Name: assessment of antibody-based drugs effects on murine bone marrow and peritoneal macrophage activation
Uploaded: 2017-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
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L.k. ist der Empfänger von der University of British Columbia 4-Jahres-Stipendium (4YF) Diplom Zugehörigkeit Award. L.M.S ist der Empfänger der Canadian Association of Gastroenterology / Morbus Crohn und Colitis Kanada / CIHR neue Ermittler Gehalt Award und biomedizinische Stipendiat der Stiftung Michael Smith für die Gesundheitsforschung. Diese Arbeit wurde durch einen Projekt-Zuschuss von Canadian Blood Services in Zusammenarbeit mit der Canadian Institutes of Health Research unterstützt (gewähren # CIHR2016-LS).

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of British Columbia genehmigt.
(1) Knochenmark Makrophagen Ableitung und Aktivierung mit Antikörpern
<ol>
	<li>Führen Sie Sterbehilfe mit CO2 Erstickung.<ol>
		<li>Statt Maus Induktion Kammer. Einschläfern Sie Maus mit 5 % Isoflurane Narkose, für 60-90 s, bis unbeweglich und atmen tief und langsam ist.</li>
		<li>Isofluran-Narkose schalten Sie und verwalten Sie ca. 6-8 L/min CO2 bis Maus atmen aufgehört hat. Lassen Sie Maus mit CO2 für mindestens weitere 5 min. überprüfen, dass es nicht mehr ein Herzschlag oder Atmung. Führen Sie eine zervikale Dislokation um Tod zu gewährleisten. Hinweis: 8-12 Wochen alte Mäusen bieten den höchsten Ertrag von Makrophagen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spray Maus Beine mit 70 % Ethanol und Pin, die sie mit Armen und Beinen in Rückenlage auf eine Dämmplatte verteilt. Machen Sie mit Schere und Pinzette die Haut halten einen flachen Schnitt (0,2 cm), die Haut und das Fell von der Oberfläche eines jeden der Hinterbeine zu entfernen. Hinweis: Führen Sie dieses Verfahren und alle Gewebekultur Manipulationen in einer sterilen Kapuze.</li>
	<li>Schneiden Sie Muskel um Tibien und Oberschenkelknochen sichtbar zu machen. Entfernen Sie die Schienbeine und Oberschenkelknochen, durch Schneiden von Knochen und Muskeln unterhalb des Hüftgelenks und über den Knöcheln. So viele Muskeln wie möglich abschneiden.</li>
	<li>Sprühen Sie Knochen mit 70 % Ethanol und warten Sie 1 Minute zu verdunsten, dann legen Sie sie in 6-well-Platte Knochen bündig Medium (Iscoves modifizierte Dulbecco Medium (IMDM), 10 % fetalen bovine Serum (FBS)).</li>
	<li>Schneiden Sie die Enden der Knochen von 0,1 cm des Knochens aus die Knöchel und die Oberseite des Oberschenkelknochens schneiden, so dass der Knochenhohlraum ausgesetzt ist. Sicherstellen Sie, dass das Knochenmark sichtbar ist und eine 26 Gauge-Nadel in den Knochenhohlraum platziert werden kann.</li>
	<li>Schneiden Sie die Knochen und Muskeln, die Schienbeine und Oberschenkelknochen aus den Kniegelenken zu trennen. Legen Sie eine 26 Gauge-Nadel befestigt, eine 10 mL Spritze in den Hohlraum. Spülen Sie das Knochenmark in ein 50 mL konische Röhrchen mit 5 mL des Knochens bündig mittlere. Spülen Sie zwei Schienbeine und zwei Oberschenkelknochen von einem einzigen Mausklick in jede 50 mL Tube.</li>
	<li>Pipette nach oben und unten mehrere Male oder Wirbel das Knochenmark mit langsamer Geschwindigkeit, Klumpen behutsam zu zerstreuen. Strings von Knochenmark sollte in klein (weniger als 0,5 mm) Flecken von Knochenmark aufgeteilt werden. Füllen Sie das konische Rohr bis 50 mL mit Knochen bündig mittlere. Pipette Inhalt des konischen Rohres in einer Gewebekultur 75 cm2 behandelt Kolben und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 1 h. Hinweis: Ältere Makrophagen und mesenchymalen Zellen werden an den Kolben und verworfen werden, während die gewünschte hämatopoetischen Vorläuferzellen in der Schwebe bleiben.</li>
	<li>Das Medium mit hämatopoetischen Vorläuferzellen in ein 50 mL konische Röhrchen Pipette. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 300 X g bei Raumtemperatur für 5 min. verwerfen den Überstand und das Pellet in 5 mL Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (MCSF) Kulturmedium Aufschwemmen (IMDM, 10 % FBS, 5 ng/mL MCSF und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin 150 μM Monothioglycerol (MTG)).</li>
	<li>Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer18. Fügen Sie Medium, um Zellen zu einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/mL, 1, 5 x 107 Zellen/Kolben in 30 mL Medium, Aufschwemmen und pipette vorsichtig nach oben und unten hinzu. Pipette 30 mL der Suspension in eine neue 75 cm2 Gewebekultur behandelt Kolben.</li>
	<li>Am Tag 4 und 7. Tag nach der ursprünglichen Kultur im Schritt 1,9 überprüfen Sie die Zellen anhaftende und leicht verzweigt mit einem invertierten Phase Kontrast Hellfeld-Mikroskop. Entsorgen Sie das Medium mit den nicht-anhaftende Zellen. Waschen Sie die Zellen mit IMDM einmal und 30 mL MCSF Kulturmedium.</li>
	<li>Wenn die Zellen sind Reifen von Tag 10 (&#62; 95 % positiv für F4/80 und Mac-1), noch einmal überprüfen, ob die Zellen sind Anhänger und leicht.</li>
	<li>Platte Zellen für Stimulationen, das Kulturmedium aus der Flasche zu entfernen und Hinzufügen von 8 mL Enzym frei, EDTA-basierte Zelle Dissoziation Puffer (Table of Materials). Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
	<li>Kratzen Sie Zellen sanft, mit einer kleinen Menge des Drucks, mit einem sterilen Zelle Schaber. Check-in das Mikroskop, das Zellen von der Oberfläche der Küvette getrennt haben. Pipette dissoziiert Zellen in ein 50 mL konische Röhrchen. Spülen Sie den Kolben 3 Mal mit 5 mL IMDM und bündeln Sie die Spüllösung mit Zellen, die geerntet wurden. Zentrifugieren Sie Zellen bei 300 X g bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
	<li>Die Zelle Pellet in 3 mL MCSF Kulturmedium pro 50 mL konische Röhrchen aufzuwirbeln. Anzahl vitaler Zellen mit einem Hemocytometer18. Zellen in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL und Platte 100 μl Zellsuspension (1 x 105 Zellen/Na) pro Bohrloch einer 96-Well Gewebekultur behandelt, flache Bodenplatte aufzuwirbeln. Hinweis: Knochen aus einem einzigen Mausklick erzeugt genügend Zellen für 100 Brunnen. Auf Wunsch können 1 mL der Zellen in einem 6-Well-Platte (Gewebekultur behandelten, flacher Boden) überzogen. Eine größere Anzahl von Zellen (1 x 106 ) kann für western-Blot Analysen nützlich sein.</li>
	<li>Sobald anhaftende, doppelte oder dreifacher Brunnen jeweils mit 10 ng/mL von LPS in IMDM, 30 mg/mL IVIg, oder IVIg + LPS zu stimulieren. Dosen von LPS oder IVIg können titriert werden, um Antworten zu optimieren. Doppelte oder dreifacher Brunnen als unstimulierte Steuerelemente zu verlassen. Inkubieren sie für 24 h (37 ° C, 5 % CO2). Hinweis: Neu vergoldete Zellen sollte Gewebekultur Brunnen innerhalb 1 h entsprechen.</li>
	<li>Sammeln Sie Zelle Überstände jede Vertiefung in einzelnen 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie Partikel enthält durch Spinnen bei 10.000 x g für 5 min.</li>
	<li>Entfernen Sie die Zelle überstand und nicht zu stören das Pellet. Ort der geklärte Zelle in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch überstand. Hinweis: Zelle Überstände können Zytokine IL-10 und Zytokin-Untereinheit, IL-12 / 23p 40, durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) sofort untersucht, oder bei-80 ° C langfristig gelagert. Folgen Sie ELISA Protokoll von kommerziell erhältlichen Kit (Table of Materials). Andere Pro-inflammatorische Zytokine kann geprüft werden, wie IL-6 und TNF, wie auch sie durch Behandlung mit IVIg sinken + LPS Stimulation im Vergleich zur Stimulation mit LPS allein. Nach der Stimulation können Techniken wie westliche Beflecken oder quantitative Polymerase-Kettenreaktion (Q-PCR) 19,20adhärente Zellen vorbereitet sein.</li>
</ol>
(2) herausfordernd Mäuse In Vivo mit IVIg und Ernte peritoneale Makrophagen
<ol>
	<li>Wiegen Sie jede Maus.</li></ol>Berechnen Sie das Volumen der IVIg (Lager Konzentration 100 mg/mL) benötigt, um eine endgültige Dosis von 2,5 g/kg Körpergewicht für jede Maus zur Verfügung stellen. Hinweis: zum Beispiel ist bei einer Maus 20 g 500 µL IVIg erforderlich.
	<li>Zeichnen die erforderliche Menge an IVIg in eine sterile 1 mL Spritze mit einer sterilen 26 ausgestattet gauge Nadel. Verwalten Sie für Kontroll-Mäusen, die nicht IVIg erhalten eine Äquivalentdosis Volumen von sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,4 statt IVIg.</li>
	<li>SCRUFF die Maus mit einer Hand durch seine Haut an der Rückseite des Halses mit Daumen und Zeigefinger greifen und hielt seinen Schweif und Hinterbeine mit den restlichen Fingern. Neigen Sie ihren Körper auf den Boden.</li>
	<li>Legen Sie die Nadel in einem Winkel von 30-40° im Verhältnis zu der Maus Bauch, im unteren rechten Quadranten, oben abgeschrägt und Einfügen von 1,5 cm von der Nadel. Injizieren Sie die IVIg oder PBS intraperitoneal. Warten Sie 1 h.</li>
	<li>Mäuse mit 5 % Isofluran-Narkose gefolgt von 6-8 L/min CO2 Erstickung einschläfern (siehe Schritte 1.1.1 - 1.1.2), oder nach ethischen Richtlinien des Instituts.</li>
	<li>Heften Sie die Maus, um eine Dämmplatte mit Gliedmaßen ausgebreitet. Sprühen Sie die Teile mit 70 % Ethanol. Hinweis: Führen Sie die Prozedur in einer sterilen Kapuze.</li>
	<li>Machen Sie einen flachen Schnitt in der Haut (0,2 cm) mit einer Schere entlang der Mittellinie der Maus, um zu vermeiden, schneiden die Bauchhöhle. Ziehen Sie die Bauchhaut Ausschalten der Maus Bauch mit Pinzette, damit das Futter von der intakten peritonealen Wand sichtbar ist.</li>
	<li>Füllen Sie eine 5 mL Spritze mit 5 mL sterilem PBS (pH 7,4). Legen Sie ein 25 oder 27 gauge Nadel an der Spitze des Hohlraums aus entweder links oder rechts in Richtung der Mitte der Maus mit der Schräge der Nadel auf. Hinweis: Legen Sie die Nadel vorsichtig in der Maus, so dass Sie PBS nicht in die Organe, sondern vielmehr in den peritonealen Raum injizieren.</li>
	<li>Drücken Sie die Flüssigkeit in der Bauchhöhle. Ziehen Sie die Nadel aus dem Hohlraum und massieren Sie das Peritoneum für 10 s, alle Zellen zu verdrängen. Stechen Sie die Nadel an der Spitze der Kavität und vermeiden Sie Organe zu. Sammeln und die Lavage-Flüssigkeit erholte sich in einem 15 mL konische Röhrchen auf Eis legen. Hinweis: Für jede 5 mL Flüssigkeit injiziert, wird etwa 3,75 mL wiederhergestellt werden.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Injektion und Erholung (Schritte 2,8-2,9) 3 mehr Mal (insgesamt Injektionsvolumen von 20 mL), 15 mL Lavage-Flüssigkeit insgesamt wiederherstellen. Sammeln Sie Lavage jede Maus in einem separaten 15 mL konische Rohr. Hinweis: Nach der letzten Injektion kann es einfacher sein, die Flüssigkeit von den weit linken und rechten Seiten der Maus, extrahieren wo Flüssigkeit angesammelt hat. Die Organe werden weniger Interferenzen mit der Nadel an dieser Stelle führen.</li>
	<li>Spin-down Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zellen in 500 μL der Beschichtung Medium (IMDM, 10 % FBS und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin) per Mausklick geleert. Zählen Sie tragfähige Makrophagen mit einem Hemocytometer18. Hinweis: Die Makrophagen werden etwas größer als die anderen peritonealen Zellen. Typische Ausbeute ist 5 x 105 - 1 x 106 Makrophagen/Maus mit einem Wildtyp-C57BL/6-Maus. Optional: Wenn eine große Anzahl von roten Blutkörperchen in der Zelle Pellet vorhanden sind, führen Sie einen Lyse Schritt um sie zu entfernen, mit 1 X roter Blutkörperchen Lyse Puffer nach Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Zellen im Medium 1 x 106 Makrophagen/ml Plattieren Aufschwemmen und Platte 100 μL pro Well in eine 96-Well flache Bodenplatte Gewebekultur behandelt. Hinweis: Es möglicherweise notwendig, Pool Zellen von mehr als eine Maus für ein Experiment, wenn mit dreifacher Brunnen oder Titration Stimulanzien. Zum Beispiel wenn eine Maus 5 x 105 Makrophagen hatte, wäre 500 μL der Beschichtung Medium erforderlich. Gäbe es genügend Zellen für 5 Brunnen oder 1 Experiment in zweifacher Ausfertigung mit einer Dosis von LPS.</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2 zu Makrophagen werden Anhänger. Adhärenten Zellen sind die peritonealen Makrophagen. Entfernen Sie Zelle Überstände und nicht anhaftende Zellen. Spülen Sie die Brunnen zweimal mit 200 μL IMDM (vorgewärmt auf 37 ° C), warten Sie 10 s und langsam kippen die Platte. Ersetzen Sie das Überzug Medium. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 30 min vor der Stimulation der Zellen.</li>
	<li>Stimulieren Sie die Makrophagen mit 10 ng/mL von LPS in IMDM, oder lassen Sie unstimulierte als Kontrolle. 24 h inkubieren, sammeln und Zelle Überstände (siehe Schritte 1.16 1.17) für IL-10 Zytokin Analyse von ELISA zu klären. Folgen Sie ELISA Protokoll von kommerziell erhältlichen Kit (Table of Materials). Hinweis: Nach Stimulation können adhärente Zellen Techniken wie western-Blot oder PCR vorbereitet sein.</li>

(3) herausfordernd Mäuse in Vivo mit IVIg + LPS und Ernte peritoneale Makrophagen
<ol>
	<li>Wiegen Sie jede Maus. Berechnen Sie das Volumen der IVIg (Lager Konzentration 100 mg/mL) benötigt, um eine endgültige Dosis von 2,5 g/kg Körpergewicht bereitzustellen. Berechnen Sie die Höhe der LPS (100 μg/mL Konzentration Lager in IMDM) benötigt, um eine endgültige Dosis von 0,2 μg/g Körpergewicht bereitzustellen. Hinweis: zum Beispiel ist für eine Maus 20 g 500 µL der Stammlösung IVIg und 40 μl einer 100 μg/mL Lösung von LPS erforderlich.</li>
	<li>Zeichnen Sie die erforderliche Menge an IVIg und LPS in eine sterile 1 mL Spritze, ausgestattet mit einem sterilen 26 gauge Nadel. Ersetzen Sie für Kontroll-Mäusen, die nicht IVIg erhalten gleichwertigem Umfang von IVIg mit sterilen PBS pH 7.4.</li>
	<li>SCRUFF die Maus mit einer Hand durch seine Haut an der Rückseite des Halses mit Daumen und Zeigefinger greifen und hielt seinen Schweif und Hinterbeine mit den restlichen Fingern. Neigen Sie ihren Körper auf den Boden.</li>
	<li>Ort die Nadel in einem Winkel von 30-40° im Verhältnis zu der Maus Bauch, im unteren rechten Quadranten, Fase, und fügen Sie 1,5 cm. Spritzen die IVIg + LPS, oder PBS + LPS, intraperitoneal wie in Schritt 2.4.</li>
	<li>Ernten Sie nach 1h peritoneale Makrophagen durch Schritten 2,5-2.10.</li>
	<li>Spin-down Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. 1 mL der wiederhergestellten Lavage-Flüssigkeit zu entfernen und IL-10 und IL-12 / 23p 40 Analysen von ELISA nach Herstellerangaben verwenden oder Einfrieren bei-80 ° C für zukünftige Analysen. Hinweis: Um genauer Vergleich zwischen den Behandlungen für Lavage Fluid Zytokin Analyse zu gewährleisten, führen Sie 5 mL Flushs von der Bauchhöhle 4 Mal für ein finales Volumen von 15 mL. Nicht alle Flüssigkeit wird aus jeder Spülung wiederhergestellt werden.</li>
	<li>Wie in Schritt 2.11 Aufschwemmen und tragfähige Makrophagen zu zählen. Hinweis: Die Makrophagen werden etwas größer als die anderen peritonealen Zellen.</li></ol>Typische Ausbeute ist 5 x 105 - 1 x 106 Makrophagen/Maus mit einem Wildtyp-C57BL/6-Maus. Optional: Wenn eine große Anzahl von roten Blutkörperchen in der Zelle Pellet vorhanden sind, führen Sie einen Lyse Schritt nach Herstellerangaben zu entfernen, wie in Schritt 2.11.
	<li>Wie in Schritt 2.12, erneut aussetzen Sie Zellen in Galvanik Medium. Hinweis: Es möglicherweise notwendig, Pool Zellen von mehr als eine Maus für ein Experiment. Zum Beispiel wenn eine Maus 5 x 105 Makrophagen hatte, wäre 500 μL der Beschichtung Medium erforderlich.</li>
	<li>Wie in 2.13, inkubieren Zellen für 1 h bei 37 ° C 5 % CO2 zu Makrophagen werden Anhänger.</li>
	<li>Sammeln und konditionierten Medium gemäß Schritte 1,14 1,15, aus allen peritonealen Zellen zu klären. Hinweis: Proben können sofort verwendet oder eingefroren und bei-80 ° C für die Zytokin-Analyse von ELISA gespeichert.</li>
	<li>Führen Sie Schritt 2.11, aber inkubieren Sie Zellen für 24 h unstimulierte. Sammeln und Zelle Überstände nach Schritte 1.16-1.17 für Zytokin-Analyse von ELISA zu klären. Hinweis: Zellen können Techniken wie western-Blot oder PCR, wie in den Schritten 1.16 1.17 und 2.14 vorbereitet werden.</li>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+suppression+of+interleukin-12+induction+after+macrophage+receptor+ligation.">Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation.</a> J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).</li><li>Riquelme, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-&#947;-induced+iNOS+expression+in+mouse+regulatory+macrophages+prolongs+allograft+survival+in+fully+immunocompetent+recipients.">IFN-&#947;-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients.</a> Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).</li><li>Vos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+macrophages+induced+by+infliximab+are+involved+in+healing+in+vivo+and+in+vitro.">Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro.</a> Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Gerber, J. S., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+lipopolysaccharide+toxicity+by+ligating+the+macrophage+Fc+gamma+receptors.">Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors.</a> J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).</li><li>Durandy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulins--understanding+properties+and+mechanisms.">Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms.</a> Clin Exp Immunol. 158, 2-13 (2009).</li><li>Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+uses+of+intravenous+immunoglobulin.">Clinical uses of intravenous immunoglobulin.</a> Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).</li><li>Murakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+preparation+prevents+the+production+of+pro-inflammatory+cytokines+by+modulating+NF&#954;B+and+MAPKs+pathways+in+the+human+monocytic+THP-1+cells+stimulated+with+procalcitonin.">Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NF&#954;B and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin.</a> Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Makrophagen Aktivierung Staaten spielen eine wichtige Rolle in beiden Gewebe Homöostase und Krankheit22. Makrophagen können unterschiedliche sowie überlappende Aktivierungsstatus abhängig von Cues in ihrer Mikroumgebung3haben. Sie haben unterschiedliche Rollen in allen Phasen der Entzündungsreaktion: Verteidigung gegen Krankheitserreger, Wunde heilen und Gewebe Restitution und haben auch eine ausgeprägte entzündungshemmende Aktivierungsstatus, die wichtig für das Au...

Makrophagen sind angeborene Immunzellen, die mehrere Rollen in der Immunantwort auf Infektionen oder Verletzungen zu spielen. Makrophagen sind verantwortlich für die Einleitung einer Immunantwort auf Infektionen oder Gewebe Schaden, die entzündliche Reaktion zu stoppen und die heilende Antwort1zu fördern. Beispiele für die drei am besten untersuchten Makrophagen Aktivierung Zustände sind: 1) Makrophagen, die Behandlung mit Interferon-Gamma (IFNγ) und bakterielle Lipopolysaccharid (LPS), M (IFNγ + LPS) bezeichnet, die dazu beitragen, die entzündliche Reaktion; (2) Makrophagen stimuliert mit Interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), die mit dem Heilungsprozess verbunden sind; (3) Makrophagen stimuliert mit Immunkomplexe (IC) und LPS, M (IC + LPS), die die Fähigkeit haben, die entzündliche Reaktion2,3deaktivieren. M (IC + LPS) unterscheiden sich von M(IL-4) Wundheilung Makrophagen und nicht ausdrücken, das Enzym Arginase (Arg-1) oder FIZZ14. Der beste Marker für diese entzündungshemmende Makrophagen ist ihre Zytokin-Produktion-5. Makrophagen haben mehrere Rollen bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit, aber auch zu entzündlichen Erkrankungen und Krebs3beitragen. Aus diesem Grund sind Makrophagen eine wichtige therapeutische Ziel für die Behandlung von einer Vielzahl von Krankheiten. Es ist wichtig zu untersuchen, die Auswirkungen von Antikörpern auf ihren Aktivierungsstatus zu Makrophagen-basierte Therapien für Krankheiten zu entwickeln.
Dieses Dokument konzentriert sich auf die Verwendung von murinen Knochenmark abgeleitet Makrophagen (BMDMs) und peritonealen Makrophagen, die Wirkung von Antikörpermedikamente auf Entzündungsreaktionen in Vitro und in Vivozu testen. Vor kurzem gab es mehrere Studien, die zeigen der Auswirkungen von Antikörpern auf Makrophagen Aktivierung6,7,8. Gemeinsam mit Immun-komplexe, die Antikörper mit einem Antigen und LPS, normalerweise Entzündungsreiz komplexiert sind aktiviert Makrophagen produzieren sehr hohes Maß an den Anti-inflammatorische Zytokine IL-10 und sehr niedrige Niveaus von Pro-inflammatorischen Zytokinen, Interleukin 12 (IL-12)9. In Addition, Infliximab, ein monoklonaler Antikörper gegen TNF zur Arbeit, zum Teil durch Induktion entzündungshemmende Makrophagen durch seine Fragment kristallisierbares (Fc) Region7festgestellt wurde. Wir haben berichtet, dass IVIg + LPS entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung, die ähnlich M (IC + LPS) induzieren, wobei Co stimulierte Makrophagen produzieren große Mengen von IL-10 und geringe Mengen an die Untereinheit Pro-inflammatorische Zytokin Interleukin-12 oder 23 p40 ( Il-12/23p40), Interleukin-6 (IL-6) und TNF-8. IVIg ist ein Medikament, bestehend aus polyclonal Antikörper vor allem IgG, die aus dem Blut von mehr als 1.000 Spender10gebündelt hat. Es wird zur Behandlung einer Vielzahl von Immunkrankheiten wie idiopathische thrombozytopenische Purpura und chronische demyelinisierende Polyneuropathie, aber sein Wirkmechanismus ist nicht vollständig verstanden11. Die Auswirkungen der Antikörpermedikamente basierend auf Makrophagen Aktivierung können beurteilt werden, hierin beschriebene Methoden verwenden.
Die Auswirkungen von spezifischen Biologics auf Makrophagen Aktivierung können in BMDMs und peritonealen Makrophagen getestet werden. Mit Hilfe dieser Makrophagen Quellen ermöglicht Bewertung von Primärzellen. Vorläufige Tests von Antikörpern auf kultivierten Primärzellen erfordert weniger Zeit und finanzielle Investition als andere Zeit- und kostenintensiv Krankheitsmodelle. Durch Einspritzen eines Medikaments in einem gesunden Maus in Vivo, und die Zellen zu isolieren und ex Vivozu analysieren, kann man feststellen, ob Studien gerechtfertigt sind, um zu beurteilen, ob die Behandlung mit Biologics Makrophagen Aktivierung in Krankheitsmodellen betrifft.
Unsere Techniken bieten nur wenige Studien die Wirkung von biologischen Therapien auf Makrophagen Aktivierung in Vitro und in Vivo direkt testen einen Vorteil gegenüber alternativen Techniken. Aktuelle Techniken beinhalten Tests biologischen Drogenwirkungen auf gemischte Zelle Bevölkerungen in Vitro, wie z. B. die Wirkung von Infliximab in einem gemischten Lymphozyten Reaktion (MLR) oder IVIg auf menschliche Makrophagen in peripheren mononukleären Blutzellen, wo die Wirkung kann nicht auf eine bestimmte Zelle Typ7,12zurückführen. Mit BMDMs und peritonealen Makrophagen ist vorteilhaft gegenüber der Verwendung von Zelllinien, wie RAW264.7 Zellen, die nicht die Pro-inflammatorische Zytokine produzieren, IL-12, als Reaktion auf LPS8,13. Testen die Wirkung von einem Antikörper-basierten Medikament auf Makrophagen Antworten ex Vivo hat Vorteile, weil direkt auf Makrophagen Cytokine Reaktionen zurückführen lassen, anstatt herleiten von Makrophagen Antworten durch die Messung der Serumspiegel Zytokin14 . BMDMs und peritonealen Makrophagen können abgeleitet und von genetisch veränderten Mäusen zu bestimmen, die spezifische Rolle eines Proteins in entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung isoliert. Wir haben z. B. Il10 mangelhaft(- / -) BMDMs zu zeigen, dass IVIg-induzierte Verringerung der Produktion von Pro-inflammatorischen Zytokinen IL-108teilweise abhängig ist. Ein Medikament Wirkmechanismus untersucht werden kann verwenden westliche Beflecken, wo die Rolle der spezifischen Proteine und Signalisierung Ereignisse ermittelt werden kann. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) kann durchgeführt werden, auf BMDMs oder peritonealen Makrophagen Muster der Genexpression zu zeigen, die durch Antikörper Aktivierung entstehen. Krankheitsmodelle bei Mäusen bieten Informationen über die mögliche Wirksamkeit von Antikörper-basierten biologischen Therapien in Modellen für Erkrankungen wie entzündliche Darm-Krankheit, rheumatoide Arthritis und Krebs15,16, 17. jedoch die hier beschriebenen Techniken informieren über den Wirkmechanismus von diese Biologics durch die Bestimmung, ob sie entzündungshemmende Makrophagen-Aktivität induzieren.

<table><tbody><tr><td>Iscove&amp;rsquo;s modified Dulbecco&amp;rsquo;s medium (IMDM)</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF)</td><td>Stemcell technologies</td><td>78059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>88640</td><td></td></tr><tr><td>1X red blood cell lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation buffer</td><td>Life technologies</td><td>13150016</td><td>Enzyme-Free, Hanks&#039;s-based, EDTA</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>L 4516</td><td>From E. coli 0127:B8</td></tr><tr><td>IVIg (Gammunex)</td><td>Grifols</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Gammagard liquid)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Octagam)</td><td>Octapharma</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>mouse IL-10 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555252</td><td></td></tr><tr><td>mouse IL-12/23p40 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555165</td><td></td></tr><tr><td>anti-Erk1/2 antibody</td><td>Cell signalling technology</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>anti-pp38 antibody</td><td>Cell signalling technology</td><td>9211</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Fitzgerald industries</td><td>10R-G109A</td><td></td></tr><tr><td>26 g needle</td><td>BD biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>BD biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>BD biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tube (1.7 mL)</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;tissue culture treated flask</td><td>BD biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD biosciences</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>fine tip, dissecting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td>Delicate, 4 &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;/&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&quot;</td></tr><tr><td>Brightfield microscope</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td>Inverted phase contrast</td></tr><tr><td>Scale&amp;nbsp;</td><td>Mettler&amp;nbsp;</td><td>PE 3000</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of antibody-based drugs effects on murine bone marrow and peritoneal macrophage activation

Makrophagen sind phagocytic angeborene Immunzellen, die Immunantworten auf Krankheitserreger zu initiieren und zu Heilung und Gewebe Wiedergutmachung beitragen. Makrophagen sind ebenso wichtig für die Entzündungsreaktionen ausschalten. Wir haben gezeigt, dass hohe Mengen an die Anti-inflammatorische Zytokine, Interleukin 10 (IL-10) und niedrige Niveaus von Pro-inflammatorischen Zytokinen als Reaktion auf bakteriellen Lipopolysacchariden (Makrophagen stimuliert mit intravenösem Immunglobulin (IVIg produzieren) LPS). IVIg ist ein polyvalenter Antikörper, vor allem Immunglobulin Gs (IgGs), aus dem Plasma von mehr als 1.000 Blutspendern gebündelt. Es dient der Ergänzung Antikörper bei Patienten mit Immunschwäche oder Immunantworten bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen Bedingungen zu unterdrücken. Infliximab, eine therapeutische anti-Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF) Antikörper, nachweislich auch Makrophagen produzieren IL-10 in Reaktion auf entzündliche Reize zu aktivieren. IVIg und andere Antikörper-basierten Biologics kann getestet werden, um deren Auswirkungen auf Makrophagen Aktivierung zu bestimmen. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung, Stimulation und Bewertung der murinen Knochenmark Makrophagen durch Antikörper in Vitro aktiviert und murinen peritonealen Makrophagen aktiviert mit Antikörpern in Vivo. Zu guter Letzt zeigen wir die Verwendung von westliche Beflecken, um den Beitrag der bestimmte Zelle Signalwege entzündungshemmende Makrophagen-Aktivität zu bestimmen. Diese Protokolle können mit genetisch veränderten Mäusen, verwendet werden, um festzustellen, die Wirkung von bestimmten benutzt auf entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung. Diese Techniken können auch verwendet werden, um festzustellen, ob bestimmte Biologics wirken können, indem Makrophagen auf eine IL-10 produzierende entzündungshemmende Aktivierungsstatus, die Entzündungsreaktionen in Vivoreduziert. Dies kann geben Auskunft über die Rolle der Makrophagen Aktivierung in die Wirksamkeit von Biologika während Krankheitsmodelle in Mäusen und geben Einblick in ein potenzieller neuer Wirkmechanismus im Menschen. Umgekehrt kann dies gegen den Einsatz von spezifischen Antikörpern basierende Biologics Vorsicht zur Behandlung von Infektionskrankheiten, insbesondere dann, wenn Makrophagen eine wichtige Rolle in der Wirt Verteidigung gegen diese Infektion spielen.

Murine Knochen Knochenmark abgeleitet Makrophagen können aus Vorstufen der blutbildenden Zellen im Knochenmark Aspiraten kultiviert werden. Knochenmark Aspiraten gebündelt in der Regel vom Oberschenkelknochen und Gebeinen der Mausklick C57BL/6 Ertrag 107 Knochenmark abgeleitet Makrophagen, so dass sie eine günstige Quelle von Makrophagen für Experimente. BMDMs kann verwendet werden, basieren Medikament Antikörperantworten als mit einem Entzündungsreiz in Vitroher...

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Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Antikörper-basierte Medikamente haben die Behandlung von entzündlichen Erkrankungen revolutioniert. Zusätzlich zu den direkten Auswirkungen auf bestimmte Ziele, können Antikörper Makrophagen entzündungshemmende zu aktivieren. Dieses Protokoll beschreibt wie entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung bewertet in vitro mit Maus Knochenmark Makrophagen, und in-vivo mit peritonealen Makrophagen werden kann.

Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

assessment-antibody-based-drugs-effects-on-murine-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.2K Aufrufe.  University of British Columbia. Antikörper-basierte Medikamente haben die Behandlung von entzündlichen Erkrankungen revolutioniert. Zusätzlich zu den direkten Auswirkungen auf bestimmte Ziele, können Antikörper Makrophagen entzündungshemmende zu aktivieren. Dieses Protokoll beschreibt wie entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung bewertet in vitro mit Maus Knochenmark Makrophagen, und in-vivo mit peritonealen Makrophagen werden kann.

Serie: Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Forschung

Biotechnik

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Immunologie und Infektion

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by osteoclasts in response to different stimuli. Osteoclast precursors differentiate into multinuclear osteoclasts in response to macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL). Under pathologic conditions, the cytokine profile is different and involves a mixture of inflammatory cytokines. Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) is one of the most important cytokines as it is found in large amounts in areas involved with inflammatory osteolysis. The purpose of this protocol is to provide a method by which murine bone marrow is isolated to generate osteoclasts through induction with M-CSF and either RANKL or TNF-&#945; which will be subsequently inhibited by increasing doses of anti-c-fms antibody, the receptor for M-CSF. This experiment highlights the therapeutic value of anti-c-fms antibody in diseases of inflammatory bone resorption.

This protocol includes dissection of murine long bones and bone marrow isolation, to generate bone marrow macrophages and produce osteoclasts using macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL) or tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) and their arrest by anti-c-fms antibody, M-CSF receptor.

Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung und Verbreitung von Osteoklasten-Vorläufer In-vitro-

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Phagozytäre Assay-Bewertung von neonatalen Makrophagen aus dem Knochenmark 

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging and time-consuming, yet for some models, it is translationally relevant and necessary. This protocol describes an efficient and straightforward method for preparing bone marrow cells from 7-9-day-old pups. These cells can then be further isolated or differentiated into specific cell types of interest. Macrophages are crucial immune cells that play a major role in inflammation and infection. During development, neonatal macrophages contribute significantly to tissue remodeling. Moreover, the phenotype and functions of neonatal macrophages differ from those of their adult counterparts. This protocol also outlines the differentiation of neonatal macrophages from the isolated bone marrow cells in the presence of L929-conditioned medium. Surface markers for differentiated neonatal macrophages were assessed using flow cytometric analysis. To demonstrate functionality, the phagocytic efficiency was also tested using pH-sensitive dye-conjugated Escherichia coli.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung einer reproduzierbaren Methode zur Isolierung von Makrophagen aus dem Knochenmark von neugeborenen Mäusen zur Förderung der Immunantwort im frühen Leben

This protocol describes a non-enzymatic and straightforward method for isolating 7-9-day-old neonatal mouse bone marrow cells and generating differentiated macrophages using a supernatant of L929 cells as a source of granulocyte colony-stimulating factor (M-CSF). The bone marrow-derived macrophages were further analyzed for surface antigens F4/80, CD206, CD11b, and functional competency.

Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...

Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, and foreign pathogens. The phagocytic capacity of monocytes versus macrophages is a concept that is not well understood. Here, we aim to examine a difference in the phagocytosis of monocytes versus macrophages, specifically M1/M2 macrophages, against various opsonized red cells using a modified and updated version of the established monocyte monolayer assay (MMA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from donor buffy coats. Using purified monocytes, inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophages were produced by in vitro culture and polarization. M1/M2 cells were harvested and used in an MMA-like assay, which we refer to as the M-MA, to decipher clinically significant phagocytosis of various red cell antibodies. A phagocytic index (PI) &#62; 5 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of monocytes. A phagocytic index (PI) &#62; 12 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of M1/M2 macrophages. M2 macrophages demonstrate an increased ability to phagocytose opsonized RBCs compared to monocytes and M1s. The same weak antibody (anti-S) yields significant phagocytosis with only M2 macrophages (PI=43) but not M1s (PI=2) or monocytes (PI=0), and this was demonstrated repeatedly using various antibodies. The use of M2 macrophages instead of monocytes may allow for more accurate results as these cells are more phagocytic, offering further clinical relevance to the assay. Further studies with different antibodies to red blood cells, including validation of the monocyte-macrophage assay (M-MA) with antibodies having known clinical significance, may show the M-MA&#160;more useful to help predict clinically significant red cell alloantibodies and transfusion reactions. This method will advance the field of transfusion medicine and immunology.

We have developed enhancements and updated methods for the existing monocyte-monolayer assay (MMA), in which macrophages are used to help better predict the clinical relevance of red cell alloantibodies in transfusion medicine and immunology. This assay is named the monocyte-macrophage assay (M-MA).

Vorhersage der Bedeutung von Antikörpern roter Blutkörperchen mit dem Monozyten-Makrophagen-Assay

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, ...

Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung und Verbreitung von Osteoklasten-Vorläufer In-vitro-

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Vorhersage der Bedeutung von Antikörpern roter Blutkörperchen mit dem Monozyten-Makrophagen-Assay