestände (P1) für weitere Experimente zu erhalten.
	<ol>
<li>72 h nach dem Wechsel Medium, kratzen die Sf9 Zellen mit Hilfe einer sterilen Zelle Lifter, sammeln den Überstand aus jedem einzelnen Brunnen in einem 1,5 mL-Tube und Wirbel für 10 s.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 4 ° C für 3 min bei 150 X g. sammeln Überstand als P0 Baculovirus und Aliquot in 1,5 mL Röhrchen (1 mL Baculovirus in jedem Röhrchen). Shop bei-80 ° C.</li>
		<li>1 x 107 Sf9 Samenzellen in 10 mL Grace Insekt Medium mit 10 % FBS und 1 % Gentamicin in einer 10 cm Petrischale geliefert und bei 27 ° C 1 h inkubieren.</li>
		<li>Zur Verstärkung des rekombinanten Baculoviren mit dem Ausdruck ihrer Tag-K-bZIP ausgesät Sf9 Zellen 0,5 mL P0 Baculovirus hinzu und Inkubation bei 27 ° C für 48 h.</li>
		<li>Sammeln Sie überstand als P1 Baculovirus in eine 15 mL-Tube und speichern bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Reinigung des K-bZIP
<ol><li>Erhalten Sie eine Protokoll Phase Kultur Sf9 Zellen Grace Insekt Medium mit 10 % FBS, 1 % Gentamicin und 1 % Waschmittel C bei 27 ° C im orbital Aussetzung bei 140 u/min geliefert, wie unter Punkt 1.3.2 beschrieben.</li>
	<li>Am Tag der Transduktion fügen Sie 1 mL Baculovirus-haltigen überstand (P1) in 250 mL Sf9 Zellen mit einer Dichte von 2 x 106 Zellen/mL.</li>
	<li>Inkubieren Sie Sf9 Zellen für 72 h bei 27 ° C auf einem Orbitalschüttler mit 140 u/min schütteln, dann sammeln Sie durch Zentrifugation bei 2.740 x g für 15 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie überstand und lyse der Zelle Pellets in 10 mL Lyse Puffer (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M NaCl, 1 % Waschmittel ein (siehe Tabelle der Materialien), 2 % Glycerin, Protease-Inhibitor cocktail) und 50 u/min mit einer Federung Mixer bei 4 ° C für 30 min drehen.</li>
	<li>Zentrifuge Zelle lysate 15.000 x g für 15 min. Überstands zu sammeln.</li>
	<li>Tag-K-bZIP zu reinigen, brüten Sie Zelle Lysates (10 mL) mit 50 µL Antikörper Verschlagwortet mit magnetischen Beads in 14 mL Polypropylenröhrchen, und bei 50 u/min für 3 h bei 4 ° C mit einem Mixer Aufhängung drehen. Nach Einnahme von Protein, pellet-Perlen bei 800 x g Zentrifugation für 30 s bei 4 ° C. Entfernen die meisten des Überstands erneut aussetzen der Perlen in das Restvolumen von ca. 1 mL und übertragen auf einen 1,5 mL-Tube zum Waschen.</li>
	<li>Waschen Sie das aufgenommene Protein zu, indem man die Röhrchen mit den Perlen auf einem Magnetstativ, und entfernen Sie den Überstand zu, sobald die magnetische Beads vollständig auf die Seite des Rohres eingehalten haben.</li>
	<li>
Waschen Sie die Perlen mit Lyse Puffer viermal.
	<ol>
<li>Fügen Sie 1 mL Lyse Puffer in 1,5 mL Röhrchen und invertieren Sie die Rohre 10 Mal. Ein Magnetstativ setzen Sie der 1,5 mL Tube auf und entfernen Sie des Überstands wie unter 2.7 beschrieben.</li>
		<li>Wiederholen Sie den vorherigen Schritt noch 3 Mal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Waschen Sie die Perlen mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) einmal.
	<ol>
<li>Fügen Sie 1 mL PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4) in 1,5 mL Röhrchen und invertieren Sie die Röhren 10-Mal.</li>
		<li>Ein Magnetstativ setzen Sie der 1,5 mL Tube auf und entfernen Sie dann den überstand.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluieren Sie Tag K bZIP Protein aus der Antikörper-Verschlagwortet mit magnetischen Beads durch Zugabe von 100 µL 150 µg/mL Octapeptide mit PBS-Puffer in ein Rohr von 1,5 mL verdünnt. Drehen Sie das Rohr für 10 min bei 50 u/min durch Aussetzung Mischer bei Raumtemperatur. Dann setzen Sie den Schlauch wieder auf die Magnetstativ und sammeln des K-bZIP-haltigen Überstands in ein sauberes 1,5 mL-Tube.</li>
	<li>1 bis 5 µL gereinigt Tag K bZIP Protein durch SDS-PAGE gefolgt von Coomassie blaue Färbung26zu analysieren. Laden Sie 2 µg, 1 µg und 0,5 µg Proben von Rinderserumalbumin (BSA) auf dem gleichen gel und verwenden es für die Quantifizierung mit einem Bildbearbeitungsprogramm wie ImageJ. Schätzen Sie K-bZIP Konzentration im Vergleich zu den BSA-Standards.</li>
	<li>Die gereinigten K-bZIP ist nun bereit, in jeder Sumoylierung Assay verwendet werden. Verdünnen Sie die K-bZIP mit PBS-Puffer, eine Endkonzentration von 100 ng/µL und Store in kleinen Aliquote bei-80 ° C.</li>
</ol>(3) Sumoylierung Assay
<ol><li>Fügen Sie 3 µL von 100 ng/µL des gereinigten Tag-K-bZIP in den master-Mix für jedes in-vitro- Sumoylierung Reaktion. Komponenten in master-Mix enthalten 1 µL Protein Puffer, 1 x Sumoylierung Puffer, 0,5 µL p53 Protein (0,5 mg/mL), 25 nM E1 aktiviert Enzym (Lager Konz.: 1 µM), 50 nM E2 Konjugation Enzym (Lager Konz.: 10 µM), und 250 nM von der SUMO-Peptiden (SUMO-1 , SUMO-2 oder SUMO-3; Lager Konz.: 5 µM) zu einem Endvolumen von 17 µL.</li>
	<li>Den Inhalt vorsichtig mischen und die Reaktion bei 30 ° C inkubieren, 3 h. Stop die Reaktion durch Zugabe von 20 µL 2 x SDS-PAGE laden Puffer (100 mM Tris-HCL pH 6,8, 4 % Sodium Dodecyl Sulfat, 0,2 % (w/V) Bromophenol Blue, 20 % (V/V) Glycerin und 200 mM β-Mercaptoethanol) und denaturieren Sie die Proben bei 95 ° C für 5 min.</li>
	<li>
Separate Proben auf SDS-PAGE, die getrennten Proteine auf PVDF Membran mithilfe eine halbtrockene elektrophoretische Transfer-Gerät übertragen und analysieren von Western-Blot mit Anti-p53-Antikörper.
	<ol>
<li>Richten Sie den Gel-Apparat wie in Schritt 2.11 und laden Sie 20 µL der Probe in Gel Brunnen.</li>
		<li>Führen Sie das 10 % Gel in einen konstanten Strom bei 80 V für ca. 120 min (bis die Farbstoff-Band das Ende des Gels erreicht). Schalten Sie nach Abschluss der Elektrophorese die Stromversorgung.</li>
		<li>Trennen Sie das Gel Apparat und Gel-Kassetten, nehmen Sie das Gel und schweben Sie das Gel in semi-dry Transfer Puffer (48 mM Tris-HCl, 39 mM Glycin, 20 % Methanol) für 5 min zu.</li>
		<li>Nehmen Sie einen anderen Container und Einweichen Sie die PVDF-Membran in Methanol für 1 min. Dann nehmen Sie PVDF aus Methanol und in semi-dry Transfer Puffer. Schütteln Sie sanft die Membran für 5 Minuten.</li>
		<li>Entfernen Sie die Sicherheitsabdeckung der halbtrockene elektrophoretischen Vorrichtung.</li>
		<li>Vornässen Filterpapier, und einen Gel-Sandwich auf der Unterseite Platin-Anode wie folgt vorbereiten: Filterpapier, PVDF-Membran, Gel und Filterpapier.</li>
		<li>Sichere Kathode Platte und Sicherheit Abdeckung, führen Sie dann Fleck bei 15 V Konstantstrom für 90 min. Drehen Sie die Stromversorgung trennen halbtrocken Apparat, und nehmen Sie die PVDF-Membran.</li>
		<li>Block-PVDF-Membran mit blockierenden Puffer (5 % fettfreie Milch in TBST Puffer (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1 % Waschmittel B (siehe Tabelle der Materialien), pH 7.6)) bei Raumtemperatur 1 Stunde mit 30 u/min schütteln durch Orbitalschüttler.</li>
		<li>Hybridisieren Sie die PVDF-Membran mit Anti-p53 Antikörper verdünnt (1:1 000) in blocking-Puffer für 12-16 h bei 4 ° C mit 30 u/min schütteln mit einer Federung Mixer.</li>
		<li>Nehmen Sie die PVDF-Membran in einen Behälter und legte in TBST. Spülen Sie PVDF-Membran mit TBST zweimal.</li>
		<li>Einweichen Sie die PVDF-Membran in TBST für 30 min mit 45 u/min schütteln durch Orbitalschüttler.</li>
		<li>Hybridisieren Sie die PVDF-Membran mit Anti-Kaninchen-Antikörper konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) verdünnt (1:4 000) in blocking-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur mit 30 u/min schütteln mit einer Aussetzung-Mixer.</li>
		<li>Waschen Sie die PVDF-Membran mit TBST 3 Mal wie in Schritt 3.4.10 beschrieben.</li>
		<li>Einweichen Sie die PVDF-Membran in TBST für 30 min mit 45 u/min schütteln mit einer Federung Mixer. Entfernen Sie TBST zu, und fügen Sie PBS Erhalt die PVDF-Membran bei 4 ° C für bis zu 12 h.</li>
		<li>Mischen Sie das verstärkte Chemilumineszenz Substrat (ECL Substrat) Reagenz 1 und 2 (1:1) (siehe Tabelle der Materialien). Entfernen Sie die PVDF-Membran aus der PBS, blot kurz mit einem Papiertuch oder leichte Wischer überschüssige Feuchtigkeit aufnehmen und sofort hinzufügen 400 µL der ECL-Reagenz an die Oberfläche jedes Membran für ca. 3-5 min. entfernen überschüssige ECL Reagenz durch kurz beflecken, aber erlauben nicht die m l, komplett trocken.</li>
		<li>Setzen Sie den Fleck mit einem Lumineszenz-imaging-System oder Autoradiographie Film27.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bies, J., Markus, J., Wolff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+attachment+of+the+SUMO-1+protein+to+the+negative+regulatory+domain+of+the+c-Myb+transcription+factor+modifies+its+stability+and+transactivation+capacity.">Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity.</a> J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).</li><li>Lin, D. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transformation.">Bacterial transformation.</a> Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).</li><li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone.">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+isolation+of+synaptic+vesicles+from+mammalian+brain.">Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain.</a> Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).</li></ol>

Die Autoren offenbaren keine Interessenkonflikte.

Die in-vitro- Sumoylierung Protokoll hier beschriebenen wird routinemäßig eingesetzt, die Sumoylierung Status der identifizierten Ubc9 Substrate zu etablieren. Die größte Beschränkung des Standardprotokolls Sumoylierung Funktion des SUMO E3 Ligase zu studieren ist die Fülle der Aktivierung von SUMO E1 und E2 Konjugation Enzyme Ubc9, die die SUMO-Konjugation in in-vitro- Systemen zu maximieren. Angesichts dieser Herausforderung glauben wir, dass Titration von der Menge der SUMO E1 und E2 Enzyme auf...

SUMO-Umbau wurde zunächst als reversible Post-translationale Modifikation (PTM) identifiziert, die Protein Stabilität1regelt. Neben direkten Konjugation kann SUMO auch an ein Protein durch nicht-kovalente Wechselwirkungen durch SUMO Interaktion Motive (SIMs)2befestigt werden. Ähnlich wie die Bindung der Tyrosyl-Phosphorylierung von Molekülen beherbergen Src Homologie 2 (SH2) oder Phosphotyrosine Bindung (PTB) Domänen3,4, SUMO Modifikation bietet eine zusätzliche Interaktion Plattform für selektive Rekrutierung von SIM-haltigen Effektor Proteine5,6. Neben der Regulierung der Signaltransduktion Sumoylierung transcriptional Faktoren und Chromatin umgestalten Moleküle dienen gen Ausdruck7,8zu modulieren. Studien der genomweiten Sumoylierung Muster haben gezeigt, dass SUMO Änderung entweder positive9,10 oder negative10,11,12 Transkription zugeordnet ist Verordnung, teilweise aufgrund der Paralogue Besonderheit der Sumoylierung.
Es gibt drei große SUMO-Isoformen für Protein Konjugation Gegenwart in Säugerzellen; Dazu gehören SUMO-1, und die hochgradig homologen SUMO-2 und SUMO-3 (bezeichnet als SUMO-2/3)13. SUMO ist in der Regel an Lysin (K) Rückstände innerhalb der ψKxD/E Konsens-Motivs in das Zielprotein konjugiert. Die SIM-Karte im SUMO E3 Ligases ist verantwortlich für die Paralogue Spezifität14. Im Gegensatz zu Ubiquitination Wege mit Hunderten von E3 Ligases wurden nur wenige SUMO E3 Ligases identifiziert15. SUMO E3 Ligases zeichnen sich durch Eigenschaften, einschließlich ihrer Fähigkeit zur (i) Ubc9 binden, (Ii) binden SUMO glyko-über eine SIM-Domäne und (Iii) Förderung der SUMO-Übertragung von Ubc9 auf Substrat. E3-Ligase ist nicht zwingend erforderlich für SUMO Konjugation16, bietet aber Substrat und SUMO-Paralogue Spezifität. Da in der Regel nur ein kleiner Bruchteil des gesamten Substrat Proteins SUMO geändert ist, ist Erkennung der sumoyliert Proteine in Vivo immer eine Herausforderung. Deshalb sind genaue und reproduzierbare Tests erforderlich, um die genaue Funktion der SUMO Veränderung aufzuklären.
Die in-vitro- Sumoylierung Assay, die die Fähigkeit des gereinigten Ubc9, Sumoylierung Substrat Proteine katalysieren auswertet, ist ein gut angenommen Assay für SUMO Änderung17zu studieren. Jedoch SUMO E3-Ligase-Aktivität in den meisten Fällen nicht erkannt werden oder kann nur erkannt werden mit mutierten SUMO-Ligase mit hoher Aktivität der SUMO-E3-Ligase und geringe Substratspezifität durch das standard-Protokoll wegen der Anwesenheit von eine reichliche Menge von Ubc918 . Der Gesamterfolg des Assays hängt weitgehend die sorgfältige Titration der gereinigten Ubc9. Der in-vitro- Sumoylierung Test hier beschriebenen wird von einem standard Sumoylierung geändert (siehe Tabelle der Materialien)-Protokoll. Die Beobachtung der erhöhten globalen SUMO Änderung während Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) Reaktivierung veranlasste uns, die virale SUMO E3-Ligase zu identifizieren, die für Up-Regulierung des Sumoylierung verantwortlich sein können. Nach einer kleinen Vorführung der interagierenden Proteine virale SUMO E3 Ligase K-bZIP wurde p53 als neuartiges Substrat identifiziert. In diesem Protokoll zeigen wir ausführlich in Insektenzellen, die Schritte in den Ausdruck und die Reinigung der Wildtyp K-bZIP, eine virale SUMO E3-Ligase mit SUMO-2/3 Spezifität beteiligt. Die Fähigkeit des gereinigten K-bZIP, Sumoylierung von p53, einem bekannten SUMO-Substrat zu verbessern wird in Anwesenheit von geringeren Mengen von E1 und E2 Enzyme ausgewertet. Mit dieser veränderten Sumoylierung Assay können Forscher zuverlässig definieren die Fähigkeiten der SUMO-E3-Ligase SUMOylate Roman oder bekannten Substrate, die primäre geht in die Untersuchung von Protein Sumoylierung. Darüber hinaus hilft diese Methode Roman SUMO E3 Ligases mit niedrigen Ligase Tätigkeit aber hohe Substratspezifität identifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:853px;" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">pFastBac</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td style="width:219px;">dual expression baculovirus vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCR2.1-TOPO vector</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR product vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">competent cell&#160; E. coli DH5&#945;</td>
			<td style="width:153px;">Yeastern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">FYE678-80VL</td>
			<td>competent E. coli cells A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">E. coli DH10Bac</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td>competent E. coli cells B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04709705001</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985062</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">T4 Ligase</td>
			<td style="width:153px;">NEW England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">CpoI (RsrII)</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Bluo-gal</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B1690</td>
			<td>galactosidase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">IPTG</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Grace&#8217;s Insect Medium</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11605094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9393-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">K0254-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">gentamicin</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">tetracyclin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">LB Broth</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">HEPES</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4034-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NaCl</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9888-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">KCl</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5136-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">3246-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.13760.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">TRIS (Base)</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Non-fat milk</td>
			<td style="width:153px;">Fonterra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">glycerol</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">2136-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:153px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0694-1L</td>
			<td>detergent A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Tween 20</td>
			<td style="width:153px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0777-500ML</td>
			<td>detergent B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Poloxamer 188 solution</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5556-100ML</td>
			<td>detergent C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04 693 132 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">3x Flag peptide</td>
			<td style="width:153px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-FLAG m2 Magnetic beads</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8823</td>
			<td>antibody-tagged magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SUMOlink SUMO-1 Kit</td>
			<td style="width:153px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">40120</td>
			<td>standard SUMOylation protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SUMOlink SUMO-2/3 Kit</td>
			<td style="width:153px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">40220</td>
			<td>standard SUMOylation protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:153px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">QIAGEN Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:153px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">12123</td>
			<td>plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Polypropylene tubes</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:153px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">CNG3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Loading tip</td>
			<td style="width:153px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:119px;">28480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">PVDF</td>
			<td style="width:153px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEF1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Blotting filter paper</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1703932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1658001 EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Pierce ECL Western Blotting</td>
			<td style="width:153px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>ECL reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">suspension mixer</td>
			<td style="width:153px;">Digisystem laboratory instruments&#160; Inc.</td>
			<td style="width:119px;">SM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaker</td>
			<td>Kansin instruments Co.</td>
			<td>OS701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">ImageQuant LAS 4000 
			biomolecular imager</td>
			<td style="width:153px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28955810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Sf9</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td>B82501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-p53 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-rabbit antibody</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro sumoylation assay to study sumo e3 ligase activity

Kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikator (SUMO) Modifikation ist eine wichtige Post-translationale Modifikation (PTM), die die Signaltransduktion in erster Linie durch Modulation der Protein-Protein-Wechselwirkungen vermittelt. Ähnlich wie Ubiquitin Modifikation Sumoylierung Regie eine sequenzielle Enzym Kaskade einschließlich E1-aktivierende Enzym (SAE1/SAE2), E2-Konjugation Enzym (Ubc9) und E3-Ligase (d.h., PIAS Familie, RanBP2 und Pc2). Jedoch anders als bei Ubiquitination, eine E3-Ligase ist unwesentlich für die Reaktion aber bieten Präzision und Wirksamkeit für SUMO Konjugation. Geändert von Sumoylierung Proteine können durch in-Vivo -Test über Immunopräzipitation mit Substrat-spezifische Antikörper und Immunoblotting mit SUMO-spezifische Antikörper identifiziert werden. Die Demonstration der Proteinaktivität SUMO E3 Ligase erfordert jedoch in Vitro Rekonstitution von Sumoylierung Assays mit gereinigtem Enzymen, Substrat und SUMO Proteine. Da in den in-vitro- Reaktionen in der Regel SAE1/SAE2 und Ubc9, allein für SUMO Konjugation ausreichen, ist Verbesserung der Sumoylierung durch eine vermeintliche E3-Ligase nicht immer leicht zu erkennen. Hier beschreiben wir eine modifizierte in Vitro Sumoylierung Protokoll, das konsequent SUMO-Modifikation mit einem in-vitro- rekonstituiert System identifiziert. Eine Schritt für Schritt Protokoll, katalytisch aktiven K-bZIP, eine virale SUMO-2/3-E3-Ligase zu reinigen wird ebenfalls dargestellt. Die Sumoylierung Aktivitäten der gereinigten K-bZIP werden p53, einem bekannten Ziel von SUMO angezeigt. Dieses Protokoll kann nicht nur für die neuartige SUMO E3 Ligases Aufklärung, sondern auch für die Preisgabe ihrer SUMO Paralog Spezifität eingesetzt werden.

Nach den Angaben des Herstellers ist die Freigepäckmenge von E1 und E2 Enzym in der Sumoylierung Assay 50 nM und 500 nM, beziehungsweise. Die minimale Menge an E2 Konjugation Enzym Ubc9, das SUMOylate p53 wurde zuerst durch eine in-vitro- Sumoylierung Assay bestimmt. So niedrig wie ein Fünftel der Höhe der Ubc9 in der standard in Vitro Sumoylierung Assay-Protokoll verwendet effizient SUMOylate p53 konnte (Abb. 1A). Daher ...

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In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Im Gegensatz zu Ubiquitin Ligases wurden einige E3 SUMO Ligases identifiziert. Dieses modifizierte in-vitro- Sumoylierung Protokoll ist in der Lage, neuartige SUMO E3 Ligases durch eine in-vitro- Rekonstitution Assay zu identifizieren.

In-vitro- Sumoylierung Assay SUMO E3 Ligase Tätigkeit zu studieren

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

9.3K Aufrufe.  National Yang-Ming University. Im Gegensatz zu Ubiquitin Ligases wurden einige E3 SUMO Ligases identifiziert. Dieses modifizierte in-vitro- Sumoylierung Protokoll ist in der Lage, neuartige SUMO E3 Ligases durch eine in-vitro- Rekonstitution Assay zu identifizieren.

Serie: In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

Ein In-vitro- FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Untersuchen der Kinase-Aktivität von LRRK2 In-vitro-</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endothelzellen Schlauchbildung Assay für die<em&gt; In-vitro-</em&gt; Studium der Angiogenese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In-vitro-Test zur Methylierung Protein-Arginin-Methylierung Studieren

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

In vitro-Test an Phosphatidylethanolamin Methyltransferase-Aktivität zu messen

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

Messung<em&gt; In Vitro</em&gt; ATPase Aktivität für die enzymatische Charakterisierung

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, small ubiquitin-related modifier (SUMO) is a ubiquitin-like protein that is covalently attached to the lysine residues of a variety of target proteins to regulate cellular processes, such as gene transcription, DNA repair, protein interaction and degradation, subcellular transport, and signal transduction. The most common approach to detecting protein SUMOylation is based on the expression and purification of recombinant tagged proteins in bacteria, allowing for an in vitro biochemical reaction which is simple and suitable for addressing mechanistic questions. However, due to the complexity of the process of SUMOylation in vivo, it is more challenging to detect and analyze protein SUMOylation in cells, especially when under endogenous conditions. A recent study by the authors of this paper revealed that endogenous retinoblastoma (Rb) protein, a tumor suppressor that is vital to the negative regulation of the cell cycle progression, is specifically SUMOylated at the early G1 phase. This paper describes a protocol for the detection and analysis of Rb SUMOylation under both endogenous and exogenous conditions in human cells. This protocol is appropriate for the phenotypical and functional investigation of the SUMO-modification of Rb, as well as many other SUMO-targeted proteins, in human cells.

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Small ubiquitin-related modifier (SUMO) family proteins are conjugated to the lysine residues of target proteins to regulate various cellular processes. This paper describes a protocol for the detection of retinoblastoma (Rb) protein SUMOylation under endogenous and exogenous conditions in human cells.

In Vivo Detektion und Analyse von Rb Protein Sumoylierung in menschlichen Zellen

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the prediction of family functions based on several features, such as the presence of sequence motifs or of particular sites for post-translational modification and the expression profile of family members in different conditions. This work describes a detailed protocol for gene family characterization. Here, the procedure is applied to the characterization of the Arabidopsis T&#243;xicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitin ligase family in grapevine. The methods include the genome-wide identification of family members, the characterization of gene localization, structure, and duplication, the analysis of conserved protein motifs, the prediction of protein localization and phosphorylation sites as well as gene expression profiling across the family in different datasets. Such procedure, which could be extended to further analyses depending on experimental purposes, could be applied to any gene family in any plant species for which genomic data are available, and it provides valuable information to identify interesting candidates for functional studies, giving insights into the molecular mechanisms of plant adaptation to their environment.

This article describes the procedure for the identification and characterization of a gene family in grapevine applied to the family of Arabidopsis T&#243;xicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitin ligases.

Umfassenden Workflow zur genomweiten Identifizierung und Ausdruck Meta-Analyse von der ATL E3 Ubiquitin Ligase Genfamilie in Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...