Name: in vitro sumoylation assay to study sumo e3 ligase activity
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
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이 작품에서 과학과 기술 (PCC에 대부분, 105-2320-B-010-007-MY3), 국립 보건 연구소 (NHRI-EX105-10215BC PCC에)에서 과학과 기술 (가장 105-2314-B-400-019에서 교부 금에 의해 지원 되었다 HJK)을 국립 보건 연구소 (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 HJK)에서. 이 작품 또한 PCC 원고 게시에 국립 양 밍 대학으로 부분적으로 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정, 게시 또는 원고의 배상에 아무 역할을 했다.

1입니다. 준비의 잠재 식 구문
<ol><li>
이중 식 잠재 벡터에 K bZIP19 의 cDNA 클로닝 하 여 스모 E3 리가 K bZIP을 정화 (재료의 표 참조)는 N 맨끝 피토 프 태그. 우리는 (벡터-태그-K-bZIP으로 프로토콜에 걸쳐 표시) octapeptide 태그를 사용 하 여 성공을 했다. 참고: K bZIP 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 복제에 대 한 DNA 템플렛은 cDNA 역방향 doxycycline 치료20다음 TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 셀에서 격리 하는 RNA에서 복사할.<ol>
<li>전송 길이 K bZIP cDNA19 Cpo와 듀얼 식 벡터에 사이트 복제 나. Cpo 내가 소화 PCR 제품 및 3 h2137 ° C에서 이중 식 벡터의 1 µ g.</li>
		<li>고220.8 %agarose 젤 전기 이동 법 다음 소화 DNA를 추출 합니다. 삽입 (K-bZIP) 선 및 T4 DNA 리가 제조업체의 지침에 따라 30 분 동안 16 ° C에 의해 벡터 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>5 µ L 추가 50 µ L DNA 결 찰의 유능한 대장균 세포 1.5 mL 튜브에 "A" ( 재료의 표참조). 30 분 동안 얼음에 넣어. 그런 다음, 45 42 ° C 물 욕조에 1.5 mL 튜브를 품 어 s 즉시 3 분 동안 얼음에 튜브를 넣어.</li>
		<li>튜브에 600 µ L S.O.C. 매체 (0.5% (w/v) 효 모 추출 물, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 20mm MgSO4, 4% (w/v) 포도 당)을 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 그런 다음, x 600g에 3 분 동안 실내 온도에 튜브 원심.</li>
		<li>상쾌한 제거, 60 µ L Luria Bertani 매체와 펠 릿 resuspend (파운드, 1% (w/v) tryptone, 0.5% (w/v) 효 모 추출 물, 및 85 mM NaCl) 및 파운드 한 천 배지 100 µ g/mL 암 피 실린 포함에 확산. 16 h23,2437 ° C에서 한 천 배지를 품 어.</li>
		<li>1 식민지 250rpm 떨고와 100 µ g/mL 암 피 실린 및 16 h 37 ° C에서 문화를 포함 하는 5 mL 파운드 매체에 접종을 선택 합니다. 다음, 플라스 미드, 벡터-태그-K-bZIP, 제조업체의 지침에 따라 플라스 미드 추출 키트에 의해 추출 ( 재료의 표참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
태그-K-bZIP 유능한 대장균 으로 벡터 태그 K bZIP의 변형에 의해 은닉 하는 재조합 bacmid 생성 세포 "B" (재료의 표 참조).
	<ol>
<li>0.2 µ g 벡터-태그-K-bZIP 플라스 미드와 100 µ L 유능한 중 1.5 mL 튜브와 30 분 대에 넣어 얼음에 대장균 세포 "B" 품 어 45 42 ° C 물 목욕에서 튜브 s 즉시 3 분 동안 얼음에 튜브를 넣어.</li>
		<li>튜브에 S.O.C. 매체의 900 µ L을 추가 하 고 회전 50 rpm에서 37 ° C 4 h에서 품 어. 다음, 매체의 10 µ L, 추가 파운드 한 천 배지 50 µ g/mL 대, 7 µ g/mL gentamicin, 10 µ g/mL 항생물질, 100 µ g/mL galactosidase 기판, 및 40 µ g/mL 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG에 확산 S.O.C 매체의 추가 50 µ L ), 및 48 h 37 ° c.에 대 한 번호판을 품 어</li>
		<li>5 mL 파운드 매체 50 µ g/mL 대, 7 µ g/mL gentamicin 및 10 µ g/mL 항생물질을 포함 한 백색 식민지 접종 16 h 떨고 250 rpm 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>재조합 bacmid 태그 K bZIP을 은닉 하는 DNA를 분리 하 고 계량, 1 µ g / µ L25의 농도에 다시 일시 중단.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
태그-K-bZIP 재조합 bacmid 태그-K-bZIP 6 잘 플레이트 한 우물에서 Sf9 셀에 포함 된 DNA의 transfecting 1 µ g에 의해 표현 하는 재조합 baculoviruses을 생성 합니다.
	<ol>
<li>시드 2 x 106 Sf9 셀 ( 재료의 표참조) 2 mL 그레이스의 곤충 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 각각 1 %gentamicin 제공 6 잘 플레이트의 잘 다음 1 h 27 ° C에서 품 어.</li>
		<li>10 %FBS, 1 %gentamicin, 및 1% 세제 C와 함께 제공 된 그레이스의 곤충 매체에서 Sf9 셀의 로그 단계 문화를 유지 ( 재료의 표참조) 140 rpm에서 궤도에 27 ° C에서. Hemocytometer 고 trypan 푸른 얼룩;를 사용 하 여 셀의 개수 세포 생존 능력 95%를 초과 한다. 매 2-3 일 (최소 밀도 ~0.5 x 106 셀/mL) 1: 3의 subcultivation 비율을 사용 하 여 셀을 유지 합니다.</li>
		<li>2 µ L bacmid DNA를 추가 (1 µ g / µ L) 98 µ L 2 mL 튜브에 혈 청 미디어 ( 재료의 표참조)을 감소. 그런 다음 추가 4 µ L transfection 시 약 ( 재료의 표참조) 튜브를 잘 믹스. 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>각 음에이 transfection 혼합물 (104 µ L)를 추가 하 고 12-16 h 27 ° C에서 품 어.</li>
		<li>부드러운 포부와 함께 지쳐 미디어를 제거 하 고 신선한 그레이스의 곤충 매체 10 %FBS 1 %gentamicin와 함께 제공 된의 2 개 mL를 바꿉니다. Sf9 세포는 플레이트 표면에 느슨하게 고착 하 고 부드러운 포부와 방해 하지 않을 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection 후 재조합 잠재를 수집 하 고 증폭 하는 추가 실험을 위해 높은 titer 주식 (P1)를 얻을 잠재.
	<ol>
<li>매체, 멸 균 셀 기중 기를 사용 하 여 긁어는 Sf9 셀을 변경한 후 72 h 1.5 mL 튜브 및 10에 대 한 소용돌이에서 각 개별 우물에서는 상쾌한 수집 s.</li>
		<li>150 x g. 3 분 4 ° C에서 원심 P0 잠재 및 1.5 mL 튜브 (각 관에 1 mL 잠재) 약 수 수집 상쾌한. -80 ° c.에 게</li>
		<li>10 mL 그레이스의 곤충 매체에 씨앗 1 x 107 Sf9 세포 10 %FBS 1% gentamicin 10 cm 배양 접시에에서 함께 제공 하 고 1 h 27 ° C에서 품 어.</li>
		<li>재조합 baculoviruses 표현 태그-K-bZIP의 증폭에 대 한 시드 Sf9 셀을 0.5 mL P0 잠재를 추가 하 고 48 h 27 ° C에서 품 어.</li>
		<li>최대 1 개월에 대 한 15 mL 튜브에 4 ° C에서 저장소 P1 잠재로 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. K-bZIP의 정화
<ol><li>1.3.2 단계에서 설명한 대로 10 %FBS, 1 %gentamicin, 및 1% 세제 C 140 rpm에서 궤도에 27 ° C에서 제공 하는 그레이스의 곤충 매체에 Sf9 셀의 로그 단계 문화를 유지 합니다.</li>
	<li>변환의 날, 2 x 106 셀/mL의 조밀도 가진 Sf9 셀의 250 mL에 잠재 된 상쾌한 (P1)의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>떨고, 140 rpm 궤도 셰이 커에 27 ° C에서 72 h에 대 한 Sf9 셀을 품 어 다음 4 ° c.에 15 분 동안 2,740 x g에서 원심 분리 하 여 수집</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 10 mL 세포의 용 해 버퍼 (20 mM HEPES pH 7.9, 0.5 M NaCl, 1% 세제 ( 재료의 표참조), 2% 글리세롤, 프로 테아 제 억제 물 칵테일) 펠 릿 세포를 lyse 및 4 ° C에서 30 분 동안 정지 믹서를 사용 하 여 50 rpm에 회전.</li>
	<li>원심 분리기 세포 lysate 15000 x g 15 분은 상쾌한 수집에서.</li>
	<li>태그-K-bZIP 정화, 항 체 태그 14 mL 폴 리 프로필 렌 튜브, 자석 구슬의 50 µ L로 세포 lysates (10 mL)를 품 어 하 고 정지 믹서를 사용 하 여 4 ℃에서 3 h 50 rpm에 회전 합니다. 30 g 원심 x 800에 구슬 작은 단백질 캡처, 다음 4 ° c.에 s 상쾌한의 대부분을 제거 하 고 다시 약 1 mL의 잔여 볼륨에 비즈를 일시에 1.5 mL 튜브에 전송.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 구슬 들어 있는 튜브를 배치 하 여 캡처된 단백질을 세척 하 고 일단 자석 구슬은 튜브의 측면을 완벽 하 게 준수는 상쾌한을 제거.</li>
	<li>
세포의 용 해 버퍼와 구슬 4 번 씻어.
	<ol>
<li>1.5 mL 튜브에 1 mL 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 반전 튜브 10 번. 1.5 mL 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 2.7에서 설명 된 대로 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>또 다른 3 시간 이전 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 구슬 한 번 씻는 다.
	<ol>
<li>1.5 mL 튜브에 1 mL PBS (137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 8 m m Na2HPO4, 1.5 m m KH2PO4)를 추가 하 고 반전 튜브 10 번.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에 1.5 mL 튜브를 넣어 하 고는 상쾌한 제거.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 PBS에 희석 150 µ g/mL octapeptide의 100 µ L을 추가 하 여 항 체 태그 자석 구슬에서 태그-K-bZIP 단백질을 elute. 실 온에서 정지 믹서에 의해 50 rpm에서 10 분 동안 튜브를 회전 합니다. 다음, 튜브 자석 스탠드에 다시 놓고 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 K bZIP 포함 된 상쾌한 수집 합니다.</li>
	<li>SDS 페이지 Coomassie 파란 얼룩이26뒤 1-5 µ L 정화 태그-K-bZIP 단백질 분석. 2 µ g, 1 µ g, 로드 및 소 혈 청 알 부 민 (BSA)는 동일에 0.5 µ g 샘플 젤 ImageJ 같은 이미지 처리 프로그램, 정량화에 대 한 그것을 사용 하 여. BSA 기준에 비교 하 여 K-bZIP 농도 견적 한다.</li>
	<li>순화 K bZIP 이제 각 SUMOylation 분석 결과에서 사용 될 준비가 되어 있습니다. PBS에서 K bZIP 100 ng / µ L-80 ° c.에 작은 aliquots가 게의 최종 농도에 희석</li>
</ol>3. SUMOylation 분석 결과
<ol><li>각 시험관에서 SUMOylation 반응에서의 마스터 믹스에 정화 태그-K-bZIP의 100 ng / µ L의 3 µ L를 추가 합니다. 마스터 믹스 구성 요소 포함 1 µ L 단백질 버퍼, SUMOylation 버퍼, 0.5 µ L p53 단백질 (0.5 mg/mL), 25 x 1 nM E1 효소를 활성화 (재고 하자마자: 1 µ M), 50 nM e 2의 효소 변화 (재고 하자마자: 10 µ M), 및 250 nM 각 스모 펩 티 드 (스모-1의 스모-2, 또는 스모-3; 재고 하자마자: 5 µ M) 17 µ L의 최종 볼륨을.</li>
	<li>내용을 부드럽게 혼합 하 고 3 h. SDS 페이지 로딩 버퍼 x 2의 20 µ L을 추가 하 여 반응을 중지에 30 ° C에서 반응을 품 어 (100 mM Tris HCL pH 6.8, 4% 나트륨 라우릴 황산 염, 0.2% (w/v) bromophenol 블루, 20% (v/v) 글리세롤, 및 200 m m β-mercaptoethanol) 및 5 분 동안 95 ° C에서 샘플 변성</li>
	<li>
SDS 페이지에 샘플, PVDF 막에 분리 된 단백질 전기 이동 전송 반 건조 장치를 사용 하 여 전송 하 고 안티-p53 항 체를 사용 하 여 서쪽 오 점 분석 합니다.
	<ol>
<li>2.11, 단계에서 젤 장치를 설정 하 고 젤 우물에 20 µ L의 샘플을 로드.</li>
		<li>(때까지 염료 밴드 젤의 하단에 도달) 정 전류 80 V에서 약 120 분 동안에 10% 젤을 실행 합니다. 전기 이동 법의 완성 후 전원 공급 장치를 해제 합니다.</li>
		<li>젤 기구와 젤, 밖으로 데리고 젤 카세트를 분리 하 고 5 분 동안 세미 드라이 전송 버퍼 (48 mM Tris HCl, 39mm 글리신, 20% 메탄올)에 젤을 떠.</li>
		<li>다른 컨테이너를가지고 고 1 분 동안 메탄올에 PVDF 막 담가. 그런 다음, 메탄올에 PVDF를 데리고 고 세미 드라이 전송 버퍼에 넣어. 부드럽게 막 5 분 교 반 하십시오.</li>
		<li>세미 드라이 전기 이동 기구의 안전 덮개를 제거 합니다.</li>
		<li>사전 필터 종이, 젖은 하단 플래티넘 양극에 젤 샌드위치를 같이 준비: 필터 종이, PVDF 막, 젤, 및 필터.</li>
		<li>다음 실행 오 점 15 V 정 전류 90 분 설정에 대 한 전원 공급 장치에서 안전한 음극 판과 안전 커버, 세미 건조 장치, 고 PVDF 막 밖으로.</li>
		<li>블로킹 버퍼 블록 PVDF 막 (TBST 버퍼에 5% 비-지방 우유 (137 m m NaCl2, 20 mM Tris HCl, 0.1% 세제 B ( 재료의 표참조), pH 7.6)) 궤도 셰이 커로 흔들어 30 rpm으로 1 시간에 대 한 실내 온도에.</li>
		<li>30 rpm 떨고 정지 믹서를 사용 하 여 함께 안티 p53 항 체 희석 (1:1, 000) 4 ° C에서 12-16 h에 대 한 블로킹 버퍼와 PVDF 막 교배.</li>
		<li>컨테이너에 PVDF 막 꺼내와 TBST에 넣어. 두 번 더 TBST 가진 PVDF 막을 헹 구 십시오.</li>
		<li>45 rpm 궤도 셰이 커로 흔들어 30 분 동안 TBST에 PVDF 막을 담근 다.</li>
		<li>30 rpm 떨고 정지 믹서를 사용 하 여 실 온에서 1 h에 대 한 블로킹 버퍼에 반대로 토끼 항 체 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 희석과 활용 (1:4, 000)와 PVDF 막 교배.</li>
		<li>3.4.10 단계에서 설명한 대로 TBST 3 시간 PVDF 막을 씻으십시오.</li>
		<li>45 rpm 떨고 정지 믹서를 사용 하 여 함께 30 분 동안 TBST에 PVDF 막을 담근 다. TBST를 제거 하 고 PBS PVDF 막 12 h까지 4 ° C에서 유지 하기 위해 추가.</li>
		<li>믹스 향상 된 chemiluminescent 기판 (ECL 기판) 시 약 1, 2 (1:1) ( 재료의 표참조). PBS에서 PVDF 막 제거, 간단히 종이 타월 또는 과도 일 분을 흡수 즉시 짧게 blotting에 의해 3-5 분 제거 초과 ECL 시 약에 대 한 각 막의 표면에 ECL 시 약의 400 µ L을 추가 하는 빛-의무 퍼 오 점 하지만 m을 허용 하지 마십시오 embrane을 완전히 건조.</li>
		<li>오 점 발광 이미징 시스템 또는 autoradiography 영화27을 사용 하 여 노출 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bies, J., Markus, J., Wolff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+attachment+of+the+SUMO-1+protein+to+the+negative+regulatory+domain+of+the+c-Myb+transcription+factor+modifies+its+stability+and+transactivation+capacity.">Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity.</a> J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).</li><li>Lin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SUMO-interacting+motif+in+Daxx+SUMO+modification,+subnuclear+localization,+and+repression+of+sumoylated+transcription+factors.">Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors.</a> Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).</li><li>Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+Src+Homology-2+domain+containing+protein+B+(SHB)+in+beta+cells.">The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).</li><li>Huang, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+pathogenesis+of+SHP2+in+developmental+disorders+and+tumorigenesis.">Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis.</a> Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).</li><li>Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIM-ultaneous+role+for+SUMO+and+ubiquitin.">A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin.</a> Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).</li><li>Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+function+of+RNF4+family+proteins+in+eukaryotes:+targeting+a+ubiquitin+ligase+to+SUMOylated+proteins.">Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins.</a> EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).</li><li>Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+of+CoREST1+to+SUMO-2/3+contributes+to+gene-specific+repression+by+the+LSD1/CoREST1/HDAC+complex.">Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex.</a> Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).</li><li>Lyst, M. J., Stancheva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+SUMO+modification+in+transcriptional+repression+and+activation.">A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation.</a> Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).</li><li>Liu, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modification+by+SUMO-1+stimulates+the+promoters+of+translation+machinery+genes.">Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes.</a> Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).</li><li>Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+functions+in+constitutive+transcription+and+during+activation+of+inducible+genes+in+yeast.">SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast.</a> Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).</li><li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+modification+by+SUMO-2/3+but+not+SUMO-1+prevents+the+epigenetic+activation+of+key+immune-related+genes+during+Kaposi's+sarcoma+associated+herpesvirus+reactivation.">The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation.</a> BMC Genomics. 14, 824 (2013).</li><li>Neyret-Kahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+at+chromatin+governs+coordinated+repression+of+a+transcriptional+program+essential+for+cell+growth+and+proliferation.">Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation.</a> Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).</li><li>Tatham, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+chains+of+SUMO-2+and+SUMO-3+are+conjugated+to+protein+substrates+by+SAE1/SAE2+and+Ubc9.">Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).</li><li>Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+cellular+protein+conjugation+pathways:+The+SUMO+lesson.">Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson.</a> World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).</li><li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMO+pathway:+emerging+mechanisms+that+shape+specificity,+conjugation+and+recognition.">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li><li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1.">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li><li>Knipscheer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubc9+sumoylation+regulates+SUMO+target+discrimination.">Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination.</a> Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).</li><li>Vethantham, V., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+sumoylation+of+recombinant+proteins+and+subsequent+purification+for+use+in+enzymatic+assays.">In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).</li><li>Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+encodes+a+bZIP+protein+with+homology+to+BZLF1+of+Epstein-Barr+virus.">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus.</a> J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).</li><li>Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-bZIP+Mediated+SUMO-2/3+Specific+Modification+on+the+KSHV+Genome+Negatively+Regulates+Lytic+Gene+Expression+and+Viral+Reactivation.">K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation.</a> PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).</li><li>Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RsrII--a+novel+restriction+endonuclease+with+a+heptanucleotide+recognition+site.">RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site.</a> Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R-EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Gingold, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transformation.">Bacterial transformation.</a> Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).</li><li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone.">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+isolation+of+synaptic+vesicles+from+mammalian+brain.">Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain.</a> Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).</li></ol>

저자는 잠재적인 충돌의 관심을 공개.

생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 여기에 설명 된 확인 된 Ubc9 기판의 SUMOylation 상태 설정 정기적으로 사용 됩니다. 스모 E3 리가의 SUMOylation 함수를 공부 하는 표준 프로토콜을 사용 하 여 주요 한계는 스모 E1 활성화 및 E2 변화 효소 Ubc9 체 외에 시스템에서 스모 활용을 극대화 하는 풍부한. 이 문제를 고려 하면 우리가 믿는 그 적정 수준에 스모 E1 및 E2 효소의 양을 하나 겨우 SUMOylation에 ?...

스모 수정 처음 단백질 안정성1을 조절 하는 가역 포스트 번역 상 수정 (PTM)으로 확인 되었습니다. 뿐만 아니라 직접 활용, 스모도 장착할 수 비 공유 상호 작용을 통해 단백질에 스모 상호 작용 주제 (심즈)2. Tyrosyl-Src 상 동 2 (SH2)를 은닉 하는 분자에 의해 인 산화의 바인딩 또는 phosphotyrosine 바인딩 (PTB) 도메인3,4, 스모 수정 제공 위한 추가 상호 플랫폼 선택 포함 하는 SIM effector 단백질5,6모집 신호 변환의 규칙, 이외에 transcriptional 요인과 분자를 개장 하는 chromatin의 SUMOylation 조절 유전자 식7,8을 제공 합니다. 게놈 넓은 SUMOylation 패턴의 연구는 스모 수정은 긍정적인9,10 또는 음수10,11,12 전사와 관련 된 공개 규칙, SUMOylation의 paralogue 특이성 때문에 부분에서.
포유류 세포; 현재 변화 하는 단백질에 대 한 세 가지 주요 스모 isoforms는 스모-1, 그리고 높은 동종 스모 2와 스모-3 (스모-2/3 라고 함)13포함 됩니다. 스모는 대상 단백질에 ψKxD/E 합의 모티브 내 lysine (K) 잔류물에 일반적으로 활용 된다. 스모 E3 ligases에서 시뮬레이션 paralogue 특이성14에 대 한 책임은. E3 ligases의 수백을 포함 하는 ubiquitination 경로, 달리만 있었다 몇 스모 E3 ligases 식별15. 스모 E3 ligases (i) 바인딩 Ubc9, (ii) SIM 도메인 통해 스모 moiety 바인딩 (iii) 기판에 Ubc9에서 스모 전송 향상을 자신의 능력을 포함 하는 속성에 의해 정의 됩니다. E3 리가 스모 활용16, 절대적으로 필요 하지 않습니다 하지만 기판 및 스모 paralogue 특이성을 제공 합니다. 일반적으로 이후 총 기질 단백질의 작은 분수는 스모 수정 SUMOylated 단백질에서 vivo에서 의 탐지 항상 도전 이다. 따라서, 정확 하 고 재현성 분석 스모 수정의 정확한 기능을 명료 하 게 하기 위해 필요 합니다.
생체 외에서 SUMOylation 분석 결과, 기질 단백질의 SUMOylation 촉매 정화 Ubc9의 능력을 평가 하는 스모 수정17공부에 대 한 분석 결과 잘 허용된. 그러나, 대부분의 경우에서 스모 E3 리가 활동 감지 되지 않을 수 또는 검출 될 수 있다 돌연변이 스모 리가와 높은 스모 E3 리가 활동 및 낮은 기질 특이성 표준 프로토콜에 의해 Ubc918 의 풍부한 금액의 존재 때문에 . 순화 Ubc9의 주의 적정이이 분석 결과의 전반적인 성공에 의하여 크게 달려 있다. 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 여기에 설명 된 표준 SUMOylation에서 수정할 프로토콜 ( 재료의 표참조). Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) 다시 활성화 하는 동안 증가 글로벌 스모 수정 관찰 SUMOylation의 업 레 귤 레이 션에 대 한 책임이 있을 수 있습니다 바이러스 성 스모 E3 리가 식별 하 라는 메시지가. 다음 바이러스 스모 E3 리가 K bZIP의 상호 작용 단백질의 소규모 상영, p53 소설 기판으로 확인 되었습니다. 이 프로토콜에서 우리 곤충 세포는 표현과 스모-2/3으로 바이러스 스모 E3 리가 K bZIP 야생-타입의 정화에 단계가 자세히 보여줍니다. E1 및 E2 효소의 감소 금액의 p53, 유명한 스모 기판의 SUMOylation를 향상 시키기 위해 정화 K bZIP의 능력 평가 됩니다. 이 수정된 SUMOylation 분석 결과 사용 하 여, 연구원은 안정적으로 정의할 수 스모 E3 리가의 능력 SUMOylate 소설 또는 알려진된 기판 단백질 SUMOylation의 연구에 기본 단계입니다. 또한,이 방법은 낮은 리가 활동 하지만 높은 기질 특이성 소설 스모 E3 ligases를 확인할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>pFastBac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>dual expression baculovirus vector</td></tr><tr><td>pCR2.1-TOPO vector</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>PCR product vector</td></tr><tr><td>competent cell&amp;nbsp; E. coli DH5&amp;alpha;</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYE678-80VL</td><td>competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; cells A</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; cells B</td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Roche</td><td>04709705001</td><td>transfection reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>reduced serum media</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NEW England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>CpoI (RsrII)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0741</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1690</td><td>galactosidase substrate</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s Insect Medium</td><td>Gibco</td><td>11605094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0254-20ML</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>tetracyclin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Merk</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>sodium dodecyl sulfate</td><td>Merk</td><td>1.13760.1000</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (Base)</td><td>J.T.Baker</td><td>4109-06</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat milk</td><td>Fonterra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>J.T.Baker</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td>detergent A</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-500ML</td><td>detergent B</td></tr><tr><td>Poloxamer 188 solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556-100ML</td><td>detergent C</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>3x Flag peptide</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG m2 Magnetic beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8823</td><td>antibody-tagged magnetic beads</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-1 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40120</td><td>standard SUMOylation protocol&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-2/3 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40220</td><td>standard SUMOylation protocol&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12123</td><td>plasmid extraction kit</td></tr><tr><td>Polypropylene tubes</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Corning</td><td>CNG3008</td><td></td></tr><tr><td>Loading tip</td><td>Sorenson BioScience</td><td>28480</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF1002</td><td></td></tr><tr><td>Blotting filter paper</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001 EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting</td><td>Thermo</td><td>32106</td><td>ECL reagent</td></tr><tr><td>suspension mixer</td><td>Digisystem laboratory instruments&amp;nbsp; Inc.</td><td>SM-3000</td><td></td></tr><tr><td>orbital shaker</td><td>Kansin instruments Co.</td><td>OS701</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&lt;br/&gt; biomolecular imager</td><td>GE Healthcare</td><td>28955810</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Thermo Scientific</td><td>B82501</td><td></td></tr><tr><td>anti-p53 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>#9282</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit antibody</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro sumoylation assay to study sumo e3 ligase activity

작은 유비퀴틴-같은 한정자 (스모) 수정 신호 변환 단백질 단백질 상호 작용에 변조를 통해 주로 중재 하는 중요 한 포스트 번역 상 수정 (PTM) 이다. 유비퀴틴 수정 마찬가지로 SUMOylation E1 활성화 효소 (SAE1/SAE2), e 2-활용 효소 (Ubc9), 및 E3-리가 (즉, PIA 가족, RanBP2, 및 Pc2)을 포함 하 여 순차적 효소 캐스케이드 감독 이다. 그러나, 다른 ubiquitination, E3 리가 비 본질적인 반응 하지만 않습니다 스모 활용에 대 한 정밀도 효능을 제공. 단백질 SUMOylation 수정 기판 특정 항 체와 스모 특정 항 체와 immunoblotting vivo에서 immunoprecipitation 통해 분석 하 여 확인할 수 있습니다. 그러나, 단백질 스모 E3 리가 활동의 데모 SUMOylation 분석 실험을 사용 하 여 정제 효소, 기질, 그리고 스모 단백질의 생체 외에서 재구성을 해야 합니다. 때문에 체 외에 반응에서 일반적으로 SAE1/SAE2 및 Ubc9, 혼자 스모 활용에 대 한 충분 한, putative E3 리가 여 SUMOylation의 향상은 항상 검출 하기 쉽지. 여기, 우리는 수정 된 생체 외에서 스모 수정에서 시험관에 재구성 시스템을 사용 하 여 일관 되 게 식별 SUMOylation 프로토콜 설명 합니다. 바이러스 성 스모-2/3 E3 리가 K bZIP 촉매로 활성 정화 단계 프로토콜도 제공 됩니다. 순화 K bZIP의 SUMOylation 활동 p53, 스모의 잘 알려진 대상에 표시 됩니다. 이 프로토콜 없습니다만 사용할 수 있습니다 elucidating 소설 스모 E3 ligases, 뿐만 아니라 그들의 스모 paralog 특이성을 공개.

제조업체에서 제공 하는 정보에 따라 E1 및 E2 효소 SUMOylation 분석 결과에서 표준 금액은 50 nM 및 500 nM, 각각. 최소한의 E2 효소 Ubc9 SUMOylate p53 수 있는 어근 먼저 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 의해 결정 되었다. 낮은 Ubc9는 표준 체 외에서 SUMOylation 분석 결과 프로토콜에 사용 금액의 1 / 5 SUMOylate p53 효율적으로 수 있었다 (그림 1A</str...

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In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

9.3K 조회수.  National Yang-Ming University. 유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

생화학

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

간암에서 스모 프로테오메의 농축, 격리, 식별 및 특성화를 위한 도구로 스모 결합 엔티티(SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Ubiquitylated, SUMOylated 및 ADP-Ribosylated DNA-Protein Crosslinks 측정

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

저자 스포트라이트: DNA 단백질 교차결합의 정량적 검출 및 번역 후 변형(Post-Translational Modifications)  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, small ubiquitin-related modifier (SUMO) is a ubiquitin-like protein that is covalently attached to the lysine residues of a variety of target proteins to regulate cellular processes, such as gene transcription, DNA repair, protein interaction and degradation, subcellular transport, and signal transduction. The most common approach to detecting protein SUMOylation is based on the expression and purification of recombinant tagged proteins in bacteria, allowing for an in vitro biochemical reaction which is simple and suitable for addressing mechanistic questions. However, due to the complexity of the process of SUMOylation in vivo, it is more challenging to detect and analyze protein SUMOylation in cells, especially when under endogenous conditions. A recent study by the authors of this paper revealed that endogenous retinoblastoma (Rb) protein, a tumor suppressor that is vital to the negative regulation of the cell cycle progression, is specifically SUMOylated at the early G1 phase. This paper describes a protocol for the detection and analysis of Rb SUMOylation under both endogenous and exogenous conditions in human cells. This protocol is appropriate for the phenotypical and functional investigation of the SUMO-modification of Rb, as well as many other SUMO-targeted proteins, in human cells.

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Small ubiquitin-related modifier (SUMO) family proteins are conjugated to the lysine residues of target proteins to regulate various cellular processes. This paper describes a protocol for the detection of retinoblastoma (Rb) protein SUMOylation under endogenous and exogenous conditions in human cells.

Vivo에서 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

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