Unser Protokoll kann verwendet werden, um die Beweglichkeit und Lokalisation von astrozytischen Organellen oder Proteinen unter kontrollierten extrazellulären Umgebungen und leichten Krankheitszuständen zu untersuchen. Im Gegensatz zu den MHA-Festpräparaten, die einzelne Momentaufnahmen der Protein- und Organellenlokalisierung liefern, kann unsere Live-Bildgebungstechnik zur Analyse der Partikeldynamik in einzelnen lebenden Astrozyten eingesetzt werden. Am Tag vor der Transfektion saat astrozyten mit der entsprechenden Dichte für die Bildgebung bei 24 bis 48 Stunden nach der Transfektion.
Verdünnen Sie das Lipofektionsreagenz in reduziertem Serummedium auf die entsprechende experimentelle Konzentration. Verdünnen Sie fünf Mikrogramm hochreine DNA in 250 Mikroliter reduziertem Serummedium und fügen Sie fünf Mikroliter Lipofection Enhancer Reagenz in die Röhre. Mischen Sie das Lipofection-Reagenz mit einem gleichen Volumen der DNA Lipofection Enhancer Mischung und inkubieren Sie die Lösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Am Ende der Inkubation entfernen Sie den Überstand aus der Astrozytenkultur und fügen Sie 100 Mikroliter des Transfektionsmixes tropfenweise zu den Zellen hinzu. Ersetzen Sie nach sechs Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid den Transfektionskomplex durch ein entsprechendes Volumen an Astrozytenkulturmedium und geben sie die Zellen für weitere 24 bis 72 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurück. 30 Minuten vor der Bildgebung eine geeignete lysosomale Etikettiersonde in 200 Mikroliter n. Astrozytenkultur medium auf eine Arbeitskonzentration von einem Mikromolaren verdünnen und die Astrozyten 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit einer Sonde kennzeichnen.
Dann waschen Sie die Zellen einmal mit warmen Astrozytenkulturmedium und ersetzen Sie die Wäsche mit Bildnismedium. Legen Sie unmittelbar nach der Sondenbeschriftung den Astrozytenkulturbehälter in den entsprechenden Adapter auf der Mikroskopstufe und lokalisieren Sie mit EBI-Fluoreszenzlicht die Zellen, die fluoreszierende Proteine oder Sonden exprimieren. Verwenden Sie die Digitalkamera, um die fluoreszierende Probenbeleuchtung anzupassen, um die ausgewählten Zellen zu visualisieren und den Fokus anzupassen und auf eine einzelne Zelle zu zoomen.
Verwenden Sie dann die Zoom- und Definite Focus-Funktionen, um eine einzelne Z-Stack-Zeitrafferserie mit einer Frequenz von einem Frame alle zwei Sekunden für Zeitintervalle zwischen 300 und 500 Sekunden zu erfassen. Speichern und exportieren Sie die Zeitrafferbilder als AVI- oder TIFF-Stack-Dateien. Um die Zeitrafferbilder zu analysieren, öffnen Sie die Zeitraffer-Bildsequenz in ImageJ oder Fidschi und verwenden Sie das Werkzeug Split Channel, um die Kanäle aufzuteilen.
Verwenden Sie im Acht-Bit-Grünkanalbild das Werkzeug Segmentierte Linie, um eine Linie entlang der Flugbahnen der Partikel zu verfolgen, wobei die gleiche gewünschte Richtungskonvention für alle Filme verwendet wird, sodass die Polarität innerhalb und über alle untersuchten Zellen konsistent ist. Doppelklicken Sie auf das Linienwerkzeug, um die Linienbreite an die Dicke der Spur anzupassen, und führen Sie das Draw Kymo-Makro des Kymo ToolBox-Plugins mit einer Linienbreite von 10 aus. Es wird eine Aufforderung angezeigt, das Bild in Zeit und Raum zu kalibrieren.
Nach der Kalibrierung werden Kymographen generiert und können als TIFF-Dateien gespeichert werden. Um Partikelbahnen zuzuweisen, verwenden Sie das Werkzeug Segmentierte Linie, um jedes Partikel im Kymographen für die gesamte Dauer der Erfassung manuell zu verfolgen, und verwenden Sie den ROI-Manager, um jede Partikelbahn als Interessenbereich aufzuzeichnen. Speichern Sie alle Interessensgebiete pro Zeitraffer-Video für die weitere Analyse und führen Sie das Analyze Kymo-Makro des Kymo ToolBox Plugins aus.
Es öffnet sich ein Fenster, in dem die äußere Richtung der Partikelbewegung aus dem Kern der zelle von Interesse aus dem Dropdown-Menü definiert wird. Die Grenzgeschwindigkeit sollte entsprechend der Empfindlichkeit der Software für jede Ladung von Interesse definiert werden und die Linienbreite sollte an die Dicke jeder Partikelbahn angepasst werden. Die Log All Data und Log Extrapolated Coordinates sollten für die Berechnung der verschiedenen Ladungstransportparameter sein.
Klicken Sie auf Okay. Die für die einzelnen Spuren berechneten Daten werden dann per Kymograph gepoolt und in textdateien gespeichert, die für jedes Bild spezifisch sind. Die Kombination von Cytosin-Arabinoside-Behandlung mit der schüttelbasierten Reinigungsstrategie bereichert die Reinheit der Astrozytenkulturen gegenüber traditionellen Protokollen, die nur den Reinigungsschritt beinhalten.
Lipofection-basierte Transfektion ermöglicht die transiente Expression von Proteinen auf Ebenen, die für die Bildgebung von lebenden Zellen optimal sind, ohne Toxizität zu verursachen oder die Astrozytenlebensfähigkeit zu beeinträchtigen. In ähnlicher Weise ermöglicht der Einsatz einer fluoreszierenden Sonde die schnelle und effiziente Kennzeichnung saurer endolysosomaler Organellen zur Verfolgung von Organellendynamik und Astrozyten. Die Zeitrafferdaten aus der Bildgebung können verwendet werden, um Kymographen zu erzeugen, die Ladungsbewegungen in Zeit und Raum verfolgen.
In diesen Kymographen wird die anterograde Bewegung der angegebenen Ladung durch Flugbahnen mit negativen Steigungen dargestellt, während retrograde Bewegung durch Flugbahnen mit positiven Steigungen dargestellt wird. Stationäre Vesikel erscheinen als vertikale Bahnen. In dieser Analyse ergab die Quantifizierung des Flusses einer bestimmten Ladung durch einen Bereich der Astrozyten Unterschiede im Prozentsatz der Modalteilchen zwischen ladungen, die wahrscheinlich repräsentativ für ihre normale Grundlinienmotilität in der Region der Astrozyten, in der die Filme erworben wurden, repräsentativ sind.
Die genaue Abbildung der Änderung der X-, Y-Position entlang der vollen Zeitskala für jedes aus dem Kymograph erhaltene Teilchen kann auch zur Auswertung anderer Bewegungsparameter wie Frachtgeschwindigkeit und Lauflänge verwendet werden. Da dieses Protokoll qualitativ hochwertige Astrozytenkulturen und eine effiziente Frachtkennzeichnung erfordert, sollten die Inkubationszeit und die Erfassungszeitzeit für jedes Plasmid oder jede Ladung von Interesse angepasst werden. Dieses Protokoll kann geändert werden, um Transportereignisse in Astrozyten als Reaktion auf Zellschäden, Toxizität, pathogene Mutationen, synaptische Aktivität oder Veränderungen in der intra- oder extrazellulären Umgebung zu charakterisieren.
