Die Autoren danken Yeon-Joo Jung für ihre experimentelle Unterstützung während Synaptosome Reinigung und Jungjoo Park für Bilder von Synaptosomes mit PS-Exposition. Darüber hinaus danken wir allen Mitgliedern in chungs Labor für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschuss finanziert von der koreanischen Regierung (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 und NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. (C).

<ol>
	<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Assemble+Thalamocortical+Synapses+by+Bridging+NRX1alpha+and+NL1+via+Hevin.">Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin.</a> Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).</li><li>Allen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+glypicans+4+and+6+promote+formation+of+excitatory+synapses+via+GluA1+AMPA+receptors.">Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors.</a> Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).</li><li>Xu, J., Xiao, N., Xia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+1+accelerates+synaptogenesis+in+hippocampal+neurons+through+neuroligin+1.">Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).</li><li>Chung, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+mediate+synapse+elimination+through+MEGF10+and+MERTK+pathways.">Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways.</a> Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner.">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li><li>Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulators+signal+through+astrocytes+to+alter+neural+circuit+activity+and+behaviour.">Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour.</a> Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).</li><li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor.">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li><li>Iram, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megf10+Is+a+Receptor+for+C1Q+That+Mediates+Clearance+of+Apoptotic+Cells+by+Astrocytes.">Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes.</a> J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).</li><li>Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+engage+unique+molecular+programs+to+engulf+pruned+neuronal+debris+from+distinct+subsets+of+neurons.">Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons.</a> Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).</li><li>Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta-induced+astrocytic+phagocytosis+is+mediated+by+CD36,+CD47+and+RAGE.">Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+lipid+sensing+sustains+the+microglial+response+in+an+Alzheimer's+disease+model.">TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model.</a> Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).</li><li>Sekar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+risk+from+complex+variation+of+complement+component+4.">Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4.</a> Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Chung, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+allele-dependent+role+for+APOE+in+controlling+the+rate+of+synapse+pruning+by+astrocytes.">Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).</li><li>Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+glial+clearance+of+degenerating+axons+in+aged+Drosophila+is+due+to+reduced+PI3K/Draper+activity.">Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity.</a> Nat Commun. 7, 12871 (2016).</li><li>Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+degradation+in+phagocytic+astrocytes+can+be+enhanced+by+lysosomal+acidification.">Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification.</a> Glia. , (2015).</li><li>Xiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+astrocytic+lysosome+biogenesis+facilitates+Abeta+clearance+and+attenuates+amyloid+plaque+pathogenesis.">Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis.</a> J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).</li><li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+degeneration+induces+glial+responses+through+Draper-TRAF4-JNK+signalling.">Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling.</a> Nat Commun. 8, 14355 (2017).</li><li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes.">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).</li><li>Stigliani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+re-sealed+particles+freshly+prepared+from+adult+rat+brain+are+competent+for+exocytotic+release+of+glutamate.">Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate.</a> J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+database+for+astrocytes,+neurons,+and+oligodendrocytes:+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function.">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Artikel präsentieren wir Methoden für einen langfristigen live-Imaging in Vitro Phagozytose-Assay mit gereinigtem Gliazellen und pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes. Wir zeigen, dass im Vergleich zu Mikroglia, Astrozyten besitzen unterschiedlichen Engulfment und Abbau Kapazität während der Phagozytose von Synaptosomes. Darüber hinaus unsere Daten deuten darauf hin, dass Astrozyten abgesondert Faktoren, die Überbrückung Moleküle wie GAS6, Proteine und MEGE8 enthalten, entscheidend für effiziente PS-abhängige Phagozytose von Gliazellen im Gehirn sind. Darüber hinaus zeigen Megf10 KO Astrozyten defekt Phagozytose von Synaptosomes.
Um dieses Experiment erfolgreich durchführen zu können, müssen die Medien und DPBS sorgfältig während der Waschschritte (Abschnitt 5) ausgetauscht werden. Primäre kultivierte Astrozyten und Mikroglia, vor allem Mikroglia, sind anfällig für Luft ausgesetzt. Daher ist die Verringerung der Zeitintervalle zwischen den Waschschritten entscheidend für die Aufrechterhaltung der lebenden Zellen. Für den Aufbau langfristiger live-Imaging mit live-Imaging Instrumenten, manueller Fokus empfehlen, da Autofokus Laser/LED-Belichtungszeit erhöhen kann, die die Zellen schädigen können.
Bei dieser Methode ist die Synaptosome Reinigung Protokoll19 leicht modifiziert. Das ursprüngliche Papier trennt gradient Lösungen in 3 %, 10 %, 15 % und 23 %. Allerdings richten wir 3 %, 10 % und 23 % Steigung Lösungen, den Ertrag der gereinigten Synaptosomes steigern. Die Anweisungen für Immunopanning Astrozyten und Mikroglia-Zellen sind auch bei dieser Methode geändert. Das Ziel des Originals schwenken Protokoll21 ist zu reinigen nur Astrozyten und verwenden BSL-1, nur sekundär, CD45 O4 und Itgb5 (HepaCAM für Maus) als Immunopanning bestellen. Da BSL-1 und nur sekundär Platten Endothelzellen sowie Mikroglia entfernen, wir die Reihenfolge geändert, CD45, nur sekundär, BSL-1 O4 und Itgb5 (HepaCAM für Maus), den Ertrag der Mikroglia aus der CD45 schwenken Gericht steigern. In diesem Protokoll durchblutet wir auch SD Ratte Welpen (~ P7-P10) mit DPBS über das Herz-Kreislauf-System, verschiedenen Blutzellen zur Minimierung von Kontamination von CD45-positiven nicht Mikroglia Populationen zu entfernen.
Es gibt mehrere Vorteile von in-vitro- Phagozytose-Assay. Der pH-Indikator verwendet in Synaptosome-Konjugation emittiert nur rote Fluoreszenz in niedrigen pH-Bedingungen. Daher kann bei der Verarbeitung von Daten wir direkt rote Fluoreszenz als Signal phagocytic Veranstaltungen ohne abschrecken Verfahren entfernen Hintergrund Signale oder komplizierte bildgebende Analyse zu Co lokalisierte Signale verschlungen Material innerhalb des quantifizieren Phagozyten. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode Echtzeitverfolgung von Gliazellen Phagozytose durch Aufnahme von Bildern der pH-Indikator-Intensität innerhalb einer bestimmten ROI zu mehreren Zeitpunkten. Durch die Erzeugung eines Graphs mit pH-Indikator-Intensität bis zu 100 h, Engulfment sowie Abbau können Kapazitäten leicht zwischen verschiedenen Zellen und Bedingungen überwacht werden. Ein weiterer Vorteil ist die Verwendung von Synaptosomes. Da Astrozyten Ensheathe Synapsen aller Zeiten mit ihren feinen verarbeitet und haben gezeigt, dass Synapsen in Vivo4verschlingen, mit Synaptosomes eignet sich sehr für die Messung der in-vitro- phagocytic Kapazität der Astrozyten. Schließlich hat dieser in-vitro- Phagozytose Assay das Potenzial entwickelt werden, um glial Phagozytose von Myelin Schutt oder Amyloid Beta, zu untersuchen, die mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen zusammenhängt.
Mit steigender Lebenserwartung ist eine dramatische Zunahme der Zahl von Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen unvermeidlich. Synapse-Verlust durch Gliazellen ist einer der führenden Faktoren in verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten13,14. Darüber hinaus können abnorme Synapse beschneiden und ein Ungleichgewicht im Gehirn Homöostase Glia Phagozytose Mängel zugeordnet werden. Daher könnte die Identifizierung von Faktoren und Substanzen, die die Engulfment und Abbau Kapazitäten der Astrozyten steuern können für die Suche nach erfolgreichen Behandlungen für die verschiedenen neurologischen Erkrankungen kritisch sein. Da dieser in-vitro- Phagozytose Assay mit multiwell-Platten leicht werden skaliert, kann diese Methode als geeignete Plattform für verschiedene Vorführungen verwendet werden, um solche Faktoren zu identifizieren.

Gliazellen, die nicht leicht erregbaren Zellen im Gehirn beziehen, sind die wichtigen Zelltyp in das zentrale Nervensystem (ZNS). Zuvor galten Gliazellen als bloße Stützzellen, die vor allem passive Rollen bei der Aufrechterhaltung neuronaler überleben und basalen synaptischen Eigenschaften spielen. Anzeichen dafür ergab jedoch, dass Gliazellen in verschiedene Aspekte der Neurobiologie, wie Gehirn Homöostase, Vermittlung von Synapse Bildung1,2,3 und Synapse eine aktivere Rolle spielen Beseitigung4,5, und modulierenden synaptische Plastizität6,7. Gliazellen des ZNS gehören Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia. Zwischen diesen Zellen, Astrozyten und Mikroglia haben gezeigt, dass phagocytic Rollen zu spielen, indem Sie verschlingen Synapsen4,5, apoptotischen Zellen8, neuronale Trümmer9und Pathogene Proteine wie Amyloid beta Plaketten10,11. In das sich entwickelnde Gehirn beseitigen Astrozyten Synapsen im dorsalen seitlichen gekniet Nucleus (CGN) durch MERTK und MEGF10-abhängige Phagozytose4. In ähnlicher Weise Mikroglia auch beseitigen C1q-beschichtete Synapsen während Entwicklungsstadien durch die klassische Ergänzung Kaskade5. Interessanterweise wurde vermutet, dass Mängel in Synapse beschneiden einer der Initiatoren von verschiedenen neurologischen Störungen sein können. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass Mutationen in Ergänzung Komponente 4 (C4), die Ergänzung-vermittelten Synapse Beschneiden von Mikroglia zunimmt, eng mit der Prävalenz von Schizophrenie in Menschen12 sind. Eine neuere Arbeit hat auch gezeigt, dass die klassische Ergänzung Bahn Überaktivierung in der Einleitung von AD und frühem Verlust der Synapse in dieser Krankheit13induziert.
Verglichen mit Mikroglia-vermittelten Phagozytose, ob Astrozyten vermittelt Phagozytose, die Initiierung und Progression von verschiedenen neurologischen Erkrankungen beiträgt, ist weniger klar. Eine neuere Arbeit legt jedoch nahe, dass Faktoren, die die Rate der normalen Synapse Beschneidung von Astrozyten verändern können Gehirn Homöostase zu stören und zu AD Anfälligkeit und Pathologie14beitragen. Die Rate der Synapse Beschneidung von Astrozyten steuert kraftvoll ApoE -Isomere, mit einer schützenden Allel für AD (ApoE2) stark erhöhen die Rate und eine Risiko-Allel für AD (ApoE4) die Rate deutlich zu senken. Darüber hinaus angesammelt transgene Mäuse, die mit dem Ausdruck ApoE4 viel mehr synaptische C1q als Kontrolle oder ApoE2 Mäuse14. Diese Daten deuten darauf hin, dass Sehbehinderte Astrozyten vermittelt Phagozytose in den frühen AD Gehirn kann induzieren die Anhäufung der alternde C1q-beschichtete Synapsen/synaptische Trümmer, die Ergänzung-vermittelten Mikroglia Phagozytose, fahren synaptischen Degeneration aktiviert . Die beeinträchtigte phagocytic Kapazität der Astrozyten in ApoE4 Trägern kann auch die unkontrollierte Anhäufung von Beta Amyloid-Plaques im Gehirn AD betroffen beitragen.
Darüber hinaus hat gezeigt, dass Gliazellen im Gehirn im Alter von Drosophila ihre phagocytic Kapazität aufgrund der verringerten Übersetzung von Draper, ein Homolog des Megf10 , die Astrozyten verwenden verlieren für phagocytosing Synapsen. Wiederherstellen von Draper Ebenen gerettet phagocytic Kapazität von Gliazellen, die effizient beschädigte axonalen Schutt im alten Gehirn in ähnlichem Ausmaß wie im jungen Gehirn darauf hinweist, dass Altern ausgeglichen-induzierte Veränderungen in der phagocytic Kapazität von Astrozyten können zu Störungen des Gehirns Homöostase15beitragen.
Möglicherweise modulieren die phagocytic Kapazität der Astrozyten basierend auf diese neuen Erkenntnisse, eine attraktive therapeutische Strategie zur Vorbeugung und Behandlung von verschiedenen neurologischen Erkrankungen. In diesem Zusammenhang gab es mehrere Versuche, phagocytic Astrozyten, beispielsweise verstärkt durch Induktion Versauerung der Lysosomen mit sauren Nanopartikel16 und überexprimierenden Transkriptionsfaktor EB (TFEB), die erhöhen können Lysosomen Biogenese17. Trotz dieser Bemühungen ist noch unklar, wie Astrozyten und Mikroglia-Zellen unterscheiden sich in ihrer phagocytic Kinetik und ob wir erhöhen oder verringern Sie ihre phagocytic Kapazitäten bei verschiedenen Erkrankungen sollten.
In diesem Beitrag präsentieren wir eine neuartige in-vitro- Test zur Erkennung von phagocytic Kapazität der Astrozyten in Echtzeit. Die Daten zeigen unterschiedliche Kinetik der Engulfment und Abbau in Astrozyten und Mikroglia. Astrozyten konditioniertes Medium (ACM), die von Astrozyten sezernierten Faktoren enthält, ist essentiell für effektive Phagozytose von Astrozyten und Mikroglia. Darüber hinaus spielt Megf10, einen phagocytic Rezeptor in Astrozyten und ein Homolog von Ced-1 und Draper, wichtige Rollen in Astrozyten vermittelt Phagozytose8,18.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Synaptosome purification&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE healthcare life sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2</td><td>BIO-RAD</td><td>5000202</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;pH indicator conjugation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td><td>LPS solution</td><td>DMSO100</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo red, succinimidyl ester</td><td>Molecula probes</td><td>P36600</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunopanning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Earle&amp;rsquo;s balanced salt solution (EBSS)</td><td>Sigma</td><td>E7510</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Bovogen</td><td>BSA025</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyrebonuclease 1 (DNase)</td><td>Worthington</td><td>Is002007</td><td></td></tr><tr><td>(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>(dPBS)</td><td>Welgene</td><td>LB001-02</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1)</td><td>Vector Labs</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-044</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgM (&amp;mu;-chain)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-binding epidermal growth factor</td><td>Sigma</td><td>E4643</td><td></td></tr><tr><td>Human HepaCAM antibody</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>MAB4108</td><td></td></tr><tr><td>Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52)</td><td>eBioscience</td><td>14-0497-82</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamate</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetly-L-cyteine (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal media</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>O4 hybridoma supernatant(mouse IgM)</td><td>Bansal et al.&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;23&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>Is003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluristrainer 20 &amp;mu;m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Purified rat anti-mouse CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>550539</td><td></td></tr><tr><td>Purified mouse anti-rat CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T9935</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor</td><td>Worthington</td><td>LS003086</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Collect IP-ACM&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k)</td><td>PALL</td><td>MAP010C37</td><td></td></tr><tr><td>Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k)</td><td>PALL</td><td>MAP030C37</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Phagocytosis live imaging assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Juli stage</td><td>NanoEntek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Time Series Analyzer V3 plugins</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using ph indicator-conjugated synaptosomes

Astrozyten sind die wichtigen Zelltyp im Gehirn und Synapsen und Blutgefäße direkt zu kontaktieren. Obwohl Mikroglia-Zellen die wichtigsten Immunzellen und nur Fresszellen im Gehirn betrachtet, haben neuere Studien gezeigt, dass Astrozyten auch Teilnahme an verschiedenen phagocytic Prozesse, z. B. Entwicklungsstörungen Synapse Beseitigung und Clearance von Beta Amyloid-Plaques bei Alzheimer-Krankheit (AD). Trotz dieser Erkenntnisse ist die Effizienz der Astrozyten Engulfment und Abbau ihrer Ziele unklar im Vergleich mit der Mikroglia. Dieser Mangel an Informationen ist meist aufgrund des Fehlens von einem Testsystem, in denen die Kinetik der Astrozyten und Mikroglia vermittelt Phagozytose sind leicht vergleichbar. Um dieses Ziel zu erreichen, entwickelten wir einen langfristige live-Imaging in Vitro Phagozytose Assay zur Bewertung der phagocytic Kapazität der gereinigten Astrozyten und Mikroglia. In diesem Test ist Echtzeit-Erkennung von Engulfment und Abbau möglich mit pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes, die leuchtend rote Fluoreszenz in sauren Organellen, wie Lysosomen abgeben. Unsere neuartige Assay bietet einfache und effektive Erkennung von Phagozytose durch live-Imaging. Darüber hinaus kann dieser in-vitro- Phagozytose Assay als Screening-Plattform verwendet werden, um zu identifizieren, Chemikalien und Substanzen, die zu verbessern oder hemmen die phagocytic Kapazität der Astrozyten. Wie synaptic Pruning Fehlfunktion und Pathogene Protein Akkumulation gezeigt wurden, psychischen Störungen oder neurodegenerativen Erkrankungen verursachen, sollte Chemikalien und Substanzen, die die phagocytic Kapazität von Gliazellen modulieren hilfreich bei der Behandlung von verschiedenen neurologische Erkrankungen.

In dieser in Vitro Phagozytose Assay mit langfristigen live-Imaging verwendeten wir Synaptosomes von Erwachsenen Maus Gehirn Homogenates, die in der gradient Lösung zwischen 23 % Steigung und 10 % Steigung Lösung, durch Ultrazentrifugation getrennt waren ( ( Abbildung 3). Nach der Zubereitung ausgesetzt Synaptosomes PS in der äußeren Membran (Abbildung 4), was darauf hindeutet, dass sie ihre Funktion verloren und durch PS-Rezeptoren in Astrozyten und Mikroglia erkannt werden könnte. Wie in Abbildung 5gezeigt, emittiert pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes leuchtend rote Fluoreszenz, wenn sie von Astrozyten verschlungen wurden. Echtzeit-Vergleich der Engulfment und Abbau von Gliazellen ist möglich, indem Sie mehrere Bilder von einem ROI jeweils 1 oder 2 h (ergänzende Film 1, ergänzende Movie 2). Mit dieser Methode haben wir unterschiedliche Kinetik der Astrozyten und Mikroglia vermittelt Phagozytose (Abbildung 6). Quantifizierung der Phagozytose von Gliazellen Bereich (µm2) rote Fluoreszenz-Signal gemessen wurde, das nennt man Phagocytic Index in Abbildung 6 b und Abbildung 7. Obwohl Astrozyten erschien bei effizient phagocytosing große Mengen an pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes, Mikroglia waren schneller verschlingt und erniedrigende Synaptosomes (Abb. 6 b). Mikroglia zeigte maximale pH-Indikator-Intensität bei 26 h nach pH-Indikator-konjugiert Synaptosome-Behandlung, während Astrozyten ihr Maximum bei 45 h zeigte (p-Wert < 0,05, zwei-Wege-ANOVA zwischen Astrozyten mit 1 X ACM und Mikroglia mit 1 X ACM). Ebenso Mikroglia-Zellen zeigten eine Reduzierung von 20,7 % im gesamten pH-Indikator-Intensität 40 h nach Gipfelpunkt, während Astrozyten eine 17 % ige Reduktion im gesamten pH-Indikator-Intensität während des gleichen Zeitraums zeigte. Interessanterweise zeigte unsere Daten, dass Astrozyten abgesondert Faktoren, die in ACM enthalten waren, wesentlich zur Erhöhung der beiden Astrozyten und Mikroglia vermittelt Phagozytose (Abbildung 6). Astrozyten haben gezeigt, dass loslassen Überbrückung Moleküle, wie MFGE8, GAS6 und Proteine, die Brücke und Interaktionen zwischen phagocytic Rezeptoren auslösen können und "Essen-mich" Signale wie PS23. Wie oben erwähnt, beseitigen Astrozyten Synapsen über den MERTK und MEGF10 Wege4. MEGF10 wird nur durch Astrozyten im Gehirn ausgedrückt und beteiligt sich an Synapse Engulfment durch Erkenntnis "Essen-mich" Signale mit einer unbekannten Identität. Im Einvernehmen mit den bisherigen Erkenntnissen der Test hat gezeigt, dass im Vergleich zu Wildtyp (WT) Maus Astrozyten, Megf10 Knock Out (KO) Maus Astrozyten besessen erheblich beeinträchtigt phagocytic Kapazität (Abbildung 7). Verglichen mit WT Astrozyten, Megf10 KO Astrozyten zeigte eine ca. 40 % Verringerung der gesamten pH-Indikator Intensität am Gipfelpunkt (31 h) (Abbildung 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig1.jpg"> Abbildung 1: Der Astrozyten Reinigung mit Immunopanning Methoden schematische. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56647/56647fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig2.jpg"> Abbildung 2: Schaltplan der Phagozytose live-Imaging-Assay. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56647/56647fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig3.jpg"> Abbildung 3. Repräsentative Gehirn Homogenat Fraktionierung in den Farbverlauf Lösungen. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56647/56647fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig4.jpg"> Abbildung 4. Repräsentative Bilder von PS-exponierten Synaptosomes. (A) A Hellfeld Bild der Astrozyten mit Synaptosomes. Astrozyten sind Synaptosomes zugeordnet. (B) ein fluoreszierendes Bild der TdTomato-Positive Synaptosomes, die von TdTomato exprimierenden Maus gereinigt werden Gehirne. (C) pSIVA bindet an PS, der äußeren Membran der Synaptosome ausgesetzt ist, und strahlt grün fluoreszieren. (D) PS von pSIVA (grün) erkannt ist Co lokalisierte mit TdTomato-positiven Synaptosomes (rot). Maßstabsleiste: 20 µm <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56647/56647fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig5.jpg"> Abbildung 5. Repräsentative Hellfeld und fluoreszierende Bilder von Astrozyten mit pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes zu zwei Zeitpunkten. Um 11 Uhr nach der Behandlung (Bodenplatte) pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes sind von Astrozyten verschlungen und rote Fluoreszenz emittieren, während sie nicht auf 1 h nach der Behandlung (obere Abdeckung) zu tun. Maßstabsleiste: 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56647/56647fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig6.jpg"> Abbildung 6. Phagocytic Kinetik der Ratte Astrozyten und Mikroglia durch langfristige Leben-Bildgebung. (A) A schematische Darstellung einer in-vitro- Phagozytose-Assays mit gereinigten Astrozyten und Mikroglia zusammen mit pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes. Beachten Sie, dass vor der live-Bilder, ungebundenen Synaptosomes nach 40 min Inkubation weggespült werden. (B) repräsentative Grafiken zeigen die Engulfment und Abbau Kinetik der Astrozyten und Mikroglia. ACM, die Astrozyten abgesondert Faktoren enthält, erhöht sowohl Astrozyten und Mikroglia-vermittelten Synaptosome-Aufnahme. Astrozyten: Kontrolle vs. Astrozyten mit ACM 1 X ***, Tukey's multiple Vergleiche-Test. Mikroglia: Kontrolle vs. Mikroglia mit ACM 1 X ***, Tukey ist mehrere Vergleichstest. Fehlerbalken zeigen S.E.M *p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,0001, zwei-Wege-ANOVA. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56647/56647fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56647/56647fig7.jpg"> Abbildung 7. Verminderte phagocytic Kapazität von Megf10 KO Maus Astrozyten mit 1 X ACM im Vergleich mit der WT Maus Astrozyten mit 1 X ACM. WT vs. Megf10 KO Astrozyten mit 1 X ACM ***, zwei-Wege-ANOVA. Fehlerbalken zeigen S.E.M * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 Zweiwege-ANOVA. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56647/56647fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Tabelle 1: Lösung Rezepte. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56647/JoVE_Materials_R.xls">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Film 1. Eine repräsentative live-Imaging-Video zeigt die Phagozytose von pH Indikator konjugiert Synaptosomes von Astrozyten. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56647/Supplementary_data_Movie_1A_Astrocytes.mp4">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Film 2. Eine repräsentative live-Imaging videovertretung Phagozytose pH Indikator konjugiert Synaptosomes durch Microglial Zellen. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56647/Supplementary_data_Movie_1B_Microglia.mp4">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes at JoVE.com

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Dieses Protokoll stellt einen in-vitro- live-Imaging Phagozytose Assay phagocytic Kapazität von Astrozyten zu messen. Gereinigte Ratte Astrozyten und Mikroglia sind zusammen mit pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes verwendet. Diese Methode kann in Echtzeit Engulfment und Abbau Kinetik erkennen und bietet eine geeignete Screening-Plattform für Astrozyten Phagozytose modulierende Faktoren zu identifizieren.

Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

a-novel-vitro-live-imaging-assay-astrocyte-mediated-phagocytosis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

12.1K Aufrufe.  Korea Advanced Institute of Science and Technology. Dieses Protokoll stellt einen in-vitro- live-Imaging Phagozytose Assay phagocytic Kapazität von Astrozyten zu messen. Gereinigte Ratte Astrozyten und Mikroglia sind zusammen mit pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes verwendet. Diese Methode kann in Echtzeit Engulfment und Abbau Kinetik erkennen und bietet eine geeignete Screening-Plattform für Astrozyten Phagozytose modulierende Faktoren zu identifizieren.

Serie: A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Biotechnik

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Immunologie und Infektion

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of oxygen and glucose, which causes energy failure and neuronal death. After an ischemic stroke insult, astrocytes become reactive and proliferate around the injury site as it develops. Under this scenario, it is difficult to study the specific contribution of astrocytes to the brain region exposed to ischemia. Therefore, this article introduces a methodology to study primary astrocyte reactivity and proliferation under an in vitro model of an ischemia-like environment, called oxygen glucose deprivation (OGD). Astrocytes were isolated from 1-4 day-old neonatal rats and the number of non-specific astrocytic cells was assessed using astrocyte selective marker Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and nuclear staining. The period in which astrocytes are subjected to the OGD condition can be customized, as well as the percentage of oxygen they are exposed to. This flexibility allows scientists to characterize the duration of the ischemic-like condition in different groups of cells in vitro. This article discusses the timeframes of OGD that induce astrocyte reactivity, hypertrophic morphology, and proliferation as measured by immunofluorescence using Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Besides proliferation, astrocytes undergo energy and oxidative stress, and respond to OGD by releasing soluble factors into the cell medium. This medium can be collected and used to analyze the effects of molecules released by astrocytes in primary neuronal cultures without cell-to-cell interaction. In summary, this primary cell culture model can be efficiently used to understand the role of isolated astrocytes upon injury.

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex event in which the specific contribution of astrocytes to the affected brain region exposed to oxygen glucose deprivation (OGD) is difficult to study. This article introduces a methodology to obtain isolated astrocytes and study their reactivity and proliferation under OGD conditions.

Überwachung der Astrozyten Reaktivität und Proliferation in Vitro unter ischämischen-ähnlichen Bedingungen

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in brain homeostasis, astrocytes supply neurons with vital metabolites and buffer extracellular water, ions, and glutamate. An integral component of the &#8220;tri-partite&#8221; synapse, astrocytes are also critical in the formation, pruning, maintenance, and modulation of synapses. To enable these highly interactive functions, astrocytes communicate among themselves and with other glial cells, neurons, the brain vasculature, and the extracellular environment through a multitude of specialized membrane proteins that include cell adhesion molecules, aquaporins, ion channels, neurotransmitter transporters, and gap junction molecules. To support this dynamic flux, astrocytes, like neurons, rely on tightly coordinated and efficient intracellular transport. Unlike neurons,&#160;where intracellular trafficking has been extensively delineated, microtubule-based transport in astrocytes has been less studied. Nonetheless, exo- and endocytic trafficking of cell membrane proteins and intracellular organelle transport orchestrates astrocytes&#8217; normal biology, and these processes are often affected in disease or in response to injury. Here we present a straightforward protocol to culture high quality murine astrocytes, to fluorescently label astrocytic proteins and organelles of interest, and to record their intracellular transport dynamics using time-lapse confocal microscopy. We also demonstrate how to extract and quantify relevant transport parameters from the acquired movies using available image analysis software (i.e., ImageJ/FIJI) plugins.

Here we describe an in vitro live-imaging method to visualize intracellular transport of organelles and trafficking of plasma membrane proteins in murine astrocytes. This protocol also presents an image analysis methodology to determine cargo transport itineraries and kinetics.

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

Durchflusszytometrie-basierte Assays für das mikrogliale Engulfment von synaptischen Materialien

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

Autor im Rampenlicht: Förderung des Verständnisses durch technologische Innovationen in der Psychoneuroimmunologie

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion

Überwachung der Astrozyten Reaktivität und Proliferation in Vitro unter ischämischen-ähnlichen Bedingungen

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie